Name: Lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, Immunohistochemistry, 그리고 조직학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: 학습하세요 마우스 조직에서 지질친화성 염료 추적, 현장에서 하이브리드화, 면역조직화학 및 조직학을 결합한 다중 기법 분석. 이 방법은 단일 표본에서 유전자 돌연변이와 형태학적 프로파일을 상관시켜 신경과학 연구에 포괄적인 데이터를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

공촛점 이미지는 이미징을 위해 아이오와 카버 센터의 대학에서 취득했다. 기금이 프로젝트에 대한 쥐를 번식 BF 추가 지원하는 SBIR 그랜트 (MH079805)에 의해 제공된는 BF에 NIDCD (5R01DC00559007)에 의해 제공된

<ol><li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li>
<li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li>
<li>Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li>
</ol>

마우스 조직은 아이오와 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학 (ACURF 0,804,066)에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수집되었다.

이 비디오에서는, 우리는 주어진 동물 내의 데이터 (그림 3)를 연관하여 데이터 수집 및 cohesiveness을 극대화하기 위해 네 개의 기술을 결합하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 번식의 양을 줄일 수 및 공동 현지화 및 돌연변이의 상호 영향에 대한 정보를 개선하면서 따라서 시간이 획기 데이터를 얻기 위해 필요했습니다. 배아 생쥐이 동영상, 성인 마우스뿐만 아니라 닭고기, xenopus 및 zebrafish 같은 다른 동물에서 널리 사용 되었으나뿐만 아니라 이러한 기술을 사용하여 분석하실 수 있습니다. 다른 종을 사용하는 경우 proteinase K는 소화 변경해야 할 수도 있습니다. 우리가 특별히 관심을 세 가지의 연결 인구 최대 라벨 다른 fluorescing NeuroVue의 염료를 사용합니다. 이 염료의 장점들은 단독 또는 분석하기 위해 돌연변이에 의해 영향을받을 수도 있고받지 않을 수도 있습니다 immunohistochemistry에 의존하면 문제가있을 수 있습니다 돌연변이 생쥐에서 사용할 수 있으며, 그들은 retrogradely 및 anterogradely 5 뉴런 레이블을. 최근 연구는 또한 6 2 동시에 표시 수있는 신경 세포의 인구의 수를 증가하고 있습니다. 후, 관심 같은 조직을 추적 ​​lipophilic 염료는 다음 유전자 전사의 분석, 현장 하이브리드화 사용하여 분석할 수 있으며, 이후 단백질 배포 immunohistochemistry를 사용하여 분석하실 수 있습니다. 후자 분석 표현형 특성화 6 추가할 수 있습니다 자세한 조직학에 의해 보충 수 있습니다. 이 multifactorial 분석 달리 황당한 또는 적어도 더 광범위한 프로토콜과 마우스 번식을 필요로 할 수있는 동일한 동물 사이 상호 분석을 통해 새로운 통찰력을 얻을 수있는 가능성이있다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; 하이브리다이제이션:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC DIG 세척 및 블로킹 버퍼 세트</td><td>Roche Group</td><td>1585762</td><td></td></tr><tr><td>Premix 20x SSC 버퍼</td><td>Roche Group</td><td>1666681</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K 20mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocorbonate (DEPC)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D43060</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드(Formamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D20020</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple</td><td>Roche Group</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP Fab 단편</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>RNase A 효소 10mg/ml</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Research Products International Corp.</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA 10mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 필터 유닛 0.22&amp;mu;m; 500ml</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>필터 디스크 0.2&amp;mu;m; 25mm</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>인산 완충 식염수 pH 7.4 패킷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;면역조직화학: &lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청(Goat Serum)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 염료</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>9460</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;조직학: &lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly/Bed 812 임베딩 배지/DMP-30 키트</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 옥사이드(Propylene oxide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 용액 50%</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151</td><td></td></tr><tr><td>DPX 봉입제</td><td>Fluka</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>로커(Rocker)</td><td>MidSci</td><td>55D1114</td><td></tr><tr><td>히트 블록(Heat Block)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-715-125D</td><td></td></tr><tr><td>로테이터(Rotator)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터(60&amp;#x00B0; 설정)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;염료 추적: &lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>미세 가위</td><td>Geuder</td><td>G-19775</td><td></td></tr><tr><td>미세 핀셋</td><td>E.M.S</td><td>72680-F</td><td></td></tr><tr><td>NeuroVue 염료: 마룬, 레드, 제이드</td><td>MTTI</td><td>FS-100(1,2,6)</td><td></td></tr><tr><td>1X 인산 완충 식염수 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터(36&amp;#x00B0; 설정)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-506DQ</td><td></td></tr><tr><td>공초점 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 글라스</td><td>Surgipath</td><td>00240</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>Surgipath</td><td>00106</td><td></td></tr><tr><td>RPI</td><td>글리세롤(Glycerol)</td><td>G22025-0.5</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (4% 및 0.4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr></tbody></table>

lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, immunohistochemistry, 그리고 조직학

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

유전자 규제 네트워크에 깊은 상처 단일 유전자 기능을 넘어가는 것은 하나의 동물에서 결합 여러 돌연변이가 필요합니다. 두 개 이상의 유전자의 이러한 분석은 세포와 조직 표현 변경에 대한 자세한 해결을 위해 전체를 장착 개발 장기 또는 섹션에 모두 다른 유전자 또는 단백질의 immunohistochemistry의 현장 하이브리드화에 구비해야합니다. 여러 유전자 변경을 결합 조건부 유전자를 삭제하고 배아 파괴 장면을 보여 주죠을 피하기 위해 CRE 또는 flipase의 사용을 필요로합니다. 필수 번식 제도가 크게 노력을 강화하고 원하는 유전 수정의 전체 레퍼토리 매우 몇몇 동물의 결과와 함께, 변이된 유전자의 숫자에 비례 비용. 여러 변이를 운반하고 이러한 몇 가지 귀중한 표본을 얻기 위해 노력과 시간의 방대한 양을 Amortizing하면 조직 최적화를 필요로. 또한, 여러 기술을 하나의 동물을 조사하면 쉽게 표현 프로필 유전자 결함 삭제를 상호 연관시킬 수 있습니다. 우리는 주어진 동물보다 철저한 분석을 얻을 수있는 기술을 개발, 모두 전체가 탑재 장기 및 섹션에 동일한 표본에서뿐만 아니라 유전자 및 단백질 표현 같은 모든 여러 histologically 알아볼 구조를 분석할 수있는 능력. 마우스가이 기법의 효과를 입증하기 위해 이용되어 있지만 그것은 동물의 다양한 적용할 수 있습니다. 이 작업을 수행하려면 우리는 데이터의 최대한 가능한 금액을 추출하는 현장 하이브리드화, immunohistochemistry, 그리고 조직학 in lipophilic 염료 추적, 전체 마운트를 결합.

마우스 조직에서 데이터 수집을 최대화하기 위해 다양한 기술의 조합이 제공됩니다.

Lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, Immunohistochemistry, 그리고 조직학

단일 유전자 기능을 넘어 유전자 조절 네트워크를 더 깊이 있게 분석하려면, 단일 개체에 여러 돌연변이를 결합하는 과정이 필요합니다. 이러한 ...의 분석은

단일 유전자 기능을 넘어 유전자 조절 네트워크를 분석하려면 한 마리의 동물에서 여러 돌연변이가 일어나야 합니다. 본 시스템에서는 단일 조직에서 생성되는 데이터 양을 최적화하여 유전적 돌연변이와 형태적 및 발현 프로파일 간의 상관관계를 분석합니다. 이는 우선 친유성 염료를 주입하여 여러 개의 개별 뉴런 집단을 시각화함으로써 달성됩니다.유전자 전사체의 시공간적 패턴을 시각화하기 위해 in situ hybridization이 수행됩니다. 면역조직화학법은 단백질 발현의 특정 패턴을 반영하며, 여기에 조직 절편 제작이라는 차원이 더해져 표현형 특성 분석에 기여합니다. 이 실험 시스템을 통해 동일한 표본의 전체 장착 표본과 절편 표본 모두에서 유전자 및 단백질 발현뿐만 아니라 조직학적으로 식별 가능한 여러 다양한 구조를 분석할 수 있습니다. 이는 친지성 염료 추적, in situ hybridization, 면역조직화학 및 조직학을 결합한 시스템입니다.이 기술은 단일 표본에서 얻을 수 있는 정보를 최대화하는 동시에 형태학적 특징을 유전자 및 단백질 발현과 상관시켜 분석합니다. 모든 조직 박리 및 조작 과정에서, 적절한 크기의 바늘이 장착된 연동 펌프를 사용하여 0.1 M 인산염 완충액에 희석된 4% 파라포름알데히드로 심장 관류 고정을 실시하십시오. DY는 빛에 민감하므로 어두운 밀폐 공간에 보관하고, 교차 오염을 방지하기 위해 해부 현미경 하에서 각 염료를 처리할 때 별도의 기구 세트를 지정하여 사용하십시오.고려 중인 신경세포군만을 선택적으로 표지하고 다른 불필요한 구조물은 표지되지 않도록 염료 적용 부위를 결정하십시오. 선택한 부위를 시각적으로 확인하고 염료를 배치하기 위한 접근 경로를 확보하기 위해 불필요한 조직을 제거하십시오. 이제 마이크로 가위를 사용하여 미리 준비된 neuro view 염료 필터 스트립을 적절한 크기의 삼각형 조각으로 자르십시오.뇌와 같은 연조직에 직접 삽입할 때 다른 구조물이 함께 표지되는 것을 방지하려면 필터 조각을 가능한 한 작게 자르십시오. 필터 삼각형의 한 꼭짓점을 사용하여 조직을 뚫고 필터를 삽입하십시오. 더 단단한 조직의 경우, 필터를 더 쉽게 삽입할 수 있도록 절개창을 만드십시오. 박리침(dissecting needle)을 사용하여 필터를 조직 속으로 밀어 넣지 마십시오.검체를 4% paraformaldehyde가 들어있는 단단히 밀폐된 바이알에 넣고, 연령 및 확산 거리의 정도에 따라 36 °C의 암소에서 2~14일 동안 배양합니다. 에피 형광 기능을 갖춘 해부 현미경을 사용하여 염료가 원하는 위치까지 확산되었는지 확인하고 관심 조직을 절제합니다. 공초점 현미경으로 이미징하기 위해 글리세롤을 사용하여 검체를 슬라이드에 고정합니다.공초점 현미경으로 친유성 눈의 이미지를 촬영한 후, 글리세롤을 체계적으로 씻어내기 위해 RNase-free PBS가 담긴 2 mL RNase-free EP 튜브로 샘플을 옮깁니다. 4°C에서 단계별 메탄올 시리즈를 사용하여 샘플의 탈수 및 재수화 과정을 진행합니다. 100% methanol에서 최소 1시간 동안 배양하는 것으로 시작하여 25% methanol에서 15분간 처리하는 단계까지 진행합니다.1배 PBS로 5분씩 3회 세척합니다. 2 mL의 신선한 PBS에 20 mg/mL Proteinase K 스톡 2 µL를 넣어 조직을 소화시킵니다. 조직의 불투명도가 불투명한 상태에서 거의 투명하게 변하는 것을 통해 소화 반응을 모니터링합니다.효소 소화를 중단하기 위해, 샘플을 4% para formaldehyde에서 5분 동안 배양합니다. 그 후 PBS로 1분 동안 한 번 세척하고, 이어서 5분 동안 세 번 더 세척합니다. 전-하이브리다이제이션(pre hybridization) 단계로서 가능한 한 많은 잔여물을 제거하는 데 유의하며 마지막 PBS 세척액을 버립니다.1.8 mL의 하이브리다이제이션 용액에 샘플을 넣고 인큐베이션합니다. 인버터를 사용하여 60 °C에서 1시간 동안 혼합합니다. 연어 정자 DNA를 85 °C에서 10분간 인큐베이션하여 변성시킨 후 얼음에 둡니다. 변성된 단일 가닥 DNA 200 µL와 DIG 표지 riba 프로브 약 100 ng을 각 샘플에 첨가하고, 하이브리다이제이션 오븐에서 60 °C로 하룻밤 동안 하이브리다이제이션합니다.하이브리드화 오븐에서 60 °C로 2× SSC를 사용하여 10분씩 세 차례 세척하여 샘플을 처리합니다. 중요하게는, ISO temp 가열 블록에서 70 °C로 2× SSC를 사용하여 60분 동안 세척함으로써 내인성 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase) 활성을 제거하십시오. PBS로 샘플을 5분 동안 세척합니다.이제 PBS를 제거하고 10 mg/mL RNAs A를 1 µL 첨가합니다. ISO temp 히트 블록을 사용하여 37 °C에서 60분 동안 배양합니다. PBS RNAs A를 버리고 세척 용액으로 10분씩 3회 세척합니다.마지막으로, ISO 온도 가열 블록에서 70°C로 60분 동안 배양하여 남은 RNA를 가열하고 활성화합니다. 최종 단계는 ribo probe를 시각화하는 것입니다. 샘플을 1배 농도의 block buffer에서 1시간 동안 배양합니다.블록 버퍼를 버리고, 1 µL의 anti ditch 항체가 포함된 블록 버퍼 2 mL를 각 샘플에 추가합니다. 하룻밤 동안 배양한 후, 안내된 대로 1× 세척 버퍼로 여러 번 세척합니다. 그 다음, 샘플을 1× 세척 버퍼에서 하룻밤 동안 배양합니다.검출 버퍼로 샘플을 1회 10분 동안 헹군 후, 샘플을 웰 플레이트로 옮깁니다. 버퍼를 제거하고 BM purple로 발색시킵니다. BM purple은 빛에 민감하므로, 원하는 신호 강도가 얻어지면 호일이나 상자로 덮어줍니다.웰 내의 검체를 1배 농도의 검출 버퍼로 5분 동안 세척하십시오. 투과 현미경으로 검체를 촬영하거나 4% Para formaldehyde에 넣어 4 °C에서 보관하십시오. 필요한 경우, 단계별 에탄올 시리즈를 사용하여 조직에서 친지성 염료를 제거하십시오.그 다음 5~10분에 걸쳐 PBS를 점진적으로 첨가하여 조직을 재수화합니다. 이제 실온의 쉐이커에서 2.5% normal goat serum와 0.5% Triton X 100 용액으로 조직을 1시간 동안 블로킹합니다. 블로킹 용액에 희석한 1차 항체를 처리하여 4°C의 쉐이커에서 48시간 동안 배양합니다. PBS로 1시간씩 3회 세척합니다. 샘플을 다시 블로킹한 후, 블로킹 용액에 희석한 형광 접합 2차 항체를 처리하여 4°C의 쉐이커에서 12~24시간 동안 배양합니다. 2차 항체는 빛에 민감하므로, 이 단계부터는 샘플에 빛이 차단되도록 주의해야 합니다.다시 샘플을 PBS로 1시간씩 3회 세척합니다. 마지막으로 에피 형광 및 공초점 현미경 이미징을 통해 표본을 분석합니다. 에폭시 포매 및 절편 제작을 위해서는 일반적으로 유리 샘플 바이알에서 0.1 molar 인산염 완충액에 포함된 2.5% GLUTARALDEHYDE 1% PFA로 조직을 하룻밤 동안 고정해야 합니다. 단계별 에탄올 배양으로 조직을 탈수하여 용매로 전환하며, 1:1 비율의 절대 에탄올과 프로필렌 옥사이드 혼합액에 5분간 배양한 후, 프로필렌 옥사이드만으로 10분씩 5회 세척합니다. 쉐이커 위에서 1:1 비율의 프로필렌 옥사이드와 레진 혼합액에 하룻밤 동안 단순 배양하여 샘플에 레진을 침투시킵니다.시료가 포함된 용액을 평평한 매립 몰드에 붓고 프로필렌 옥사이드를 증발시키기 위해 실험대 위에 4~6시간 동안 둡니다. 최종 몰드에서 시료를 100% resin에 4시간 동안 옮겨 둡니다. 시료를 resin에 매립하고 라벨을 부착합니다.60 °C에서 24~48시간 동안 배양하여 레진을 중합시킵니다. 불필요한 레진을 최소화하기 위해 필요한 경우 면도날로 레진 블록을 깎아냅니다. 울트라 마이크로톰(ultra microtome)을 사용합니다.1~2 µm 두께의 연속 절편을 제작하여 마운트한 후, 투과 전자 현미경 및 에피 형광 현미경을 사용하여 샘플을 촬영합니다. 서로 다른 파장의 친지질성 염료를 사용하면 세 가지 서로 다른 뇌신경의 중앙 투사를 시각화할 수 있습니다. 본 과정에서는 삼차신경, 설인신경 및 미주신경의 말초 부위에 친지질성 염료를 주입합니다.염료 확산을 위해 배양한 후, 뇌간으로 이어지는 신경 중추 돌기들을 명시야 현미경으로 관찰합니다. 후뇌를 해부하여 평평하게 고정하면, 표지된 세 가지 신경의 중추 돌기 중 일부가 명확하게 나타납니다. 명시야 현미경 하에서 공초점 현미경은 특정 부위가 조명되는 차원성을 제공하며, 세 가지 서로 다른 염료를 사용함으로써 각 세포군으로 구성된 분포를 평가할 수 있습니다.다른 영상들과 비교하여, 여기서는 neuro view를 통해 신생 쥐의 내이 구심성 신경을 추적하였습니다. Prox1에 대한 C2 하이브리드화는 빨간색으로 표시되었으며, 구심성 신경을 시각화하기 위해 anti-tubulin 및 anti-prox1에 대한 면역반응성을 결합하였습니다.또한, 2 µm 두께의 에폭시 수지 절편을 통해 와우의 횡단면 영상을 촬영합니다. 이 절차를 수행할 때는 친지성 염료의 배치 위치를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 신경해부학에 대한 충분한 이해가 이 과정에 도움이 될 것이며, 모든 광민감성 단계에 주의하십시오.이 절차는 교배 횟수와 출판 가능한 데이터를 얻는 데 필요한 시간을 줄이는 동시에, 돌연변이체에서의 공국소화 및 덮개 효과에 관한 정보를 개선할 것입니다.

combining-lipophilic-dye-situ-hybridization-immunohistochemistry

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합 기술은 시각화, 매핑 및 분석들은 바이러스에 감염된 대상으로 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포의 공간적 근접의 이러한 면역 effectors와 대상 사이의 양적 관계의 결정을 가능하게 감염 결과 수 있습니다.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

출처: Jolly, S., et.al. 이중 형광 In situ hybridization과 면역 라벨링을 결합하여 마우스 뇌 섹션에서 3개의 유전자 발현을 검출합니다. J. Vis. 특급 (2016). 이 비디오는 이중 형광 in situ hybridization을 사용하여 마우스 뇌 섹션에서 두 RNA 표적의 발현을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 사용하여 RNA를 순차적으로 검출한 다음 효소 신호 증폭을 통해 감도를 향상시키는 것을 포함합니다. 그 결과 생성된 형광은 조직 내 표적 RNA의 공동 국소화 분석을 가능하게 합니다.

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections(쥐 뇌 절편에서 유전자 발현을 검출하기 위한 이중 형광 혼성화)

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

특정 세포 유형에 대한 유전자 발현을 국소화하는 것은 특정 항체가 없기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 이중 형광 RNA in situ hybridization과 immunostaining을 결합하여 유전자 발현을 동시에 삼중 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

교 잡 프로토콜 설명된 RNA 제자리에 전체 초파리 배아 또는 해 부 조직에서 RNA의 검출을 허용 한다. 96-잘 결정 접시와 tyramide 신호 증폭에 사용 하 여, 성적 감지할 수 있습니다 높은 해상도, 감도, 및 처리량, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.

멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

이 프로토콜은 다중 표지 FISH 및 형광 IHC 신호를 달성하는 것을 목표로 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 절편 모두에서 형광 in situ hybridization(FISH)과 형광 면역조직화학(IHC)을 결합하는 방법을 설명합니다. IHC는 세포질 및 막 부착 단백질을 표적으로 삼았습니다.

Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

이 기사에서는 이미지 분석 및 공간 분석과 결합된 수동 티라마이드 신호 증폭(TSA) 다중 면역형광(mIF)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 슬라이드 스캐너에 따라 슬라이드당 2-6개의 항원을 염색하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 섹션과 함께 사용할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

이 프로토콜은 망막의 시냅스 회로 및 단백질 국소화를 탐색하는 데 중점을 두고 면역전자 현미경을 사전 삽입하는 세부 단계를 간략하게 설명합니다.

Investigating retinal circuits and molecular localization by pre-embbedding immunoelectron microscopy (면역전자 현미경 사전 임베딩을 통한 망막 회로 및 분자 국소화 조사)

학습하세요 마우스 조직에서 지질친화성 염료 추적, 현장에서 하이브리드화, 면역조직화학 및 조직학을 결합한 다중 기법 분석. 이 방법은 단일 표본에서 유전자 돌연변이와 형태학적 프로파일을 상관시켜 신경과학 연구에 포괄적인 데이터를 제공합니다.

Lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, Immunohistochemistry, 그리고 조직학

더 많은 동영상 탐색