숙주 상피 세포에서 세포내 브루셀라 아포터스 감염의 고처리량 영상
0 조회수 • 3:43 분 • March 31st, 2026
먼저 선천면역의 핵심 매개체인 인터페론 어댑터 단백질의 발현이 감소하여 브루셀라 감염에 더 취약해진 상피세포부터 시작한다.
배지를 원하는 농도로 녹색 형광 단백질 발현 Brucella abortus(겸성 세포내 병원체)를 포함한 감염 배지로 교체합니다.
박테리아와 숙주 세포 간의 접촉을 촉진하기 위해 원심분리기를 한 후, 박테리아가 내부화할 수 있도록 배양합니다.
세포를 혈청 함유 배지로 세척하고, 항생제로 처리하여 세포외 박테리아를 제거하세요.
더 배양하여 브루셀라 가 세포 내에서 증식할 수 있도록 하세요.
세포를 완충제로 세척하고 파라포름알데히드로 고정시켜 세포 내 구조를 보존하세요.
과도한 고정제를 씻어내세요. 그 후 세제 보충제가 첨가된 완충제를 추가해 세포를 투과시킵니다.
잔여 세제를 씻어내고, DAPI를 넣어 핵을 염색한 뒤 마지막 세척을 수행합니다.
자동 현미경을 사용하여 숙주 상피세포 내 브루셀라 감염의 고처리량 이미지를 획득합니다.
자동 플레이트 와셔를 사용해 형질전환 배지를 감염 배지 50마이크로리터로 교환합니다. 후드 내부에서 판을 원심분리기 케이지로 옮기고, 384웰 판을 400g 4도 섭씨로 20분간 원 심분리합니다.
그 후 파라필름을 사용해 플레이트를 밀봉하고, 37도 섭씨와 5%CO2 상태로 예열된 알루미늄 플레이트 위에 4시간 동안 배양합니다. 자동 플레이트 세척기와의 배양 후에는 10% FCS가 포함된 DMEM에 100 마이크로그램/밀리리터의 겐타미신 또는 GM을 사용하여 세포를 세척하여 세포외 박테리아를 비활성화합니다. 그 후 파라필름으로 플레이트를 밀봉한 뒤, 인큐베이터 내 예열된 알루미늄 플레이트 위에 다시 40시간 더 놓아 엔드포인트 분석을 진행합니다.
셀을 고정하려면 먼저 PBS를 사용해 웰을 세척하세요. 그 후 PBS를 3.7% PFA 50마이크로리터와 0.2몰 HEPES에 pH 7.4에서 교환하고, 실온에서 20분간 배양합니다.
배양 후에는 고정 매체를 교환하기 위해 PBS 50마이크로리터를 사용하세요. 자동 플레이트 세척기로 샘플을 염색하려면, 먼저 0.1% Triton X-100 50마이크로리터를 PBS에 10분간 사용해 세포를 투과시킵니다.
PBS로 세포를 세 번 세척한 후, 50마이크로리터의 PBS와 DAPI 1밀리리터당 1마이크로그램을 추가하고 실온에서 30분간 배양합니다. 그 후 PBS를 사용해 세포를 세 번 세척한 후 빛으로부터 보호하세요. 판을 자동 현미경으로 옮겨.
개요
이 프로토콜은 숙주 상피 세포 내 Brucella abortus 감염의 고처리량 이미징 방법을 설명합니다. 이를 통해 연구자는 감염 과정을 시각화하고 분석함으로써 Brucella의 병원성에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 미생물학
- 병원체-숙주 상호작용
- 세포생물학
배경
- Brucella abortus는 통성 세포 내 병원체입니다.
- 이의 감염 메커니즘을 이해하는 것은 치료 전략을 개발하는 데 매우 중요합니다.
- 고처리량 이미징은 감염 역학의 대규모 연구를 촉진할 수 있습니다.
- 숙주 세포의 감수성은 선천 면역 인자를 감소시킴으로써 조절될 수 있습니다.
연구 목적
- Brucella abortus의 세포 내 감염 과정을 시각화합니다.
- 숙주 세포 인자가 감염 감수성에 미치는 영향을 평가합니다.
- 박테리아 병원성 연구를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
사용된 방법
- GFP를 발현하는 Brucella abortus를 이용한 상피세포 감염.
- 세포 외 박테리아를 제거하기 위한 항생제 사용.
- 자동 현미경을 이용한 고효율 이미징.
- 핵 시각화를 위한 세포 고정 및 염색.
주요 결과
- 본 프로토콜은 감염된 세포를 준비하고 이미징하는 단계를 보여줍니다.
- 최적의 결과를 얻기 위한 특정 시약 및 조건의 사용법을 설명합니다.
- 고속 대량 이미징을 통해 여러 샘플을 동시에 분석할 수 있습니다.
- 결과를 통해 Brucella abortus의 세포 내 행동에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.
결론
- 이 방법은 호스트 세포 내의 Brucella 감염을 상세하게 관찰할 수 있게 합니다.
- 다양한 처리가 감염 역학에 미치는 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
- 이 접근 방식은 새로운 치료법 개발에 도움이 될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 고처리량 이미징 프로토콜은 세포 내 세균 감염 모델에서 숙주-병원체 상호작용의 체계적인 조사를 가능하게 합니다. 정의된 유전적 섭동 하에서 상피 세포 내 Brucella abortus 복제를 정량화함으로써, 항균제 발굴 프로그램의 타겟 검증 및 메커니즘적 리스크 감소를 지원합니다. 이 분석 포맷은 숙주 지향적 치료제 우선순위 선정 및 경로 중심의 리드 물질 발굴 노력을 위한 예측 신뢰도를 제공합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 세포질 DNA 감지 경로와 세포 내 박테리아 복제 표현형을 연결함으로써 치료 가설을 규명합니다.
- 운영적 가치: STING과 같은 선천 면역 매개체의 siRNA 매개 넉다운을 통해 기능적 타겟 검증을 가능하게 합니다.
- 예측적 가치: 제어된 호스트 인자 조절 하에서 감염 역학을 정량화함으로써 포트폴리오 분류를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 후속 화합물 또는 유전자 스크리닝 캠페인을 위해 검증된 상피 세포 시스템을 준비합니다.
- 운영적 가치: 자동화된 현미경 검사와 정량적 GFP 발현 병원체 추적을 통해 감염 판독 수치를 표준화합니다.
- 확장성 가치: 고함량 호스트 인자 스크리닝을 위한 384-well 포맷 전반에 걸친 플랫폼 재사용을 용이하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 가치: 인수공통 감염병 발병의 핵심 단계인 Brucella 상피 세포 감염을 모델링하여 질환과의 연관성을 유지합니다.
- 전임상 연속성: 초기 발견 메커니즘을 생리학적으로 유의미한 숙주 세포 환경에서의 검증으로 연결합니다.
- 위험 조정 의사결정: 세포 내 생존에 필수적인 숙주 의존성을 밝힘으로써 연구 진전 기준에 대한 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 타겟 가설 검증부터 리드 화합물 발굴, 그리고 전임상 기전 검증에 이르는 신약 발견 연속 과정에 적합하며, 특히 세포 내 병원체 프로그램에 유용합니다.
- 발견 생물학: 병원체의 내포화 및 복제에 영향을 미치는 숙주 인자의 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 표준화된 감염, 항생제 선택 및 고정 워크플로우를 통해 분석 준비 상태를 제공합니다.
- 분석: GFP 신호 및 핵 공동 염색을 통한 단일 세포 분석으로 세포 내 병원체 부하의 정량적 측정값을 생성합니다.
- 중개 연구: 선천성 면역 경로 조절과 감염 결과 사이의 연관성을 밝혀, 바이오마커 기반의 기전 검증을 지원합니다.
- 기업적 재사용: 형광 리포터를 가진 다른 세포 내 세균 또는 바이러스에 적용 가능한 재사용 가능한 이미징 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 특정 선천 면역 기여도를 분리함으로써 숙주-병원체 상호작용의 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 자동화된 액체 핸들링, 표준화된 배양 및 고정 종점 이미징을 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 타겟 검증 초기 단계에서 정량적인 감염 표현형을 제공하여 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 유전적 의존성 데이터를 기반으로 숙주 타겟 항감염제의 위험 조정 우선순위 지정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- BSL-2 조건에서의 세포 배양, transfection 및 세포 내 병원체 취급에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 384-well 포맷에서 GFP 및 DAPI 신호를 획득할 수 있는 자동 현미경 인프라가 필요합니다.
- 감염 타이밍, 항생제 선택 및 고정 프로토콜에 대한 팀 간의 표준화가 필요합니다.
- 일차 배양 세포 또는 분화된 상피 모델에 적용할 경우, 감염 효율 및 독성 제어에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실제적인 제한 사항으로는 형광 병원체 균주에 대한 의존성과 웰 간 transfection 효율의 잠재적 변동성이 포함됩니다.
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마지막 업데이트: 29 8월 2026