Name: 골격근에서 Mitochondrial 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 골격근에서 미토콘드리아를 분리하고 호흡을 측정하는 방법을. 원심분리와 Bradford 분석법을 사용하여 산소 소비량을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 이 기법은 대사 연구에 필수적인 미토콘드리아 기능 분석에 활용됩니다.

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이 작품은 FH 안드레 이드하기 위해 국립 안과 연구소 (R01 EY12998)에서 부여에 의해 지원되었다.

1. 버퍼의 준비 <ol><li> 원심 분리기의 5804R 켜고 4로 설정 ° C. 37 ° C.에 Isotemp 3006D 물 욕조와 세트를 켭니다 </li><li> 근육 분리하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 : <ul><li> PBS : 증류수 (5 정제 / 리터)의 인산 버퍼 호수 (PBS) 정제를 디졸브. 잘 섞는다. </li><li> PBS 추가로 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) : 100 ML 솔루션을 준비하려면, PBS의 98 ML 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2 ML를 추가합니다. </li><li> 8X Mitochondria 버퍼 : 0.6의 최종 농도 M, 자유 지방산 400 MG에 대한 자당의 10.28 g 소 혈청 0.8 %의 최종 농도, 160 mm의 최종 농도에 대한 HEPES의 2.08 g, pH를위한 (BSA) 알부민 증류수로 50 ML에 7.4와 QS. </li><li> 절연 버퍼 1 (IB1가) : 10-10 mm의 최종 농도, 0.392-215 mm의 최종 농도를위한 D - mannitol의 G, 8X mitochondria 버퍼, 산도의 1.25 ML 7.4 및 QS 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 μl 추가 증류수와 ML. </li><li> 절연 버퍼 2 (IB2가) 10-3 mm의 최종 농도, 0.392-215 mm의 최종 농도를위한 D - mannitol의 G, 8X mitochondria 버퍼, 산도의 1.25 ML 7.4 및 QS 500 MM의 EGTA 60 μl 추가 증류수와 ML. </li><li> 실험 버퍼 (EB)는 :의 최종 농도 5 mm의 최종 농도, 215 mm의 최종 농도를위한 D - mannitol의 0.392 g, 2.5 mm의 25 μl KH 2 PO 4 500 MM MgCl 2 100 μl 추가 6.25 μm의 20 μm의의 최종 농도 100 MM EGTA 2 μl, mitochondrial 버퍼, 산도 7.4과 QS 증류수 10 ML에의 1.25 ML. </li></ul></li></ol> 2. 근육 절연 <ol><li> 얼음 양동이에 세 10 ML의 비커, 포터 - Elvehjem 조직 그라인더와 얼음 악기 / 용품 기타 필요한 넣어. 모든 실험을하는 동안 얼음처럼 차가운 유지합니다. </li><li> 완료 온수 욕조에 얼음 양동이와 EB에 IB1 및 IB2를 놓습니다. </li><li> 세 10 ML 비커에 다음 솔루션은 추가한다 : <ul><li> 비커 1 PBS 10 ML </li><li> 비커 2 : PBS / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 ML </li><li> 비커 3 : IB1 3 ML </li></ul></li><li> 편안하게 같은 지역 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인을 쥐를 죽여. </li><li> 신속, 골격근의 250-500 밀리그램을 분리 비커 1 린스, 다음 비커 2 전송할 수 있습니다. </li></ol> 3. 균질 / Mitochondrial 절연 <ol><li> 비커 3 근육을 전송하고 가늘게 가위로 근육을 말하다. </li><li> 포터 - Elvehjem 균 질기에 대한 해결책을 전송합니다. 항상 얼음에 튜브를 유지 전동 유봉 (드릴 언론 작업을 다하겠습니다) 10 번 사용하여 근육을 균질. </li><li> 4 10 분 700g ° C.에 사전 냉장 2 ML의 microcentrifuge 튜브와 원심 분리기에 homogenate 전송 </li><li> 새로운 사전 차게 microcentrifuge 관에 뜨는 전송합니다. 펠렛 폐기하십시오. </li><li> 4 10 분 10,500그램에 뜨는 원심 분리기 ° C. </li><li> 새로운 사전 차게 microcentrifuge 관 및 레이블 SN1 (뜨는 숫자 1)와 근육의 유형에 뜨는 전송합니다. </li><li> IB2 500 μl의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 4 10 분 10,500그램에서 원심 분리기 ° C. </li><li> 새로운 사전 차게 microcentrifuge 관 및 레이블 SN2 (뜨는 번호 2) 근육의 종류에 뜨는 전송합니다. </li><li> IB2 100 μl의 최종 mitochondrial 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 몇 초 동안 minifuge에 다시 스핀 최종 mitochondrial 현탁액. 펠렛있다면, 새로운 사전 차게 microcentrifuge 관에 뜨는를 전송하여 펠렛을 삭제. </li><li> 브래드 포드 분석 8을 사용 단백질 농도를 결정합니다. </li></ol> 4. 전극 보정 참고 : mitochondrial 격리하는 동안 완벽한 전극 교정. <ol><li> 250 ML 플라스크에 증류수 100 ML을 추가합니다. 대기 가스와 물을 평형 20 분 동안 적극적으로 저어. </li><li> Oxygraph 전극에 KCl 50 % 몇 방울을 추가합니다. </li><li> 전극 위에 블루 Rizla 롤링 종이의 작은 조각을 넣으십시오. </li><li> 롤링 종이 위에 PTFE 막 조각을 넣으십시오. </li><li> 반지의 작은 주걱을 사용하여 내부 링을 적용한 다음 전극 홈에서 외륜을 놓으십시오. </li><li> 전극을 연결하고 장비의 나머지 부분 조립 : 큰 플라스틱 링베이스, mitochondrial 회의소와 물 호스합니다. </li><li> Oxygraph 박스의 전원을 켜고 Oxygraph 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> mitochondrial 챔버에 equilibrated 물을 추가합니다. </li><li> 막대를 저어 60의 속도에 설정 추가합니다. </li><li> 새로운 실험을 시작합니다. </li><li> 교정을 클릭한 다음 상자 1 액상 보정. 37 온도를 변경하는 것은 ° C 및 "확인"을 두 번 누릅니다. </li><li> "OK"를 "무시"변경을 클릭하고 질소 가스 탱크를 열 때. </li><li> 연결된 플레이스 팁챔버에 질소 탱크와 제로 산소를 설정합니다. 그것이에서 스위치 때 "확인"을 클릭 "무시." </li><li> 물을 기음과 mitochondrial 방으로 EB 버퍼 500 μl를 추가합니다. </li><li> 플런저와 인감 챔버. </li><li> 여러 개의 상자를 사용하여 반복 박스 2의 보정을위한 11-15 단계를하십시오. </li></ol> 5. Mitochondrial 호흡 <ol><li> 새로운 실험을 시작, 그것이 신호를 안정화하기 위해 약 1 분간 실행하자. </li><li> 150 각 챔버에 μg, 마크 이벤트 mitochondrial 정지 필요한 볼륨 (3.11 단계)을 추가하고 1 분 해보죠. </li><li> 10 μl를 추가 따뜻한 250 mM/125 MM 5 mM/2.5 mm의 최종 농도에 대한 글루 탐 산염 / malate. 마크 1 분간 실행하자. 이 상태 2로 정의됩니다. </li><li> 150 μm의, 마크의 최종 농도 10 MM의 ADP의 7.5 μl를 추가하고 30 초 동안 실행하자. 이것은 주 3으로 정의됩니다. </li><li> 10 MM ADP, 마크의 또 다른 7.5 μl을 추가하고 1.5 분 동안 실행하자. </li><li> 1 μm의, 마크의 최종 농도에 대한 차가운 10 MM의 oligomycin 0.5 μl를 추가하고, 3 분 해보죠. 이것은 주 4로 정의됩니다. </li><li> 0.2 μm의, 마크의 최종 농도에 대한 추위 0.1 MM FCCP 1 μl를 추가하고, 3 분 해보죠. 이것은 주 5 말합니다. </li><li> 완료되면 실험을 종료하고 저장합니다. </li><li> Oxygraph 소프트웨어를 사용하여 호흡 속도를 취득. </li><li> 정규화 계수를 입력하십시오 : mitochondrial 단백질 150 μg을 추가하는 경우 정규화 계수는 0.15 것입니다. </li><li> 다른 호흡 상태에 대한 표준 호흡 속도를 계산합니다. </li><li> 주 4로 주 3 나누어 호흡기 제어 비율 (RCR)를 계산합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. mitochondria 골격근의 산소 소비의 추적 대표를 보여줍니다. 전극 신호가 안정화되면 mitochondria 샘플 Oxygraph 챔버에 추가됩니다. 상태 2 호흡은 조미료와 malate를 추가로 시작합니다. ADP의 또한 주 3 호흡을 정의, 산소 소비를 증가시킵니다. ATP synthase는 상태의 네 호흡을 얻기 위해 oligomycin의 추가에 의해 차단됩니다. 마지막으로, FCCP는 mitochondrial 호흡 (주 5) 떨어지다에 추가됩니다. 표 1 주에서 2, 3, 4 및 5에 대한 대표적인 산소 소비 속도를 보여줍니다. 호흡 조절 비율 (RCR)가 각 실험에 대해 계산됩니다. RCR은 ≥ 4 가능한 mitochondria 준비의 증거로 간주됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 미국 </td><td> 정규 요금 </td></tr><tr><td> 상태 2 </td><td> 34.74 </td></tr><tr><td> 주 3 </td><td> 153.40 </td></tr><tr><td> 주 4 </td><td> 16.49 </td></tr><tr><td> 주 5 </td><td> 143.70 </td></tr><tr><td> RCR </td><td> 9.30 </td></tr></tbody></table> 표 1. Mitochondrial 호흡 속도. mitochondria 골격근에서 Representativeoxygen 소비 속도. 값이 챔버에 추가 mitochondria의 크기로 정규화됩니다. 호흡 조절 비율 (RCR)는 주 4에 의해 상태가 3 나눔으로써 결정됩니다. RCR ≥ 4 가능한 mitochondria 준비를 나타냅니다.

<ol><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).</li>
<li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li>
<li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria%3A+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 골격 근육에서 가능한 mitochondria를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 수율에 문제가있는 경우, 프로토콜은 얼음에 30 분 PBS/10mM EDTA/0.01 %의 트립신 5 ML에서 분리된 근육을 잠복기로 수정할 수 있습니다. 트립신 완벽한 근육 소화를 확인하기 위해서는 근육이 완전히 다진해야합니다. 30 분 부화 후, PBS/10mM EDTA/0.01 %의 트립신 솔루션은 완전히 절연 버퍼 1 (IB1) 3 ML로 교체해야합니다. 또한, 트립신의 사용은 호흡 프로토콜 중 일부 mitochondrial 기판을 방해할 수 있습니다. 트립신을 사용하는 좋은 mitochondrial 준비에서이 프로토콜 결과에 사용된 모든 기판. 마우스 골격 근육 들어, 두 다리에서 gastrocnemius 근육을 결합하거나, 전체 다이어프램을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 쥐의 골격 근육 들어, gastrocnemius 또는 피임기구의 작은 부분 충분합니다. 과도한 근육 질량은 낮은 ...

<table><tbody><tr><td>95% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 혼합 가스</td><td>지역 가스 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;#8242;-diphosphate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Blue Rizla Paper</td><td>Hansatech</td><td>890101</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 단백질 정량 분석 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804R 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>압축 질소</td><td>지역 가스 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0728</td><td></td></tr><tr><td>Free fatty acid bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006D</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>수컷 Sprague Dawley 랫드</td><td>Harlan Laboratories</td><td>300-500g</td><td></td></tr><tr><td>Malic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9138</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge 소형 원심분리기</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C1301P</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>산소 전극 디스크</td><td>Hansatech</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus V1.01 소프트웨어</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 미터</td><td>Mettler Toledo</td><td>1225506149</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8416</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem 균질기</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0.0125mm &amp;#215; 25mm) 멤브레인</td><td>Hansatech</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>SKIL 3320 드릴 프레스</td><td>철물점</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr></tbody></table>

골격근에서 mitochondrial 절연

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria 세포의 삶과 죽음을 제어 organelles 있습니다. 그들은 주요 신진 대사 반응에 참여, ATP의 대부분을 종합하고, 폭포 2,3 신호의 숫자를 조절. 과거 및 현재 연구는 간, 뇌 및 4,5 마음으로 쥐, 생쥐 조직에서 mitochondria 고립있다. 최근에는 많은 연구자들은 골격 근육에서 mitochondrial 기능을 공부에 집중했습니다. 여기서 우리는 골격 근육 6 mitochondria의 격리를 위해 성공적으로 사용한 방법을 설명합니다. 우리의 절차는 모든 버퍼와 시약은 신선했고 골격근의 250-500에 대한 MG 필요한 것을 요구합니다. 우리는 쥐, 마우스 gastrocnemius 및 격막으로부터 격리 mitochondria을 공부하고, 쥐 extraocular 근육. Mitochondrial 단백질 농도는 브래드 포드 분석과 측정됩니다. mitochondrial 샘플 준비 중 및 기능 연구가 비교적 짧은 시간 (~ 1 시간) 이내에 수행되어야 얼음처럼 차가운 유지하는 것이 중요합니다. Mitochondrial 호흡은 37 클라크 타입 전극 (Oxygraph 시스템) ° C 7 polarography를 사용하여 측정됩니다. 산소 전극의 교정이 프로토콜의 핵심 단계이며, 그것은 매일 수행되어야합니다. 절연 mitochondria는 (150 μg) 실험 버퍼 (EB)의 0.5 ML에 추가됩니다. 상태 2 호흡은 글루 탐 산염 (5mM)와 malate (2.5 ㎜)를 추가로 시작합니다. 그런 다음, 아데노신 diphosphate (ADP) (150 μm의)는 주 3 시작에 추가됩니다. Oligomycin (1 μm의), ATPase의 synthase의 차단은 주 4 추정하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 카르보닐 청산 가리 P - [trifluoromethoxy]이 - 페닐 - hydrazone (FCCP, 0.2 μm의)가 5 measurestate 추가하거나, 호흡 6 uncoupled입니다. 호흡 조절 비율 (RCR), 주 4 주 3의 비율은 각 실험 후 계산됩니다. RCR ≥ 4 가능한 mitochondria 준비의 증거로 간주됩니다. 요약, 우리는 생화학 (예를 들어, 효소 활동, 면역, proteomics) 및 기능 연구 (mitochondrial 호흡)에서 사용할 수있는 골격 근육에서 가능한 mitochondria의 분리를위한 방법을 제시한다.

이 프로토콜은 골격 근육에서 격리 mitochondria의 호흡을 연구하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 Scorrano에서 적응했다<em&gt; 외.</em&gt; (2007). mitochondrial 절연 절차는 약 2 시간이 필요합니다. mitochondrial 호흡은 약 1 시간에 완료할 수 있습니다.

골격근에서 Mitochondrial 절연

미토콘드리아는 세포의 생사와 사멸을 조절하는 세포소기관입니다. 미토콘드리아는 핵심 대사 반응에 참여하고, 대부분의 ATP를 합성하며, ...

이 절차의 전반적인 목표는 미토콘드리아를 분리하고 미토콘드리아 호흡을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 Sprague Dawley 쥐로부터 골격근을 분리함으로써 수행됩니다. 그 다음, 근육을 균질화하고 원심분리를 통해 미토콘드리아를 분리합니다.그 후 Bradford assay를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 마지막으로, 폴리그라피(polygraphy)를 통해 미토콘드리아 호흡을 측정합니다. 결과적으로, 서로 다른 미토콘드리아 호흡 상태에 따른 산소 소비량을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 미토콘드리아 기능에 대한 다양한 중재의 효과와 같이 골격근 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 골격근 대사에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라 간, 뇌, 신장 또는 거의 모든 조직과 같은 다른 장기에도 적용될 수 있습니다. 절차를 시작하기 전, 골격근을 분리하기 위해 P-B-S, 10 millimolar EDTA가 첨가된 P-B-S, 8배 농도의 미토콘드리아 분리 완충액(mitochondria buffer isolation buffer 1 또는 IB 1), 분리 완충액 2(IB 2) 및 실험 완충액(eb)을 준비하십시오.지침은 함께 제공된 서면 프로토콜을 참조하십시오. 다음으로, 원심분리기를 켜고 온도를 4°C로 설정하십시오. 항온수조를 켜고 온도를 37°C로 설정하십시오.적당한 크기의 버킷에 10 mL 비커 3개, 포터 엘보우(potter elbow), 조직 분쇄기(tissue grinders), 소형 수술용 가위, 그리고 10 µL 마이크로 원심분리 튜브를 넣고 얼음 위에 둡니다. 모든 도구와 시약은 실험 전 과정 동안 차갑게 유지해야 합니다. IB 1과 IB 2는 얼음 위에 두고, EB는 온수욕(warm water bath)에 넣습니다.그런 다음 얼음 위에 놓인 세 개의 비커에 다음 용액들을 각각 추가합니다. 비커 1에는 10 milliliters의 PBS를, 비커 2에는 10 milliliters의 P-B-S-E-D-T-A를, 비커 3에는 3 milliliters의 ib. 1을 넣습니다. 지역 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인한 절차에 따라 쥐를 안락사시킵니다.다음으로 핀셋과 mayo Clinic 가위를 사용하여 골격근 250 to 500 milligrams를 신속하게 분리합니다. 이를 beca one으로 헹군 후, beca two로 옮겨 근육을 균질화

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

광근의 lateralis의 조직 검사, 정제 미토콘드리아의 준비, 호흡계 프로파일 링하는 방법이 설명되어 있습니다. 작은 부피의 근육 사용은 임상 연구 애플리케이션이 기술에 적합하다.

경피적 바늘 생검에 의해 획득 골격근 조직에서 고립 된 미토콘드리아의 준비 및 호흡계 평가

여기에서는 소량의 마우스 골격근에서 고품질의 정제된 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 보고된 방법의 변형을 제시합니다. 이 절차는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석 중에 높은 기능으로 호흡하는 고도로 결합된 미토콘드리아를 생성합니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

여기서, 마취된 돼지에서 대퇴사두근 표본을 채취하고 미토콘드리아를 차등 원심분리로 분리합니다. 그런 다음 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I, II 및 IV의 호흡수를 고해상도 호흡 측정을 사용하여 결정합니다.

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

미토콘드리아는 골격 근육에서 높은 수준의 페노티픽 가소성을 나타내는 주요 대사 세포기관입니다. 사이토솔에서 단백질의 수입은 세포기관 생물 발생을 위한 중요한 통로입니다, 망상의 확장 및 미토콘드리아 기능의 유지에 필수적입니다.  따라서, 단백질 수입은 세포 건강의 기압계 역할을 한다.

골격 근육 미토콘드리아의 단백질 수입 능력 측정

여기에서는 마우스 골격근으로부터의 미토콘드리아를 분리하는 상세한 방법과 마이크로플레이트 기반 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모율(OCR)에 의한 호흡의 후속 분석을 설명한다. 이 파이프 라인은 미토콘드리아 대사에 대한 여러 환경 또는 유전 적 개입의 효과를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리

이 프로토콜은 소량의 샘플만 사용할 수 있는 경우 호흡기 초복합체를 분석하는 기술을 설명합니다.

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) 

미토콘드리아에 대한 생체 에너지 및 대사체 연구는 많은 질병에서 미토콘드리아의 다면적인 역할을 밝혀냈지만, 이러한 세포 소기관에 대한 분리 방법은 다양합니다. 여기에 자세히 설명된 방법은 여러 조직 소스에서 고품질 미토콘드리아를 정제할 수 있습니다. 품질은 호흡 조절 비율 및 고해상도 호흡 측정법으로 평가된 기타 지표에 의해 결정됩니다.

설치류 심장 조직으로부터 강력한 미토콘드리아 분리 

마이크로 해부 explants 기술은 골격 근육 줄기 세포의 원천으로 청소년, 성인이나 배아 근육에서 proliferative 골격근 세포를 분리를위한 강력하고 안정적​​인 방법입니다. 유니 클리,이 세포는 clonally 생체내 이식에 사용되는 골격 근육 줄기 세포 라인을 생산하기 위해 파생되었습니다.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

효소 분리, fibro / adipogenic 및 murine 골격근에서 myogenic progenitors의 유동세포계측법에 의해 표면 라벨 및 정화를위한 방법.

골격근에서 Progenitors의 정화

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

배우세요 골격근에서 미토콘드리아를 분리하고 호흡을 측정하는 방법을. 원심분리와 Bradford 분석법을 사용하여 산소 소비량을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 이 기법은 대사 연구에 필수적인 미토콘드리아 기능 분석에 활용됩니다.

골격근에서 Mitochondrial 절연

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