감염된 쥐 대식세포에서 채취한 리스테리아 모노사이토제네스 에서 RNA 추출

리스테리아 모노사이토제네가 들어있는 필터 페이퍼가 든 튜브를 준비하세요.이 박테리아들은 감염된 쥐 대식세포에서 채취됩니다.

RNase 억제제가 포함된 완충제를 추가하여 RNA 분해를 막고, 여러 각도로 튜브를 소용돌이로 돌려 박테리아를 떼어내세요.

원심분리하여 현탁액을 페놀-클로로포름-세제 혼합물이 담긴 튜브로 옮깁니다.

소용돌이 및 배양하여 박테리아 막을 파괴하고 단백질을 비활성화하며 박테리아를 용해하여 세포 내 성분을 방출합니다.

원심분리기는 RNA가 풍부한 수상을 다른 성분들과 분리합니다.

RNA를 채취하여 아세트산나트륨과 에탄올이 들어있는 튜브로 옮깁니다.

소용돌이를 만들어 저온에서 부화시킵니다.

아세트산나트륨은 RNA의 음전하를 중화시키고, 에탄올과 냉온 조건은 RNA 침전을 촉진합니다.

원심분리기로 RNA를 펠릿으로 처리합니다.

상환액을 제거하고 펠릿을 차가운 에탄올로 세척하세요.

다시 원심분리기로 돌려 상청액을 제거하고 자연 건조한 후 RNase 무첨가 물을 넣으세요.

RNA를 저장해 추가 분석을 하세요.

필터가 들어 있는 튜브는 얼음 위에 해동해 차갑게 유지하세요. 각 튜브에 650마이크로리터의 차가운 아세테이트 EDTA 또는 AE 버퍼를 추가하세요.

가능한 한 빠르게 작업하며, 필터 튜브를 격렬하게 소용돌이로 돌려 필터가 튜브 주변으로 휘젓고 버퍼가 필터를 완전히 세척하도록 합니다. 필터에서 박테리아를 완전히 씻어내려면 튜브와 소용돌이를 뒤집어야 할 수도 있습니다. 이 절차에서 가장 중요한 단계는 박테리아가 필터에서 효율적으로 제거되도록 하는 것입니다.

이를 위해 튜브를 여러 위치에서 여러 번 소용돌이로 반복합니다. 나머지 샘플들이 모두 소용돌이가 되면, 잠시 튜브를 회전시켜 내려가세요. 다음으로, 각 튜브에서 SDS와 페놀 클로로포름 튜브로 박테리아 포함 버퍼를 옮긴 후, 튜브들을 다중 튜브 소용돌이 장치에 넣고 10분간 최대 속도로 소용돌이 과정을 진행합니다.

그 후 튜브를 65도 섭씨의 열덩이에 10분간 보관한 후 최대 속도로 5분간 회전시킵니다. 수층을 3몰 아세테이트 나트륨 40마이크로리터와 100% 에탄올 1밀리리터가 들어있는 신선한 튜브로 옮깁니다. 샘플을 충분히 소용돌이로 돌린 후, 튜브를 영하 80도에서 1시간 또는 영하 20도에서 하룻밤 배양합니다.

그 후 샘플을 원심분리한 후 각 튜브에서 에탄올을 조심스럽게 흡입한 후 각 샘플에 500마이크로리터의 차가운 70% 에탄올을 첨가합니다. 소용돌이 후 샘플을