Name: 재조합 RBD 기반 SARS 백신에 대한 프로토콜 : 단백질 준비, 동물 예방 접종 및 중화 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 배우세요 SARS RBD 재조합 백신 개발 프로토콜을 통해 293T 세포에서 단백질 발현 및 정제, 마우스 면역화, 그리고 유사바이러스 중화 분석을 수행하는 방법을 익히세요.

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이 연구는 미국 국립 보건원 (NIH) (RO1 AI68002)에 의해 지원되었다.

1. 재조합 SARS - CoV RBD 단백질 준비 <ol><li> 칼슘 인산염 transfection 시약 준비 <ol><li> 2X HBS 버퍼 준비 : 함께 NaCl의 16g, 나 2 HPO 4 * 7H 2 O의 0.4 g, 그리고 HEPES의 13.0 g를 섞습니다. 7.00로 산도를 조절하고 증류수 1000 ML에 총 볼륨을 가져 오십시오. 살균, 나누어지는에 대한 솔루션을 필터링 및 -20 ° C.에서 저장 후 힌트 : 산도 가치의 모든 변동은 transfection 결과에 영향을 미치지합니다. 따라서 그것은 7.00 (예를 들어, 6.99, 7.00, 또는 7.01) 주위 여러 ​​산도 값을 테스트하고 아래에 소개된 방법을 사용하여 transfection에 가장 적합한 하나를 찾을 것을 권장합니다. </li><li> 2.5 M CaCl 2 준비 : 200 ML의 최종 볼륨 증류수에 CaCl 2 * 2 시간 2 O의 73.5 g을 추가합니다. -20 ° C.에 솔루션 및 상점 필터 </li></ol></li><li> 재조합 플라스미드 transfection하여 단백질 정화 <ol><li> transfection 전에 confluency 24 H는 50~70%에서 293T 세포 분할. 40 ML DMEM는 FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S) 37 10 % 열 inactivated (HI)를 포함 ° C를 5% CO 2의 T - 175cm 두 조직 문화 flasks에 세포를 성장. </li><li> 모든 transfection의 시약은 transfection 전에 상온까지 가지고 있어야합니다. 이 시약은 2X HBS, 2.5M CaCl 2, DiH 2 O, 그리고 rRBD 플라스미드 6 포함되어 있습니다. 힌트 : 단백질 표정은 문화 뜨는로 표현 재조합 단백질의 분비를 보장하기 위해 신호 펩티드를 포함해야합니다에 대한 최종 재조합 플라스미드를 사용 제작합니다. 배의 그의 태그는 쉽게 정화를위한 표현 단백질의 C - 터미널에 추가할 수 있습니다. </li><li> 한 50 ML (A) 한 15 ML (B) BD 팰컨 튜브를 준비하고, 같은 표 1에 표시된 튜브에 시약을 추가합니다. 튜브 B에 관 A.에 2X HBS 버퍼를 추가 2.5M CaCl 2를 추가하고 플라스미드 rRBD, 그리고 DiH 2 O.의 요구 사항에 볼륨을 가지고 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> A. 하나의 T - 175cm 두 조직 문화 플라스크 (4000 μL / 술병) : rRBD 표현을위한 준비 </td></tr><tr><td colspan="2"> 튜브 </td><td colspan="2"> 튜브 B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 2000 μL </td><td> 2.5M CaCl 2 </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> rRBD 플라스미드 DNA </td><td> 40 μg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DiH 2 O로 </td><td> 2000 μL </td></tr><tr><td colspan="4"> B. 하나의 100 - mm 배양 접시 (1000 μL / 접시) : 사스 pseudovirus 생산을위한 준비 </td></tr><tr><td colspan="2"> 튜브 </td><td colspan="2"> 튜브 B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 500 μL </td><td> 2.5M CaCl 2 </td><td> 50 μL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> SARS - CoV S 플라스미드 DNA </td><td> 5 μg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> (pNL4 - 3.luc.RE) HIV - 1 플라스미드 </td><td> 5 μg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DiH 2 O로 </td><td> 500 μL </td></tr></tbody></table> 표 1. Transfection 혼합물의 준비와 볼륨 표 1에 나열된 볼륨 하나 transfection 유닛위한 것입니다. 더 flasks이나 요리가 transfection에 사용하는 경우 적절하게 볼륨을 조절할 수 있습니다. </li><li> 와동에 지속적인 부드러운가 혼합 유지하면서, 튜브 dropwise 방식에 관 B의 DNA - 칼슘 솔루션을 추가합니다. 혼합물은 20-30 분 실온에서 앉아 보자. 성공적인 칼슘 인산염 transfection에 대한 열쇠는 형성 촉진의 크기와 모양에 따라 달라집니다. 따라서 혼합물은 그 결과로 transfection의 효능을 향상시키고,이 요건을 충족하기 위해 지속적으로 천천히 vortexed하고 있어야합니다. </li><li> 293T 세포 (4000 μL / 플라스크)에도 dropwise와 방식으로 혼합을 추가합니다. 37 인큐베이터 문화 전지 ° 5% CO 2에서 C. </li><li> 신선한 혈청이없는 OPTI - 멤 I 감소 - 세럼 중간 (50 ML / 술병) 80-10 H 게시할 - transfection있는 문화 매체를 교체합니다. 같은 조건으로 이틀 더 문화 세포로 진행합니다. </li><li> 뜨는 포함하는 표현 rRBD 단백질 72 H 포스트 - transfection를 수집합니다. 세포 파편을 제거 15 분 6,000 rpm으로 원심 분리기. 4 ° C 하룻밤에 수집된 뜨는 및 저장 프로 테아제 억제제 칵테일을 추가합니다. </li><li> 다음날, 니켈 - NTA의 Superflow 다음과 같은 제조 업체의 지침을 사용하여 문화 뜨는에서 rRBD 재조합 단백질 정화. </li><li> Amicon 울트라 -15 농도 튜브를 사용하여 단백질을 정화 집중. 단백질 농도 후,농도 튜브에 PBS를 추가하고 용출 버퍼에 이미다졸을 제거하는 다시 원심 분리기. ° C를 사용하기 전까지 -80에서 단백질을 정제 단백질 농도 및 저장을 계산합니다. </li></ol></li></ol> 2. 마우스 예방 접종 및 샘플 수집 <ol><li> 40-45 사전 따뜻한 시그마 도움이되는 시스템 (SAS) ° C 제조 업체의 지시에 따라. 유리병 당 1 ML PBS를 추가하고 철저히 섞는다. </li><li> 표 2의 프로토콜에 따라 도움이되는 단백질의 감광 유제를 준비합니다. 피펫은 1.5 ML 튜브에 rRBD 단백질을 풀었다. 튜브 및 유제를 형성하기 위해 2-3 분 적극적으로 와동에 SAS 도움이되는 동등한 볼륨을 추가합니다. 힌트 : 표 2에 나열된 볼륨 한 마우스입니다. 사용되는 실제 마우스 번호에 따라 볼륨을 조정합니다. 각 그룹에 대한 각 백신에 필요한 단백질과 도움이되는 함께 섞는다. 항상 정확성을 보장하기 위해 예방 접종을 한 여분의 샘플을 준비합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 그룹 </td><td> 1 일 백신 (200 μL / 마우스) </td><td> 2 차 예방 접종 (200 μL / 마우스) </td><td> 제 3 백신 (200 μL / 마우스) </td></tr><tr><td> rRBD 단백질 </td><td> PBS 20 μg 단백질 (100 μL) + 100 μL SAS </td><td> PBS 10 μg의 단백질 (100 μL) + 100 μL SAS </td><td> PBS 10 μg의 단백질 (100 μL) + 100 μL SAS </td></tr><tr><td> PBS 제어 </td><td> 100 μL PBS + 100 μL SAS </td><td> 100 μL PBS + 100 μL SAS </td><td> 100 μL PBS + 100 μL SAS </td></tr></tbody></table> 표 2. 마우스 예방 접종 프로토콜 </li><li> Subcutaneously 프라임 - 면역 여성 BALB / C 마우스 (오래된 4-6주, 5 마우스 / 그룹) 및 rRBD 및 SAS와 배 향상은 표 2에서 지적했다. 컨트롤로 PBS 그룹을 사용합니다. 일반적으로 선택한 피하 주사에 대한 사이트는 양어깨 사이의 느슨한 피부이다. 또는 복부 복부는 그것이 주사 쉽게되기 때문에 일반적으로 사용되며, 사출 사이트에서 어떠한 누수를 관찰 수 있습니다. 백신의 반복 복용을 사용하는 경우, 그것은 잠재적인 지역의 피부 반응을 방지, 각종 사출 사이트를 선택 쉽습니다. </li><li> ° C 30 분 보완을 inactivate하는 56 각 예방 접종 후 예방 접종을 10 일 전에 마취와 함께 복고풍 - 궤도 및 열을 세라를 통해 쥐를 출혈. 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관 마우스 세라. </li></ol> 3. Pseudovirus의 중화 분석을 사용하여 중화 감지 <ol><li> 사스 pseudovirus 준비 <ol><li> transfection 전에 (2x10 6 셀 / 요리) 100mm 조직 문화를 배양 접시에서 16 H를 293T 세포를 분리하고, 상기 세포를 성장. </li><li> 로 표 1에 표시된 transfection의 시약을 준비합니다. 공동 transfect 플라스미드 인코딩 SARS - CoV S 단백질과 플라스미드 인코딩 환경을 - 결함, 루시페라제 - 표현 HIV - 1 유전자 (pNL4 - 3.luc.RE) 칼슘 인산염 transfection 시약을 사용합니다. </li><li> 10 ML 신선한 DMEM 10 % FBS, 1 % P / S 80-10 H 포스트 transfection을 포함와 매체를 대체합니다. 뜨는 포함 사스 pseudovirus 72 H 포스트 - transfection를 수집합니다. </li><li> 0.45 μm의 필터를 통해 필터 pseudovirus. -80에서 나누어지는하고 저장 ° C까지 사용. </li></ol></li><li> 사스 pseudovirus의 중화 분석 <ol><li> 16 H 감염 전에 96 잘 조직 배양 플레이트 4 cells/100 μL / 음 10 SARS - CoV 수용체 ACE2 (ACE2/293T)를 표현 293T 세포를 분할. </li><li> ACE2/293T 세포에서 바이러스 titer를 감지 2 배로 사스 pseudovirus을 희석. </li><li> 순차적으로 96 - 웰 조직 문화 접시에 마우스 세라를 희석하고, titrated 사스 pseudovirus 동등한 볼륨을 추가합니다. 1 H.위한 37 ° C에서 접시를 Preinc​​ubate </li><li> 부화 후, ACE2/293T 세포에 세라 - pseudovirus 혼합물 100 μL를 추가하고, 37 세포의 성장을 계속 ° C를 5% CO 2인치 나중에 신선한 DMEM 24 H를 추가합니다. </li><li> 완전히 문화 supernatants는 접시에서 72 H 게시 - 감염을 제거합니다. 1X 루시페라제 세포 배양 용해 시약 (물론 60 μL /)를 추가하고 지속은 실온에서 1-2 H에 대한 번호판을 잡고 세포 용해를 촉진. </li><li> luminometer 플레이트로 전송 세포 lysates (물론 50 μL /) (Microfluor 96 - 웰 플레이트). 루시페라제 분석 시스템에 포함된 루시페라제 기판 (50 μL / 음) 추가하고 울트라 384 luminometer에서 상대 루시페라제 활동을 감지합니다. </li><li> 50% 중화 항체 titer (NT 50) 6 등 사스 pseudovirus의 중화 titer와 선물을 계산합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

세포 밀도는 칼슘 인산염 기반 transfection의 효능에 영향을 미치는 중요한 요소이다. 우리의 경험에서 세포의 confluency 미만 70 % 최상의 결과를 제공합니다. 따라서, transfection 효율을 개선하기 위해, 그것은 세포 밀도가 confluency의 50-70 % 정도에서 보관하는 것이 좋습니다. 칼슘 인산염 transfection 방법은 일반적으로 지질 transfection 16 같은 다른 transfection 방식에 비해 덜 효율적인 것으로 생각됩니다. 그러나,이 프로토콜에서 우리는 따라서 transfection 효율을 향상, 소용돌이에 transfection 솔루션의 혼합 지속과 느린 해당 크기와 모양과 침전물의 형성을 보장 의하여 수정된 칼슘 인산염 transfection 방법을 사용합니다.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2429</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12430</td><td></td></tr><tr><td>열불활성화 FBS (HI FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 (Penicillin/Streptomycin)</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM I 배지</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 (Protease inhibitor cocktail)</td><td>Roche Group</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30450</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 보조제 시스템 (Sigma adjuvant system)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6322</td><td></td></tr><tr><td>루시퍼라제 분석 시스템 (Luciferase assay system)</td><td>Promega Corp.</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>루시퍼라제 세포 배양 용해 시약 (5X)</td><td>Promega Corp.</td><td>E1531</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra - 15</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Microfluor 96-웰 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>7905</td><td></td></tr><tr><td>Ultra 384 루미노미터</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

재조합 rbd 기반 sars 백신에 대한 프로토콜 : 단백질 준비, 동물 예방 접종 및 중화 감지

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

그들의 안전을 프로필과 감염에 대한 강력한 면역 반응을 유도하는 능력을 기반으로, subunit 백신은 1-3 병원균의 다양한 후보로 사용되었습니다. 포유 동물 세포 시스템이 있으므로 제대로 접힌과 glycosylated 단백질을 형성, 사후 translational 수정이 가능하기 때문에, 포유 동물 세포에 표현 재조합 단백질은 높은 항원성 및 immunogenicity 4-6을 유지하기 위해 가장 큰 잠재력을 보여주었다. SARS에 대한 새로운 사건이 2004 년 이후보고되지 않고있다지만, 미래 발생은 지속적인 위협하므로, SARS - CoV에 대한 백신의 개발은 신중하게 예방 단계와 진행해야합니다. SARS - CoV S 단백질의 RBD는 수용체 바인딩 및 바이러스 감염에 대한 구체적인 7-9 중화 항체의 유도에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. 따라서,이 프로토콜에서 우리는 사스에 대한 RBD 기반 subunit 백신을 개발하기위한 새로운 방법을 설명합니다. 간단히, 재조합 단백질 RBD (rRBD)는 적절한 형태와 높은 immunogenicity 6 제대로 접힌 단백질을 얻기 위해 포유 동물 293T 세포의 문화 뜨는으로 표현되었다. 세포에 재조합 플라스미드 인코딩 RBD의 transfection 그 다음 수정과 칼슘 인산염 transfection 방법 6,10를 사용하여 수행되었습니다. 지질 transfection 방법 11,12 비해,이 수정된 칼슘 인산염 transfection 방법은 처리 저렴, 쉽게하고, 적당한 크기와 모양과 transfection 복합은 13,14을 형성되면 높은 효능을 도달하는 가능성이있다. 마지막으로, 사스 pseudovirus의 중화 분석은 프로토콜의 도입 rRBD 단백질과 예방 접종을 생쥐의 세라의 중화 활동을 탐지하는 데 사용되었다. 이 분석은 상대적으로 안전, 전염병 사스 - CoV를 포함하지 않으며, biosafety - 3 실험실 15 요구하지 않고 수행할 수 있습니다. 프로토콜은 또한 예를 들어, HIV, 호흡 syncytial 바이러스 (RSV), 에볼라 바이러스, 인플루엔자 바이러스뿐만 아니라 Nipah과 Handra 바이러스를 설계하고 클래스 I 융합 단백질로 다른 바이러스에 대한 재조합 subunit 백신을 연구하는 데 사용할 수 있습니다 여기에 설명되어 있습니다. 또한, pseudovirus을 생성하고 이후 pseudovirus의 중화 분석 수립을위한 방법은 모든 바이러스에 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 사스에 대한 재조합 수용체 결합 도메인 (RBD) 기반 subunit 백신을 연구를위한 일반적인 절차를 설명합니다. 그것은 293T 세포에 RBD 단백질, RBD와 설립 사스 pseudovirus의 중화 분석을 사용하여 마우스 세라의 중화 활동의 검출과 생쥐의 예방 접종의 transfection과 표현을위한 방법을 포함하고 있습니다.

재조합 RBD 기반 SARS 백신에 대한 프로토콜 : 단백질 준비, 동물 예방 접종 및 중화 감지

안전성 프로파일과 감염에 대한 강력한 면역 반응 유도 능력을 바탕으로, 서브유닛 백신은 광범위한...

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 광범위 중에서도, 백신 및 치료를위한 새로운 벡터를 개발하기 위해 지난 몇 년 동안 연구되어왔다. 이 연구로 인해 이러한 우리가 여기에서 설명하는 것과의 cDNA에서 재조합 바이러스를 구출하는 기술로 가능했습니다.

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

높은 처리량,이 연구에 설명 합니다 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 특정 중화 항 체 titer를 확인 하려면 이미징 기반 마이크로 중화 분석 결과. 이 분석 결과 형식은 다른 샘플 형식에 대해 테스트 되었습니다.

향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과

우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

여기에서 우리는 광견병 백신에 있는 면역원성 당단백질 내용을 결정하기 위하여 간접적인 ELISA 샌드위치 면역 포착을 기술합니다. 이 시험은 당단백질 트리머를 인식하는 중화 단일클론 항체(mAb-D1)를 사용한다. 그것은 생산 하는 동안 백신 힘의 일관성을 따라 생체 내 NIH 테스트에 대 한 대안.

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

백신 개발에 사용하기 위한 자가 조립 단백질 나노입자(SAPN)의 정제, 재접이식 및 특성화를 설명하는 상세한 방법이 여기에 제공된다.

삼중 에피토프 프리젠 테이션을 필요로하는 백신을위한 대장균- 발현 자가 조립 단백질 나노 입자의 생산

플라스미드 DNA로부터의 재조합 로타바이러스 생성은 로타바이러스 복제 및 병인, 및 로타바이러스 발현 벡터 및 백신의 개발을 위한 필수적인 도구를 제공한다. 본 명세서에서, 우리는 형광 리포터 단백질을 발현하는 균주를 포함하는 재조합 로타바이러스를 생성하기 위한 단순화된 역유전학 접근법을 설명한다.

리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 회수하는 역유전학 방법 간소화

본 프로토콜은 외막 소포의 생명공학을 생산, 정제, 생체접합 및 특성화를 포함하는 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼으로 설명합니다.

SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼

이 방법론은 소 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)의 생성과 소의 잠재적인 동물용 백신 개발 중 항원 후보의 시험관 내 평가를 위한 적용을 설명합니다.

소 단핵구 유래 수지상 세포를 이용한 백신 면역원성 측정

유사형 바이러스(PV)는 실제 바이러스를 취급하는 것보다 더 안전한 조건에서 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 복제 결함 바이러스입니다. 여기에 제시된 자세한 프로토콜은 SARS-CoV-2 PV를 사용하여 COVID-19 백신 접종 후 환자 혈청의 중화 능력을 테스트하는 방법을 보여줍니다.

중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스

배우세요 SARS RBD 재조합 백신 개발 프로토콜을 통해 293T 세포에서 단백질 발현 및 정제, 마우스 면역화, 그리고 유사바이러스 중화 분석을 수행하는 방법을 익히세요.

재조합 RBD 기반 SARS 백신에 대한 프로토콜 : 단백질 준비, 동물 예방 접종 및 중화 감지

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