공동 배양에서 미생물 상호작용을 연구하기 위한 시험관 내 분석법

먼저 바이오아세이 플레이트를 사용하세요. 하나는 영양분 한천의 왼쪽에 Corynebacterium propinquum 으로 미리 정착하고, 다른 하나는 영양분 한천만 포함합니다.

다음으로, 병원성 포도상구균 현탁액이 포함된 다중 웰 플레이트를 가져옵니다.

접종 도장을 우물에 넣고, 그 끝이 포도상구균 배양물에 담가도록 합니다.

스탬프를 돌린 후 들어 올려 각 팁에 균일한 방울이 있는지 확인하여 일관된 예방접종을 보장합니다.

스탬프를 바이오아세이 플레이트의 오른쪽과 정렬하여 기존 군락과의 접촉을 피하세요.

도장을 떼어내면 한천에 포 도상구균 접종 자국이 남게 됩니다.

한천 단독 플레이트에 스탬핑을 반복하여 단일 배양을 생성하세요. 플레이트를 거꾸로 부양하세요.

공동 배양에서는 C. propinquum 이 시데로포어(siderophores)를 분비하며, 이는 한천에서 철을 회수하여 포 도상구균 성장을 억제합니다.

인큐베이션 후에는 공동 배양과 단일배양에서의 포도상구균 성장을 비교하세요.

공동 배양에서의 상당한 억제는 두 종 간의 상호작용을 시사합니다.

바이오분석기 배지를 6일간 배양한 후, 앞서 설명한 대로 대상 유기체의 하룻밤 배양을 준비합니다. 표적 플레이트는 빈 12웰 플레이트의 각 웰에 1.8밀리리터의 BHI와 200마이크로리터의 타겟 오버나이트 배양액을 채워 준비합니다. 멸균 접종 도장을 표적 판에 붙이세요.

우물 주변의 배양물을 부드럽게 휘저어 인근 우물과 교차 오염되지 않도록 하세요. 접종 도장을 들어 올리고, 각 도장 끝에 희석된 표적 배양액 방울이 있는지 확인하세요. 접종 스탬프를 접종되지 않은 바이오아세이 플레이트 위에 올려놓고, 스탬프를 부드럽게 흔들어 배양 방울이 각 웰에 접종되도록 합니다.

도장이 제거되면 웰 내에 배양 방울이 보여야 합니다. 접종 스탬프가 부착되지 않은 웰이 있다면, 피펫을 사용해 3마이크로리터의 희석된 하룻밤 배양액을 웰에 붙이세요. 그 후 앞서 설명한 대로 생물분석판에 접종하되, 스탬프 팁을 12웰 플레이트의 오른쪽과 정렬하여 스탬프가 기존 박테리아 집락에 닿지 않도록 합니다. 조심스럽게 도장을 떼어내 다시 표적 판에 넣으세요.

한천이 웰에서 고르지 않게 굳어졌다면, 스탬프를 부드럽게 앞뒤로 흔들되, 스탬프가 시험 유기체 성장 쪽으로 옮겨지지 않도록 주의하세요.

각 바이오아세이 플레이트에 대해 접종을 반복하여 모든 플레이트에 접종을 완료한 후, 적절한 온도에서 플레이트를 거꾸로 7일간 배양합니다.

시험과 표적 생물체를 1주일간 공동 배양한 후, 시각적 평가를 바탕으로 상호작용 점수를 부여합니다. 단일 배양과 구별할 수 없는 성장을 보이는 목표 생물 성장이 있는 우물은 0으로 점수를 매깁니다. 성장 감소가 있는 우물은 1, 성장 없음을 2로 평가하세요.