형광 표지 박테리아의 염색체 분리 타임랩스 영상

금속 프레임 위에 영양이 풍부한 아가로스 패드를 깔고, 형광 표지된 염색체 기원과 형광 미세구체를 나타내는 박테리아를 포함합니다.

아가로스 패드는 박테리아의 부착과 이동성을 지원하며, 형광 미세구는 염색체 분리를 추적하는 기준 역할을 합니다.

역시야 현미경의 예열된 인큐베이션 챔버에서 대물렌즈에 침수 오일을 첨가합니다.

샘플을 렌즈 위에 올려놓고, 여러 박테리아와 최소 하나의 형광 미세구가 있는 영역에 초점을 맞추세요.

타임랩스 영상을 시작하여 위상 차이 및 형광 이미지를 모두 촬영합니다.

형광 태그가 부착된 복제 기점은 세포 한쪽 끝 근처에 밝은 군집으로 나타납니다.

분할 과정에서 기원이 중복되고; 한 클러스터는 원래 끝에 남아 있고, 다른 클러스터는 새로 형성된 세포 끝으로 이동합니다.

이 구조는 여러 분열에 걸친 염색체 분리 추적을 가능하게 하며, 숙주 상호작용 중 병원성 종을 포함한 다른 박테리아의 유사한 동적 과정을 시각화하는 데 적응할 수 있습니다.

타임랩스 현미경을 수행하려면 현미경을 켜고 현미경 제어 소프트웨어를 시작하세요. 올바른 대물렌즈와 올바른 거울 및 필터를 선택하여 위상 대비 이미지뿐만 아니라 녹색 형광, 적색 형광, 노란색 형광 단백질의 이미지를 획득할 수 있습니다. 고품질 침수 오일 한 방울을 대물렌즈와 32도 섭씨에서 미리 인큐베이팅한 샘플 바닥에 떨어뜨립니다.

구멍 쪽이 대물렌즈 쪽을 향하게 하여 금속 프레임을 현미경 스테이지에 올려놓고, 샘플을 스테이지 홀더에 단단히 고정합니다. 단계를 Z 방향으로 목표물에 더 가깝게 이동시켜 셀에 집중하세요. 대물렌즈와 샘플의 오일이 접촉하면, 스테이지를 X/Y 방향으로 이동시킵니다.

Metamorph 소프트웨어로 전환하고 획득 도구를 열어보세요. 설정 드롭다운에서 위상 대비를 선택하고 노출 시간을 100밀리초로 설정하세요. 라이브 표시를 클릭하고, 셀을 초점면으로 가져오고, X/Y 방향으로 스테이지를 이동시켜 시야에 여러 개의 단일 셀이 보일 때까지 진행하세요.

나중에 획득한 이미지를 정렬할 수 있도록 적어도 하나의 형광 미세구가 시야 영역에 있는지 확인하세요. 다음으로, 현미경 제어 소프트웨어의 다차원 획득 마법사를 열어 타임랩스 실험을 설정하세요. 이 실험은 필요시 여러 파장과 스테이지 위치에서 현미경이 이미지를 획득할 수 있도록 합니다.

메인 탭에서 타임랩스와 다중 파장을 활성화하세요. 창 왼쪽에 추가 탭이 나타납니다. 저장 탭을 클릭하고 디렉터리를 선택하여 컴퓨터 하드 드라이브의 빈 폴더를 선택하여 획득한 이미지를 저장한 후, 연속된 데이터셋이 이전 데이터셋을 덮어쓰지 않도록 '파일 존재 시 증분 기본 이름 활성화'를 활성화하세요. 실험 이름과 날짜, 균주 이름 또는 실험 제목을 붙이세요.

타임랩스 탭을 클릭해 타임랩스 매개변수를 조정하고, 시간 간격을 20분으로 설정하고 지속 시간을 24시간으로 설정하세요. 시간대의 수는 자동으로 변경됩니다. 이제 '파장' 탭을 클릭하세요.

각 시점에서 각 이미지에 대해 획득할 파장 수를 변경하여 선택하세요. 각 파장별로 별도의 하드웨어 암기 AF 위치를 허용하는 것을 선택하세요. 맨 위에서 First Wavelength 탭을 클릭하세요.

조명 드롭다운 목록에서 위상 대비를 선택하세요. 노출은 100밀리초를 선택하고, 획득 드롭다운에서 모든 시간 지점을 선택하세요. 드롭다운 목록에서 '절대 안 된다'를 선택해 자동 노출을 비활성화하고, 드롭다운 목록에서 자동 초점을 선택하세요.

다음 매개변수를 사용하여 모든 파장에 대해 노출을 설정하세요. 그 후 여러 스테이지 위치에서 이미지를 획득하려면 메인 탭에서 멀티플 스테이지 포지션을 활성화하세요. 스테이지 탭을 클릭하고 라이브 버튼을 클릭하면 시야를 볼 수 있습니다.

스테이지를 X/Y 방향으로 이동시켜 ROI가 시야에 들어올 때까지 진행하세요. 스테이지 탭에서 X와 Y 좌표를 플러스 기호를 클릭해 저장하세요. 스테이지를 X/Y 방향으로 다시 이동시켜 새로운 ROI를 찾고, 플러스 기호를 눌러 좌표를 다시 저장하세요.

원하는 지역이 저장될 때까지 계속 진행합니다. 저장된 X-및 Y 위치를 클릭해 셀이 초점이 맞는지 다시 확인하고, 실험 내내 저장된 Z-위치를 일정하게 유지하기 위해 AFC 홀드를 눌러 하드웨어 자동 초점을 시작하세요. 현미경 제어 소프트웨어의 다차원 획득 마법사에서 타임랩스 녹화를 시작하려면 획득을 클릭하세요.

타임랩스 녹화의 첫 몇 시간 지점 후에도 셀이 여전히 초점이 맞는지 확인하여 이미지 품질을 극대화하고 필요하다면 다시 초점을 맞추세요.