재조합 RBD 기반 SARS 백신에 대한 프로토콜 : 단백질 준비, 동물 예방 접종 및 중화 감지

본 절차에서는 SARS COV RBD 단백질을 발현하는 재조합 백신을 제조하고, SARS 유사 바이러스에 대한 중화 활성을 유도하는 능력을 평가합니다. 먼저, 형질전환된 2 9 3 T 세포의 배양 상층액으로부터 RBD 단백질을 정제하여 발현시킵니다. 그 후, 정제된 단백질을 사용하여 면역화를 진행합니다.

면역 혈청의 중화 능력을 정량화하기 위해, 면역 후 다양한 시점에서 백신 접종 쥐로부터 쥐와 혈청을 수집합니다. 가성 바이러스 중화 분석을 수행하며, 재조합으로 생성된 루시퍼레이스 발현 SARS 가성 바이러스를 제작하여 희석된 쥐 혈청과 함께 배양합니다. 그 다음, 중화된 바이러스가 SARS 공동 수용체 ACE를 발현하는 세포를 감염시키는 능력을 감염된 세포 내의 상대적 루시퍼레이스 활성을 측정함으로써 평가합니다.

그 다음 50% 중화 항체 역가를 계산할 수 있습니다. 제 이름은 tu입니다. 저는 현재 실험실의 우편 담당자입니다.

생바이러스 기반 중화 분석법과 같은 기존 기술에 비해 가성 바이러스 중화 분석법의 주요 장점은 이 기술이 상대적으로 안전하다는 것입니다. 감염성 SARS 바이러스가 필요하지 않으며, 생물안전 3등급(BSL-3) 실험실이 아닌 곳에서도 수행할 수 있습니다. 시연 절차를 보여줄 제 이름은 Laying Due이며, Due는 제 실험실의 연구 후 박사 과정 연구원으로 SARS 및 인플루엔자(influenza)와 같은 신종 감염병에 대응하는 백신 개발에 집중해 왔습니다. 멸균된 2X HBSS 버퍼 pH 7.2, 2.5 M calcium chloride, 그리고 RBD 플라스미드 분주액을 실온에서 해동하십시오.

용액이 해동되면, 2 XHBS 2 mL를 50 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 15 mL 튜브에 calcium chloride 200 µL와 RBD plasmid 40 µg을 혼합합니다. 멸균된 5 mL 피펫을 사용하여 실온의 멸균 증류수로 최종 부피를 2 mL로 맞춥니다. 혼합물을 일정하고 완만하게 보텍싱하면서, plasmid 용액을 2 XHBS에 한 방울씩 천천히 첨가합니다.

높은 트랜스펙션 효율을 위해 적절한 농도의 침전물을 얻으려면, 보텍싱을 천천히 지속적으로 유지하는 것이 매우 중요합니다. 실온에서 20분 동안 보관하십시오. 이 배양 단계 후에, 혼합물을 50~70% 합류된 2 9 3 T 세포가 담긴 플라스크에 한 방울씩 첨가하십시오.

40 milliliters의 세포 배양 배지 부피 내에서 트랜스펙션 용액을 균일하게 분산시키는 것이 중요합니다. 트랜스펙션 믹스를 첨가한 직후 배지를 혼합하십시오. 세포를 37 °C, 5% carbon dioxide 인큐베이터에 넣으십시오.

8~10시간 동안 배양한 후, 완전 세포 배지를 제거하고 50 milliliters의 신선한 serum free optimum one 배지로 교체하여 이후의 단백질 정제 과정에서 혈청의 간섭을 방지한 다음, 세포를 37 °C 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 2일 후, 발현된 RBD 단백질이 포함된 상층액을 수집하고 6,000 RPM에서 15분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거합니다. 세포가 펠렛 형태로 가라앉으면, 상층액을 새 튜브로 옮기고 protease inhibitor cocktail을 첨가합니다.

단백질 분해를 방지하기 위해, 제조사의 지침에 따라 nickel NTA super flow를 사용하여 수확한 상층액으로부터 RBD 재조합 단백질을 정제합니다. 250 millimolar ole가 함유된 완충액으로 RBD 단백질을 용출합니다. 다음으로, Emon Ultra 15 튜브를 사용하여 4°C에서 3000 RPM으로 약 15분 동안 원심분리하여 OLE가 포함된 정제 단백질을 농축합니다. 통과액은 폐기합니다.

RBD 농축 튜브에 PBS를 추가하고 4 °C, 3000 RPM에서 20분 동안 다시 원심 분리합니다. 세척 과정을 2회 반복합니다. 정제된 단백질이 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 이제 단백질을 PBS에 녹인 후, 깨끗한 1.5 milliliter EPR 튜브에 피펫으로 옮깁니다.

마지막으로, PBS를 공시료(blank)로 사용하여 NanoDrop으로 정제된 단백질의 농도를 측정하고 샘플을 -80 °C에서 보관하십시오. 먼저, Sigma adjuvant system 한 바이알에 멸균 PBS 1 mL를 첨가합니다. 40~45 °C의 항온수조에서 예열하고, 바이알을 2~3분 동안 충분히 볼텍싱하십시오.

다음으로, 1.5 mL 에핑거(eppendorf) 튜브에 단백질 면역증강제 에멀젼을 준비합니다. PBS로 희석하여 해동한 정제 단백질의 원하는 양을 동일한 부피의 면역증강제 시스템과 혼합하고 2~3분 동안 격렬하게 볼텍싱(vortex)합니다. 또한 면역증강제와 PBS만을 혼합하여 대조군 에멀젼을 준비합니다. 피하 투여합니다.

4~6주령의 BC 마우스 최소 5마리에게 회당 20 µg의 단백질이 포함된 초기 면역 혼합물 또는 대조군 에멀젼 200 µL를 피하 주사합니다. 초기 접종 후 21일째에 최종 부피 200 µL 내에 10 µg의 단백질이 포함된 부스터 용량을 주사합니다. 초기 면역 전과 각 백신 접종 10일 후에 각 마우스로부터 혈액 샘플을 수집하고, 분리한 혈청을 가열 후 -20 °C에서 보관합니다.

트랜스펙션 16시간 전에 56°C에서 30분 동안 보체(complement)를 불활성화합니다. 293T 세포를 100mm 조직 배양 접시에 접시당 2 million cells의 밀도로 플레이팅합니다. 앞서 설명한 대로 트랜스펙션 시약을 준비하고, SARS-CoV S 단백질을 인코딩하는 플라스미드와 ENV 결손 루시퍼레이즈 발현 HIV-1 게놈을 인코딩하는 플라스미드를 세포에 공동 트랜스펙션(cotransfect)합니다. 트랜스펙션 8~10시간 후에 수행합니다.

배지를 10% 혈청이 포함된 신선한 DMEM 배지 10 milliliters로 교체한 후 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 이틀 후, SARS 유사 바이러스가 포함된 상층액을 수확합니다. 상층액을 0.45 micron 시린지 필터로 여과하여 세포 잔해를 제거하고 바이러스를 분주합니다.

즉시 사용하거나 멀티채널 파이펫 플레이트를 사용하여 -80°C에서 냉동 보관하십시오. 96웰 조직 배양 플레이트에 SARS-CoV 수용체 ACE2를 발현하는 2 9 3 T 세포를 웰당 100 µL 당 10,000 cells의 농도로 분주하고, 37°C에서 16시간 동안 배양합니다. 별도의 96웰 플레이트를 사용하여 재조합 루시퍼레이즈를 발현하는 SARS 유사 바이러스를 타이트레이션하고, 첫 번째 플레이트의 A행과 B행에서 중화 분석에 적합한 바이러스 농도를 결정하십시오.

각 웰에 10% F-B-S-D-M-E-M 150 µL를 분주합니다. 다음으로, A1 및 B1 열에 희석하지 않은 바이러스 150 µL를 첨가하고, 1열 웰에서 다음 열 웰로 150 µL씩 옮기는 과정을 11열까지 반복하여 2배 연속 희석을 중복으로 수행합니다. 마지막 150 µL는 폐기하며, 12열에는 바이러스를 첨가하지 않습니다.

계열 희석을 수행하고 ACE 2 93 T 세포를 16시간 동안 배양한 후, 바이러스 플레이트의 각 웰에서 100 µL를 세포가 포함된 플레이트의 해당 웰로 옮겨 세포를 감염시킵니다. 바이러스가 세포를 감염시킬 수 있도록 세포를 37 °C에서 이틀 동안 배양합니다. ultra 3 84 루미노미터로 플레이트를 측정하여 각 웰의 감염 수준을 결정합니다.

감염량은 루시퍼레이스(luciferase) 활성 강도에 비례합니다. 12번 열의 세포만 있는 배경 RLU보다 상대적 루시퍼레이스 단위가 약 1,000배 더 높은 바이러스 농도를 중화 시험에 사용합니다. 먼저 별도의 96-웰 플레이트에 중화 시험을 준비하며, 멀티채널 피펫을 사용하여 1번 열의 웰에는 10% F-B-S-D-M-E-M 150 µL를 넣고, 나머지 열의 웰에는 120 µL를 넣습니다.

다음으로, 테스트할 각 마우스 혈청 3 µL를 1열의 중복 웰(duplicate wells)에 첨가합니다. 본 예시에서는 처음 두 웰에 RBD 면역 마우스의 50배 희석 혈청을 넣었습니다. 다음 두 웰에는 두 번째 RBD 면역 마우스의 혈청을, 마지막 네 웰에는 PBS 면역 대조군 동물 두 마리의 혈청을 넣었습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 1열의 모든 웰에서 2열의 웰로 30 µL씩 옮기는 과정을 11열까지 반복함으로써 혈청을 5배 연속 희석합니다.

남은 30 µL를 버리고 12번 컬럼의 웰들은 혈청 없이 둡니다. 다음으로, 각 웰에 희석된 SARS 유사 바이러스를 120 µL씩 첨가합니다. 마우스 혈청 내의 항 RBD 항체가 SARS 유사 바이러스와 결합하여 이를 중화시킬 수 있도록 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.

이 배양 단계 후에, 각 웰에서 중화된 바이러스 100 µL를 ACE2를 발현하는 293T 세포가 들어 있는 96-웰 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 세포가 감염될 수 있도록 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 세포 감염이 완료되면, 멀티채널 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 웰당 100 µL의 신선한 배지로 교체합니다.

37°C에서 72시간 배양 후 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 다시 한번 멀티채널 피펫을 사용하여 상청액을 제거합니다. 이 시점에서 마우스 혈청에 의해 중화되지 않은 슈도바이러스는 세포를 감염시켰을 것입니다. 웰당 60 µL의 루시퍼레이스 세포 배양 용해 시약을 첨가합니다.

플레이트를 상온의 쉐이커에 두고 1~2시간 동안 세포를 용해시킵니다. 세포 용해가 완료되면, 세포 용해액 50 µL를 96-웰 루미노미터 플레이트로 옮기고 웰당 50 µL의 루시페라아제 기질을 첨가합니다. 96-웰 플레이트 루미네선스 모드로 설정된 Ultra 3 84 루미노미터를 사용하여 플레이트를 측정하고, 서로 다른 웰의 상대적인 루시페라아제 활성을 평가하여 바이러스 중화 백분율을 도출합니다.

이 데이터는 달성된 바이러스 중화율이 RBD 면역 쥐로부터 얻은 혈청의 농도에 비례함을 보여줍니다. 이와 대조적으로, PBS를 주입한 동물로부터 얻은 혈청은 이 데이터의 어떤 농도에서도 바이러스를 중화시키지 못했습니다. 바이러스의 50%가 중화되는 혈청 역가인 NT 50은 쉽게 도출될 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때, 실험의 성공을 위해서는 자신감과 인내심이 필수적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상들을 시청한 후, 여러분은 포유류 세포 하위 배양에서 재조합 SARS 백신을 발현시키는 방법과 마우스 모델에서 중화항체 반응을 유도하는 능력을 결정하는 방법에 대해 더 잘 이해하게 될 것입니다.