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미생물학
0 조회수 • 3:47 분 • February 26th, 2026
먼저 바이오필름 형성 박테리아의 부탁액을 담은 유리 바닥 마이크로접시 두 개로 시작합니다.
치료 접시에는 활성 신호 교란 효소가 포함되어 있고, 대조군에는 비활성화된 효소가 포함되어 있습니다.
접시를 덮고 박테리아가 마이크로디시 표면에 부착할 수 있도록 배양하세요.
비부착 세포를 세척한 후 효소가 포함된 신선한 배지를 도입해 배양합니다.
대조 접시에서 박테리아는 신호 분자를 통해 소통하며 세포외 고합물질(EPS)을 생성하여 바이오필름을 형성합니다.
활성 효소는 신호 분자를 분해하여 그 기능을 방해하고 바이오필름 형성을 감소시킵니다.
새로운 배지를 보충하고 효소의 바이오필름 파괴 효과를 강화하기 위해 추가 배양합니다.
배지를 제거하고 형광 표지된 렉틴을 추가한 뒤, 렉틴이 EPS에 결합하도록 배양합니다.
세척해서 결합되지 않은 렉틴을 제거하세요.
바이오필름 구조를 보존하기 위해 고정액을 넣고 배양한 후 접시를 헹구세요.
효소 매개 바이오필름 형성 억제 효과를 평가하기 위해 공초점 현미경 이미지를 획득합니다.
공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 수행하기 위해, 30도 섭씨의 진동 인큐베이터에서 16시간 동안 LB 내 5밀리리터 배양 A. baumannii S1을 배양합니다. A. baumannii S1의 배양을 OD600 0.8로 조정하세요.
그 다음 정제된 GKL 효소 1.2밀리리터당 1.2밀리리터가 포함된 신선한 LB를 사용해 배양액을 1에서 100으로 희석한 후, 35밀리리터 유리 바닥 마이크로디시에 1밀리리터를 첨가합니다. 마이크로디시를 뚜껑으로 덮고 10리터 플라스틱 용기에 넣은 뒤 밀봉한 후 30도 섭씨에서 3시간 동안 부화시킵니다. 배지를 부드럽게 제거한 후, 30마이크로리터의 정제된 GKL 효소가 포함된 신선 배지 1밀리리터를 추가하고, 섭씨 30도에서 21시간 더 배양합니다.
배지를 부드럽게 두 번째로 제거한 후 신선한 배지에 GKL 효소 1밀리리터를 추가로 넣으세요. 30도에서 24시간 배양하세요. 배양 후에는 배양지를 부드럽게 제거하고 HBSS에 용해된 알렉사 플루오르 488 공액 밀 배아 응집 500마이크로리터 500 마이크로리터를 첨가합니다.
마이크로디시를 37도 섭씨에서 30분간 배양하여 바이오필름을 염색하세요. 바이오필름을 고정하기 위해 HBSS에 용해된 3.7% 포름알데히드 500마이크로리터를 추가하고 37도 섭씨에서 30분간 배양합니다. 마이크로디시를 한 번 세척할 때 HBSS 2밀리리터를 사용한 후, 용액을 완전히 제거하세요.
CLSM 영상 촬영 전에 4도 섭씨 온도에서 어두운 환경에서 보관하세요. CLSM 영상 및 분석을 위해 63 X 대물렌즈를 사용하여 각 스택당 0.21 마이크론 간격으로 97개의 스택을 생성합니다.