마우스 심장 조직 절편에서 박테리아가 채워진 미세병변의 면역염색 검사

병원성 박테리아인 폐렴구균에 감염된 쥐의 화학적으로 고정된 심장 조직 절편이 담긴 슬라이드부터 시작하세요.

이 감염은 심장 근육 내에 세포외 박테리아로 가득 찬 미세병변을 형성하게 합니다.

잔여 고정제를 제거하기 위해 완충제로 해당 부분을 세척하세요.

비이온성 세제를 발라서 숙주 세포막을 투과시키세요.

남은 세제를 제거하기 위해 다시 세척하세요.

차단제와 함께 부위를 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단하세요.

차단제가 없는 것을 씻어내세요.

박테리아의 캡슐 다당류에 결합하는 1차 항체를 도입합니다.

결합되지 않은 항체를 세척한 후, 1차 항체에 결합하는 녹색 형광 표지된 2차 항체를 추가하세요.

핵염료로 반염색하여 숙주 세포 핵을 표지합니다.

단면을 세척하고 마운팅 매체를 사용해 장착하세요.

미세병변 내 표지된 박테리아를 공초점 현미경으로 관찰하세요.

양전하를 띤 유리 슬라이드에 5마이크론 심장 절편을 사용하고, 먼저 단편을 냉동한 후 해동한 뒤 자연 건조시킵니다. 슬라이드를 10% 중성 완충 포르말린에 25도 섭씨에서 10분간 고정하세요. 그 후 세 번 세척하고 PBS를 5분간 세척해 고정제를 제거하세요.

이어 PBS에 0.2% Triton X-100을 15분간 투과시킵니다. 세제를 순수 PBS로 세 번 더 세척해 제거하세요. 그 후 10% 염소 혈청을 PBS에 넣어 1시간 동안 조직을 차단합니다. PBS로 세척한 후, 37도에서 2시간 동안 항혈청으로 해당 부위를 덮습니다. 음성 대조군은 순진한 토끼 항혈청으로 치료하세요.

심장 조직이 XI 면역형광 염색을 쉽게 흡수하여 높은 배경 수치를 유발하기 때문에, 다양한 유형의 항체에 대한 배영 시간 농도를 최적화해야 할 가능성이 큽니다.

두 시간 후, PBS로 항혈청을 씻어내세요. 그 후 용액을 2차 항체로 교체하고 슬라이드를 37도 섭씨에서 30분 더 배양합니다. 이제 DAPI를 밀리리터당 5밀리그램으로 바르고 슬라이드를 PBS로 세척하세요. 마지막으로 슬라이드를 FluorSave에 장착하고 공초점 현미경으로 영상을 찍습니다.