식물 세포에 유전자 전달을 위한 아그로박테리움 배양 준비

오염을 방지하고 플라스미드 보존을 보장하기 위해 두 가지 항생제를 보충한 배양지를 배양한 Agrobacterium tumefaciens 배양부터 시작하세요.

박테리아는 관심 유전자와 항생제 내성 유전자를 가진 식물 발현 벡터를 포함하고 있습니다.

또한 관심 유전자를 식물 세포에 전달하는 데 필요한 병원성 유전자 영역을 가진 보조 플라스미드도 포함하고 있습니다.

식물에서 유래한 신호 분자인 아세토시린곤과 항생제가 보충된 완충 배지를 담은 튜브에 일부를 옮깁니다. 흔들면서 부양하세요.

아세토시링온은 세포 내로 확산되어 신호 전달 경로를 유도하고, 관심 유전자 전달에 필요한 병원성 유전자의 발현을 활성화합니다.

배양물을 옮기고, 원심분리기로 박테리아를 채취한 뒤 상청액을 버리세요.

소금 완충제를 넣고 세포를 반복해서 세척하여 첨가된 항생제를 제거하세요.

박테리아를 완충제에 아세토시린곤으로 재현탁시키고, 병원성 유전자 발현을 유지하기 위해 흔들리지 않고 배양합니다.

효율적인 변화를 위해 즉시 문화를 활용하세요.

팁을 사용해 LB 플레이트에서 양성 콜로니를 골라내고, 5밀리리터의 LB 배지에 50마이크로그램/밀리리터의 카나마이신과 50마이크로그램/밀리리터의 리팜피신이 보정된 유리관에 세포를 접종합니다. 세포를 30도 섭씨에서 200RPM으로 흔들며 24시간에서 48시간 동안 배양하세요.

100마이크로리터의 배양물을 동일한 항생제, pH 5.6에서 10밀리몰라 MES, 20마이크로몰라 AS를 보충한 LB 배지 5밀리리터에 옮깁니다. 박테리아를 30도 섭씨에서 200RPM으로 흔들어 16시간에서 20시간 동안 배양하세요. 세포를 4,000g 원 심분리기로 10분간 가열하세요. 상원액은 버리고 펠릿을 10밀리몰라 염화마그네슘 버퍼 2밀리리터에 재현탁합니다.

항생제가 완전히 제거되도록 세척을 반복하세요. 600나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 아그로박테리움 배양의 밀도를 결정합니다. 10밀리몰라 염화마그네슘 버퍼로 세포 배양을 OD₆₀₀ 1.5에서 2.0 사이로 조절합니다.

최종 현탁 배양액에 pH 5.6의 10밀리몰라 MES와 150 마이크로몰라 AS를 첨가하고, 세포를 흔들지 않고 최소 3시간 이상 실온에서 배양합니다.