박테리아 감염 탐지를 위한 잎에서 총 DNA 추출

먼저 체관부가 박테리아 병원체에 감염된 차가운 잎 조직 조각부터 시작하세요.

DNA 분해 뉴클레아제의 활성을 억제하기 위해 액체 질소가 섞인 절구에 조각을 넣으세요.

세포를 기계적으로 교란시키고 세포 내 성분을 방출하기 위해 분쇄합니다.

차가운 주걱으로 가루를 옮기고, 용해 버퍼를 추가한 뒤 현탁액을 소용돌이 제거하세요.

식물 핵과 박테리아 세포를 분해하기 위해 배양하여 DNA와 RNA를 방출하고 단백질을 변성시킵니다.

RNase를 추가하고 인큐베이션하여 RNA를 분해합니다.

단백질 침전 버퍼를 응집된 단백질에 첨가한 후, 원심분리하여 분리합니다.

식물성 및 박테리아 DNA가 포함된 상청액을 이소프로판올로 옮겨 DNA를 실처럼 실처럼 침전시킵니다.

원심분리기를 사용해 DNA를 채취하고 상청액을 버립니다.

에탄올로 세척한 후 원심분리기로 세척한 후 상원액을 버리세요.

DNA를 자연 건조한 후 재수화 버퍼를 추가한 뒤 배양하여 녹여내세요.

DNA 샘플은 이제 PCR 기반 병원체 검출을 위한 준비가 완료되었습니다.

깨끗한 가위로 감귤나무에서 신선한 잎을 통째로 잘라내어 깨끗한 플라스틱 샌드위치 봉지에 넣으세요. 그 다음, 절구와 절구에 액체 질소를 소량 첨가해 냉각합니다. 다음으로, 가위로 잎 조직의 약 1평방인치 크기의 작은 조각을 잘라냅니다.

잎 조각을 절구에 넣어 즉시 얼리세요. 모르타르로 잎 조직을 빠르게 갈아 액체 질소가 증발할 때까지 반복하고, 미세한 녹색 가루가 남습니다. 다음으로, 금속 주걱을 액체 질소에 10초에서 15초 정도 식힙니다. 그 다음 차가운 주걱으로 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 담긴 모르타르의 분쇄 조직을 퍼냅니다. 1000마이크로리터 피펫을 사용해 600마이크로리터의 핵 용해액을 샘플에 첨가하세요. 그 다음 샘플을 1초에서 3초 동안 소용돌이로 돌리세요. 튜브를 섭씨 65도에서 15분간 물욕에 넣어 부화시킵니다.

배양 기간이 끝나면 10마이크로리터 피펫을 사용해 용해액에 RNase 용액 3마이크로리터를 첨가하여 RNA를 제거합니다. 그 다음, 튜브 안의 내용을 두다섯 번 뒤집어 섞습니다. 캐비닛 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 15분간 배양하세요. 15분 후, 샘플에 200마이크로리터의 단백질 침전액을 추가합니다. 고속으로 20초 동안 튜브를 소용돌이로 돌려.

다음으로 샘플을 13000g에서 3분간 원심 분리합니다. 원심분리 과정 중에는 상온에서 유지된 600마이크로리터의 이소프로판올을 새로운 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 추가합니다. 원심분리가 끝난 후, 조심스럽게 상청액을 원심분리관에서 이소프로판올이 들어있는 관으로 옮깁니다. 펠릿을 버려.

튜브를 뒤집어 DNA가 실처럼 보이게 하세요. 다음으로 샘플을 13000g 온도에서 실온에서 1 분간 원심분리합니다.

원심분리 후 상청액을 디캔팅하세요. 그 다음 70% 에탄올 600마이크로리터를 펠릿에 첨가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 펠릿을 세척하세요. 튜브를 13000g에서 1분간 원심분리합니다. 원심분리가 끝난 후에는 상정액을 조심스럽게 흡인하세요. 그 후 뚜껑을 열어 흡수성 종이에 넣은 튜브를 뒤집어 15분간 자연 건조시킵니다. 건조되면 펠릿에 100마이크로리터의 DNA 재수화 용액을 추가하세요. DNA 현탁물을 65도 섭씨에서 1시간 동안 물욕에 보관하세요.