형태학적 분석을 위한 박테리아 바이오필름 군락 준비

영양분 한천 플레이트 위에서 박테리아 바이오필름 군락을 키우는 것으로 시작하세요.

이 바이오필름은 소수성 세포외 기질로 구성되어 캡슐화된 박테리아를 숙주 면역 반응으로부터 보호합니다.

고정제를 넣고 플레이트를 부드럽게 돌려 바이오필름이 떠오르기 시작할 때까지 하세요.

플레이트를 밀봉하고 부드럽게 흔들어 바이오필름 구조를 보존하세요.

고정제를 제거하고 완충제를 추가한 후 바이오필름 구조를 안정화시키기 위해 배양하세요.

파스퇴르 피펫을 사용해 콜로니를 한천에서 부드럽게 분리합니다.

박테리아 군락을 탈수시키기 위해 에탄올 농도를 점차 증가시킵니다.

부유하는 군집을 에탄올에 적신 필터 페이퍼 위에 옮긴 뒤, 밀폐된 챔버에서 자연 건조합니다.

말린 군집을 탄소 테이프로 코팅된 스텁과 브리지에 탄소 테이프로 장착하여 전자빔에 의한 충전을 방지합니다.

다음으로, 영상 대비를 높이기 위해 바이오필름에 전도성 금속층을 코팅합니다.

바이오필름은 이제 전자현미경을 통한 형태학적 분석이 가능하다.

샘플 고정을 시작하려면 먼저 원하는 바이오필름 콜로니 수에 충분한 신선한 고정액을 준비하세요. 각 페트리 접시에 5밀리리터의 고정액을 조심스럽게 추가하고, 콜로니에 직접 피펫팅하지 마세요. 식민지들이 한천에서 분리되어 떠오르기 시작할 것입니다.

플레이트를 파라필름으로 조심스럽게 밀봉한 후, 실온에서 회전식 셰이커에서 2시간 동안 배양하세요. 플레이트를 4도 섭씨 보관으로 옮겨 하룻밤 동안 보관하세요.

진공에 연결된 파스퇴르 피펫으로 고정액을 부드럽게 제거하세요.

100나몰 카코딜레이트 나트륨 10밀리리터와 5밀리몰 염화칼슘 완충제를 추가하여 바이오필름을 세척한 후 5분간 배양합니다. 파스퇴르 피펫으로 아가르 플레이트에서 바이오필름 군락 중심부를 조심스럽게 분리하세요.

콜로니를 자연 건조시키려면, 셀룰로오스 필터 페이퍼를 4등분한 후 한 부분을 100% 에탄올에 담가둡니다.

부유하는 바이오필름 군락 하나를 조심스럽게 종이 위에 옮깁니다. 종이를 마른 필터 페이퍼로 안감한 페트리 접시에 넣으세요. 그 후 접시를 덮고 화학 후드에 넣어 하룻밤 말리게 하세요.

바이오필름 군락의 형태를 보존하기 위해서는 떠다니는 바이오필름 아래에 셀룰로오스 종이를 완전히 덮는 것이 중요합니다. 종이에 붙으면 바이오필름을 다시 조정할 수 없습니다.

전자현미경 스텁에 탄소 테이프를 바르고, 핀셋으로 바이오필름 콜로니를 조심스럽게 스텁 위에 옮기세요.

각 콜로니를 스텁에 연결한 후, 얇은 카본 테이프