Name: Nanoformulated Antiretroviral 약물의 혈액 본 대식 세포 캐리지를위한 방법 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 46 s
Description: 배우세요 항레트로바이러스 나노입자 제조 및 대식세포 내 흡수·유지·방출 메커니즘을 평가하는 방법을. 이 기술은 HIV 치료를 위한 나노의학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

작품은 국립 보건원에서 보조금 1P01DA028555 - 01A1, 2R01 NS034239, 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15635, P01MH64570 및 P01 NS43985 (HEG)을 지원했다. 저자는 원고와 뛰어난 그래픽과 문학 지원 중요한 읽기위한 양 로빈 테일러 감사합니다. 우리는 그의 축축한 밀링 전문 스티브 Grzelak 감사하고 싶습니다. 우리는 또한 검사 및 전송 전자 현미경 이미지를 공급 네브라스카 - 링컨 전자 현미경의 핵심 시설의 대학의 박사 한 첸 감사하고 싶습니다. 마지막으로, 우리는 살아 공촛점 현미경을 사용하여 그녀의 전문 메간 말쿼트 감사하고 싶습니다.

<ol><li>Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+and+propagation+of+human+immunodeficiency+virus+on+recombinant+colony-stimulating+factor+1-treated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes.</a> J Exp Med. 167 (4), 1428-1441 (1988).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+macrophage-based+nanoparticle+platform+for+antiretroviral+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery.</a> Blood. 108 (8), 2827-2835 (2006).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+investigations+for+the+morphologic%2C+pharmacokinetic%2C+and+anti-retroviral+properties+of+indinavir+nanoparticles+in+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages.</a> Virology. 358, 148-158 (2007).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+delivery+of+nanoformulated+antiretroviral+drug+to+the+brain+in+a+murine+model+of+neuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS.</a> J Immunol. 183 (1), 661-669 (2009).</li>
<li>Nowacek, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoformulated+Antiretroviral+Drug+Combinations+Extend+Drug+Release+and+Antiretroviral+Responses+in+HIV-1-Infected+Macrophages%3A+Implications+for+NeuroAIDS+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics.</a> J Neuroimmune Pharmacol. , (2010).</li>
<li>Nowacek, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoART+synthesis%2C+characterization%2C+uptake%2C+release+and+toxicology+for+human+monocyte-macrophage+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomed%22%5BJournal%5D)">NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery.</a> Nanomed. 4 (8), 903-917 (2009).</li>
<li>Kalter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HIV+replication+in+macrophage+colony-stimulating+factor-treated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes.</a> J Immunol. 146 (1), 298-306 (1991).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

NanoART는 HIV - 1 치료제를 개선하기 위해 설계되었습니다. 우리는 임상 사용하기 위해 이러한 기술을 개발하는 첫 단계로서 nanoformulated 약물 개발을위한 실험실 테스트 시스템으로 단핵구 - 대식 세포 기반 약물 전달 시스템을 제안합니다. 우리의 과거 작품은 시스템이 그러한 응용 프로그램 5,6를위한 실용적입니다 것으로 나타났습니다. 현재 보고서에서, 우리는 일반적으로 사용되는 HIV - 1 치료 (; ritonovir, RTV, efavirenz, EFV 및 atazanavir, ATV indinavir, IDV)의 NP를 합성하는 방법을 그림 있습니다. 이것은 서부 유럽 표준시 밀링, 균질화 및 ultrasonication에 의해 달성되었다. 중요한 것은, 우리의 접근 방법은 크기, 모양 및 충전 5,6 등 nanoART 물리적 특성의 변경을 허용합니다. 계면 활성제의주의를 선택함으로써, 하나는 매우 긍정으로 중립에 매우 부정에서 입자의 요금을 제어할 수 있습니다. 처리 시간과 강도를 변경하여, 하나는 크기를 제어하고 ≥ 3 μm의 한 ≤ 200 nm의 작은 또는 큰 입자를 렌더링 수 있습니다. 입자의 모양도 있지만, 다른 물리적 특성을보다 낮은 범위를 조절할 수 있습니다. 멀티 양면 기하학적 형태가 서부 유럽 표준시 밀링 또는 균질 통해 생산 수 있지만 예를 들어, 구형 입자는 고분자와 sonication을 통해 만들 수 있습니다. 습식 밀링 및 균질 다르게 모양의 입자를 생산하지만,이 프로세스는 분류 방법에 의존하고 직접에 대해 제어할 수 없습니다. 제조 방법의 이러한 특성은 연구가 쉽게 정확한 설계 사양에 nanoART 생산 설정할 수 있습니다. nanoART의 물리 특성들이 안정성 모두에 강력한 영향을 어떻게 그들이 세포와 상호 작용 때문에 이것은 극히 중요합니다. 예를 들어, 크기가 약 1 μm의 아르 nanoART은 강한 긍정적인 요금을 가지고 있고, multisided 기하학적인 형태가 더 빠르게 한 번 세포 내부에는 더 안정 macrophages, 의해 촬영, 그리​​고 오랜 기간 동안 출시되는 것으로 나타났습니다 시간 6. 테스트 nanoART하는 방법은 최대 이동하는 입자 &#39;능력의 간단한 검사를 허용하는 개발 보존하고, 바이러스 복제를 억제하기 위해 용량 이외에, macrophages, HIV - 1의 원칙 대상 세포 중 하나에 의해 발표되었습니다. 이것은 하나가 쉽게 실적을 기반으로 nanoART 차별화 인간 사용 nanoART을 개발의 효율성과 속도를 모두 증가, 따라서, 생체내 모델의 성공의 가장 좋은 기회를 이들을 확인하실 수 있습니다. 이것은 마우스 골수 macrophages가 nanoART와 전 생체내 장전해서 adoptively 인간화 HIV - 1 감염 생쥐의 중추 신경계를 포함한 활성 감염의 사이트에 여행, 및 릴리스 약물 최대를 위해 할 수 이주로 정맥 주사에 의해 양도 때 표시되었습니다 바이러스성 복제에게 2-4 억제합니다. 또한, 이러한 nanoART로드 세포는 또한 효과적으로 플라즈마에서 바이러스에 감염된 세포의 숫자를 줄일 수 있었다뿐 아니라 CD4 + 세포 2 보호 등 임파선, 비장, 간, 폐. 이러한 연구는 예비 있지만, 셀 중재 nanoART 전달 시스템은 혈액과 감염된 조직 모두에게 약물의 임상 상당한 금액을 배포할 수있다는 것을 보여준다. 때문에 HIV - 1 감염 마우스 연구에서 고무적인 예비 결과, 우리는 현재 추가 임상 사용을위한 nanoART의 잠재력을 테스트하는 유인원 단백질 결핍 바이러스에 감염된 짧은 꼬리 원숭이 모델을 개발하고 있습니다.

테이블에서 사용되는 약어 : IDV : indinavir; RTV : ritonavir, ATV : atazanavir, EFV : effavirenz, PVA : polyvinylalcohol, SDS 나트륨 dodecyl 황산, P188 : poloxamer 188 (또한 Pluronic F68 칭했다), MPEG 2000 DSPE : 메틸 폴리 (에틸렌 - 글리콜) 1,2 - distearoyl - phosphatidyl - ethanolamine; DOTAP : (1 oleoyl - 2 - [6 - [(7 - 니트로 - 21 ,3 - benzoxadiazol - 4 - yl) 아미노] hexanoyl] - 3 - trimethylammonium 프로판), PLGA : 폴리 (락트 - 공동 glycolic 수 소산​​); CTAB : cetyltrimethyl 암모늄 브로마이드, DMEM : Dulbecco의 수정된 이글 중간; MCSF : 대식 세포 콜로니 - 자극 인자, HPLC : 고압 액체 크로마 토그래피, HIV - 1 : 인간 면역 결핍 바이러스 -1

nanoformulated antiretroviral 약물의 혈액 본 대식 세포 캐리지를위한 방법 개발

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

antiretroviral (ART) 약물에 대한 약물 toxicities을 줄이기 위해 또한 제공하면서 Nanoformulated 약물 pharmacodynamics와 생체 이용률을 향상시킬 수 있습니다. 이를 위해, 저희 연구실 예술의 regimens을 단순화하는 nanomedicine의 원칙을 적용하고 준수 및 약물 pharmacokinetics을 개선하면서 같은 toxicities을 줄일 수 있습니다. 제조 nanoformulated ART (nanoART)에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 방법이 표시됩니다. 순수한 약물의 입자 계면 활성제의 지질 코팅의 얇은 층에 의해 캡슐과 서부 유럽 표준시 밀링 또는 고압 균질에 의해 작은 것들로 큰 약물 결정 fractionating에 의해 생산됩니다. 다른 방법으로 무료로 약물은 고분자의 비말에서 일시 중지되었습니다. 본, 마약은 개별 nanosized 방울이 형성되기 전까지는 다음 ultrasonication에 의해 흥분 폴리머 내에 해산합니다. 동적 광 산란 및 현미경 검사는 입자 (입자 크기, 요금과 모양)의 물리적 특성을 특징. 그들의 생물 학적 속성 (세포 이해 및 유지, 세포 독성 및 antiretroviral 효능)이 인간 단핵구 파생 macrophages (MDM)로 결정됩니다. MDM은 정화를위한 원심 elutriation를 사용 leukopacks에서 분리된 인간의 말초 혈액 monocytes에서 파생됩니다. 이러한 혈액을 매개로 macrophages 인간 면역 결핍 바이러스에 nanoART 배포 (HIV)에 감염된 장기 세포 전송기로 사용할 수 있습니다. HIV - 1 치료에 대한 임상 nanoparticles로 사용할 수 antiretroviral 약물의 repackaging하는 준수를 개선하고 적극적으로 질병 결과에 영향을 미칠 수있는 것을 우리는 멋부리다.

indinavir, ritonavir, efavirenz 및 atazanavir의 Nanoparticles 야한 밀링, 균질화 및 ultrasonication를 사용하여 제조되었습니다. 이러한 nanoformulations, 집합 대식 세포 기반 약물 전달을 평가 antiretroviral 치료 (nanoART)를 nanoformulated 칭했다. 단핵구 - 대식 세포의 파생 nanoART의 이해, 유지 및 지속적인 릴리스가 결정됩니다. 이러한 예비 연구 임상 사용 nanoART의 가능성을 제안한다.

Nanoformulated Antiretroviral 약물의 혈액 본 대식 세포 캐리지를위한 방법 개발

나노 제형 약물은 항레트로바이러스(ART) 의약품의 약물 독성을 줄이는 동시에 약력학과 생체 이용률을 개선할 수 있습니다. ...

이 절차의 목적은 결정성 항레트로바이러스 나노입자(이하 nano art)를 제조하고, 이에 대한 세포 내 섭취, 분비 및 항레트로바이러스 특성을 테스트하는 것입니다. 이는 먼저 초음파 균질화 또는 습식 밀링을 통해 항레트로바이러스 약물을 처리함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 역류 원심분리를 통해 일차 단핵구를 분리한 후, nano art 입자의 물리적 특성을 분석하는 것입니다.이들은 대식세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, MCSF)가 포함된 DMEM에서 7일 동안 배양되며, 이는 단핵구 유래 대식세포로의 분화를 유도합니다. 세 번째 단계는 인간 단핵구 유래 대식세포에서 nano art의 섭취, 유지 및 방출을 테스트하는 것입니다. 본 절차의 마지막 단계는 단핵구 유래 대식세포에서 nano art의 in vitro 항레트로바이러스 효능을 테스트하는 것입니다.최종적으로, 세포 내로의 나노 아트의 촉진된 흡수와 서서히 일어나는 방출, 그리고 강력한 항레트로바이러스 효능을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통한 약물 농도 측정과 감염된 배양 상층액 물질의 역전사 효소 활성 측정을 통해 결정됩니다. 안녕하세요, 저는 네브래스카 대학교 메디컬 센터 Howard Gelman 박사님 연구실의 박사후 연구원 Hanta Aldi입니다.우리가 제시하는 방법들은 세포 기반 약물 전달 시스템을 이용해 어떻게 중개 연구 활동을 전개할 수 있는지 등 나노 의학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 반감기가 연장된 나노 제형의 항레트로바이러스 요법을 사용함으로써 달성할 수 있습니다. 우리의 연구는 임상적 사용을 위한 나노 ART의 잠재적 활용 가능성을 뒷받침합니다.안녕하세요, 저는 Carol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratory에서 연구 중인 MD PhD 과정 학생 Ari Noche입니다. Gendelman 박사님의 지도하에, 저희가 여기서 보여드릴 기술의 함의는 항레트로바이러스 요법까지 확장됩니다. 나노 제형 화합물은 생체 이용률과 약동학을 동시에 개선하는 동시에 약물 관련 부작용을 줄일 수 있기 때문입니다. 임상적으로 사용 가능한 항레트로바이러스 약물을 나노입자로 재포장함으로써, 환자의 복약 순응도를 높이고 질병 결과에도 긍정적인 영향을 미칠 수 있을 것입니다.안녕하세요, 저는 Howard Gendelman 박사입니다. 저는 임상 과학자이자 교수이며, 이곳 네브래스카 대학교 메디컬 센터(University of Nebraska Medical Center) 약리학 및 실험 신경과학과 학과장을 맡고 있습니다. 저희의 전반적인 목표는 항레트로바이러스 약물을 단순화하여 접근성을 높이고, 생체 내 분포와 약동학적 특성을 개선하는 것입니다.이제 Ari와 Sean이 연구실로 안내하여 이러한 나노입자의 제조 및 개발 과정을 보여드릴 것입니다. Nebraska Medical Center 대학 내에서의 임상적 유용성 및 개발 과정입니다. 습식 밀링(wet milling)을 통해 나노 입자를 제조하려면, 먼저 나노 제형 제작에 사용될 약물 결정과 다양한 계면활성제를 정량한 후, T 18 ultra Turrax 믹서를 사용하여 10 mM HEPES 버퍼(pH 7.8)에 완전히 분산될 때까지 혼합합니다. 연속 밀링을 위한 제형 내 약물 함량은 1%에서 2% 사이여야 합니다.칠러와 컴프레서가 켜져 있고 출력 압력이 약 100 PSI인지 확인하십시오. 이제 분쇄 매질을 탱크에 넣을 수 있도록 준비하고 분쇄 챔버에 비드 50 milliliters를 추가합니다. 깔때기를 사용하여 기계적 씰의 누출을 방지하기 위해 나사산이나 분쇄 챔버 외부 어디에도 비드가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 이제 밀링 챔버의 O-링이 제자리에 있는지 확인하십시오.그 다음 적절한 스크린 메쉬 크기를 선택하고 너트를 조여 뚜껑을 고정하십시오. 스크린 메쉬 크기는 비드 크기의 최소 절반 이상이어야 합니다. 연속 밀링 중에 제품이 필터를 막는 것을 방지하려면 큰 스크린 메쉬 크기를 사용하십시오.분쇄 챔버를 내린 후, 다양한 양의 계면활성제가 포함된 약물 현탁액을 제품 투입구에 첨가합니다. 현탁액의 최소 부피는 100 milliliters여야 합니다. 이는 밀링 챔버의 과열을 방지하고 부품 마모를 줄여 비드 오염을 피하기 위함입니다.다음으로 펌프를 가동하십시오. 제어 장치를 사용하여 제형에 맞는 유속으로 조절하십시오. 그런 다음 교반기를 켜고 제어 장치에서 속도를 조정하십시오.속도는 분당 600회전에서 4,320회전까지 높일 수 있습니다. 마이크로 서(micro sur)의 경우, 분쇄 챔버 상단에 부착된 온도계를 사용하여 온도를 모니터링함으로써 과열이 발생하지 않도록 확인하십시오. 이제 다양한 속도와 유량으로 샘플을 밀링하고, 분산광 산란법 기반의 malvern zeta sizer를 사용하여 크기 및 전하 측정을 위해 제형의 소량 분주액(약 1 mL)을 취하십시오.원하는 크기가 되면 제어 장치를 사용하여 밀링을 중단하고, 펌프를 켠 상태에서 약물이 완전히 배출되도록 플라스크에 샘플을 수집하십시오. 작업이 끝나면 펌프 전원을 끄고 비즈를 제거하여 세척해야 함을 유의하십시오. 이제 밀 현탁액을 50 milliliter 원심분리관으로 옮기고, 원심분리기를 10,000 rotations per minute로 설정하여 30분 동안 작동시키십시오.원심분리 사이클이 완료되면 상층액의 양을 측정하고, 동일한 양의 신선한 계면활성제 용액으로 교체하십시오. 재현탁이 완료되면 현탁액을 밀링 챔버로 옮겨 10분 동안 밀링하십시오. 약 1 mL의 분취액을 취하여 Zeta sizer를 이용해 샘플의 크기와 전하를 다시 측정하십시오.마지막으로, 균질화를 통한 나노 아트 제조를 위해 HPLC를 사용하여 나노 아트 제형의 농도를 측정합니다. Avastin Emulex C five를 사용하여 앞서 설명한 대로 약물 결정과 다양한 계면활성제를 준비하고, 현탁액을 균질화 용기에 옮긴 후 재순환을 시작합니다. 샘플을 균질화하기 전에 칠러가 켜져 있는지 확인하십시오.압력계를 20,000 ± 2000 PSI가 나타낼 때까지 점진적으로 압력을 높이고, 목표 입자 크기에 도달할 때까지 균질화를 계속합니다. 이 과정은 보통 45분에서 60분 정도 소요됩니다. 주기적으로 약 1 mL의 aliquot를 취하여, 앞서 설명한 방식대로 제타 사이저 원심분리기를 사용하여 균질화된 현탁액 샘플의 크기와 전하를 측정합니다.그 후 현탁액을 재현탁한 다음, 해당 현탁액을 C five 균질기로 옮깁니다. 순환을 다시 시작하고 균질화 압력을 20,000 ± 2000 PSI로 설정한 뒤 30분 동안 균질화하며, cold Palmer 초음파 처리기를 사용하여 초음파 처리 방식으로 제조합니다. 클로로메탄 PLGA 및 약물 용액을 1% PVA 계면활성제 용액에 붓고 초음파 처리기 내의 얼음 수조에 넣습니다.50% amplitude에서 초음파 처리를 시작하십시오. 샘플 양이 적은 경우에는 amplitude를 약 30%까지 낮출 수 있으며, 샘플을 10분 동안 초음파 처리합니다. 입자 크기 분석을 위해 소량의 aliquot를 취합니다. 입자 크기가 1.5 microns보다 큰 경우, 총 16분까지 2분 간격으로 샘플을 추가로 초음파 처리하십시오.현미경의 20배 배율로 샘플을 관찰하고 그 결과를 기록합니다. 교반기를 사용하여 현탁액에 적절한 와류를 형성하고 실온에서 밤새 혼합을 계속합니다. 24시간 후 현탁액을 수집하여 50 milliliter 원심분리 튜브에 붓습니다.샘플을 5 °C에서 8,000 rpm의 속도로 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 샘플의 절반은 75 mL의 여과된 역삼투수에, 나머지 절반은 75 mL의 0.5% CTAB(trimethyl ammonium bromide) 계면활성제에 각각 재현탁합니다. 샘플을 5 °C에서 8,000 rpm의 속도로 20분 동안 다시 원심분리하고, 각 펠렛을 총 20 mL의 mannitol 용액으로 재현탁합니다. 마지막으로, 균질화 또는 초음파 처리로 제조된 입자의 경우, zeta sizer를 사용하여 입자 크기를 측정하고 HPLC를 사용하여 샘플의 농도를 측정합니다.현미경 시각화를 준비하기 위해, 제조된 나노 아트 현탁액을 가져와 10초 동안 초음파 처리합니다. 초음파 프로브를 사용하여 20% 진폭으로 처리하며, 현미경 슬라이드 커버 글라스를 가져와 도립 현미경 위에 놓습니다. 커버 글라스 위에.나노 아트 현탁액 15 µL를 인산 완충 식염수 100 µL와 혼합하고, 피펫팅을 여러 번 반복하여 섞어줍니다. 그다음 20배 대물렌즈를 사용하여 나노입자의 형태를 관찰합니다. 시료는 주사 전자 현미경으로 관찰하기 위해 준비할 수도 있습니다.여기에 원심분리를 통해 혈액 유래 단핵구를 분리한 후, 1×10⁶ cells/mL 농도로 정제된 단핵구를 다음의 첨가제가 포함된 DMEM에 현탁시킨 뒤 A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F 저전압 전계 방사형 주사 전자 현미경으로 얻은 이미지가 제시되어 있습니다. 그다음 6-well 플레이트의 웰당 2×10⁶ cells를 분주하고, 5% CO₂가 공급되는 가습 분위기에서 7일 동안 배양하여 단핵구가 대식세포로 분화하도록 하여 세포 섭취 및 수집을 분석합니다. nano art를 배양액과 혼합하여 최종 농도가 100 µM이 되게 한 뒤, 원하는 시점 또는 세포에 nano art가 충분히 로딩되었을 때 각 웰에 처리 배지 1 mL를 첨가합니다.모든 처리 배지를 제거하고 1 mL의 PBS로 세포를 세 번 세척하여 세포에 흡수되지 않은 입자들을 제거합니다. 셀 리프터를 사용하여 웰 바닥에서 부착 세포를 떼어내어 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 이제 세포를 4 °C에서 1000 RCF로 10분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 100% Methanol 200 µL를 추가하여 세포를 용해시키며, 소닉 프로브를 사용하여 펠릿을 20% amplitude로 2~5초간 짧게 초음파 처리하여 nano art를 용해합니다. 약물 함량을 분석할 때까지 샘플을 -80 °C에 보관하십시오. nano art의 세포 내 잔류는 여기에서 보는 바와 같이 마이크로톰으로 절편을 제작한 후 투과 전자 현미경을 사용하여 시각화할 수 있습니다.나노 아치(nano arch) 방출을 분석하기 위해, 세포 처리 및 수집 방법은 이전에 설명한 세포 섭취 분석 방법과 동일하게 수행하십시오. 다만, 세척 후 세포를 수집하는 대신, 지정된 날짜에 또는 배지가 노란색으로 변하여 표시된 날짜에 PBS를 MCSF와 나노 아치가 포함되지 않은 세포 배양액 2 mL로 교체하십시오. 원하는 날짜에 배지의 절반을 교체하십시오. 반복구 세포와 함께 세포 배양액 1 mL를 수집하여 약물 분석을 진행하십시오.나노 아트 이초점 현미경(nano art bifocal microscopy)을 통해 실시간 흡수를 시각화하려면, 우선 Vibrant와 같은 DRE를 취해 배지에 첨가합니다. 제조사의 지침에 따라 염료가 포함된 배지를 성숙한 단핵구 유래 대식세포에 가한 다음, 1 mL의 배양액을 사용하여 세포를 세 번 헹구어 과잉 염료를 제거합니다. 이제 형광 표지된 나노 아트를 배양액과 혼합하여 표지된 나노 아트가 포함된 처리 배지를 첨가합니다. 공초점 현미경으로 이미징하기 직전부터 60배 대물렌즈를 사용하여 4시간 동안 30초마다 이미지를 캡처합니다.마지막으로, HIV-1 감염 및 감염성 분석을 수행할 수 있습니다. 우선 art 방출 시각화 단계에서 설명한 것과 같이 세포를 처리합니다. 그 다음 원하는 날짜에 모든 배지를 제거하고, 세포당 0.01 viral particles의 감염 다중도로 HIV-1 AA가 포함된 MCSF 제외 배지로 교체한 후 24시간 동안 배양합니다.그 후 바이러스 배지를 제거하고 신선한 바이러스가 없는 배지로 교체하여 세포를 10일 동안 배양하며, 감염 후 10일 동안 세포의 생존력을 유지하기 위해 격일로 또는 필요에 따라 배지의 절반을 교체합니다. 96-well 플레이트에 배치된 각 웰에서 10 µL의 배지를 수집하여 역전사 분석을 수행할 때까지 -80 °C에서 보관합니다. 이후 HIV-1 p24 검출을 수행할 수도 있습니다.여기에서 나노 아트 처리 1일 후 0.01의 중복 감염(multiplicative infection) 수준으로 바이러스에 노출된 세포의 형태를 쉽게 확인할 수 있습니다. 이 단핵구 유래 대식세포에서는 바이러스 감염의 증거가 없으며, 세포질 내에 나노입자들이 뚜렷하게 보입니다. 여기서 세포는 나노 아트 처리 10일 후에 바이러스에 노출되었습니다.이 세포 중 일부는 P 24 염색과 다핵거대세포 형성으로 나타난 바와 같이 감염되었으나, 처리하지 않은 세포와 비교했을 때 여전히 유의미한 보호 효과가 있었습니다. B의 세포질 내에서 나노 입자가 여전히 관찰되지만, a에서 보였던 것만큼 많지는 않으며, 이러한 구조는 나노 아트(nano art)를 처리하지 않은 세포에서는 나타나지 않는다는 점에 유의하십시오. 이 살아있는 세포의 공초점 비디오에서 녹색으로 표시된 것은 대식세포이며, 적색으로 표시된 것은 나노 아트입니다.여기에서 세포가 나노입자를 거의 축적하지 않는 것을 볼 수 있습니다. 반면, 여기서는 증가된 적색 형광으로 나타나듯이 입자를 빠르게 축적합니다. 이러한 차이는 HPLC를 사용하여 약물 섭취를 분석했을 때 나타나는 결과와 일치하며, 추가적으로 세포가 입자를 활발하게 섭취하는 것을 확인할 수 있습니다.세포 내 나노 아트 축적률의 차이는 크기, 모양, 전하와 같은 물리적 특성이 대식세포의 나노 아트 섭취 및 유지 능력에 미치는 영향을 반영합니다. 이 영상을 시청하고 나면 습식 밀링 균질화 및 초음파 처리 기술을 사용하여 나노 아트를 제조하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 방법들은 항레트로바이러스 나노입자를 제조하는 데 효과적입니다.습식 밀링(Wet milling)과 균질화(homogenization)는 지질 계면활성제 내에서 큰 약물 결정 입자를 더 작은 나노입자로 분획하는 역할을 하며, 초음파 처리 기술은 폴리머 내에서 개별적인 나노 크기의 약물 액적을 생성합니다. 본 영상에서는 또한 나노 입자 수송을 평가하기 위한 테스트 플랫폼으로 인간 단핵구 유래 대식세포를 사용하는 방법을 시연하였습니다. 당사의 테스트 방법은 입자가 세포에 의해 섭취, 유지 및 방출되는 능력뿐만 아니라 바이러스 복제를 억제하는 능력을 매우 간단하게 스크리닝할 수 있게 해줍니다.이를 통해 연구자는 in vivo에서 성공 가능성이 가장 높고, 궁극적으로 감염된 사람에게 사용할 가능성이 가장 큰 나노 아트를 식별할 수 있습니다. 이러한 실험의 전체 결과는 당사의 Online Nano 논문에 게재되었습니다. 해당 논문의 제목은 Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics이며, Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010에 게재되었습니다.대단히 감사합니다.

methods-development-for-blood-borne-macrophage-carriage

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

nanoparticles의 세포 biodistribution을 평가하는 데 사용 Bioimaging 방법은 nanoformulated 화합물의 치료 및 진단 모니터링에 적용할 수 있습니다. histological coregistration에 의해 평가하면 여기에 설명된 방법은 민감하고 구체적인 수 있습니다. 방법은 설치류에서 인간의 응용 프로그램에 translational 경로를 제공합니다.

진단 및 치료 모니터링을위한 Nanomaterials 등록 Bioimaging

nanomole 친화력과 HIV - 1Ba - L gp120에 대한 몇 가지 2' - 플루오로 RNA의 aptamers는 RNA 라이브러리에서에 의해 고립...

siRNA 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 HIV gp120 aptamers의 개발

이 비디오는 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1)에 감염된 인간화 마우스 모델에서 경구용 복합 항레트로바이러스 요법(구강 cART)의 효과를 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 뉴클레오시드 역전사효소 억제제(nucleoside reverse transcriptase inhibitors) 및 인테그라제 가닥 전달 억제제(integrase strand transfer inhibitors)를 포함하여 HIV-1을 표적으로 하는 약물을 영양 보충제 및 항생제와 함께 투여합니다. HIV-1에 감염된 인간화 마우스가 이 혼합물을 섭취한 후, 마우스에 대한 주기적인 검사를 통해 바이러스 복제의 효과적인 억제를 평가합니다.

인간화 마우스 모델에서 HIV-1 감염을 치료하기 위한 경구용 복합 항레트로바이러스 요법

이 프로토콜은 HIV 감염에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 된 골수/간/흉선 마우스 모델을 구성하는 방법을 설명합니다.

인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

우리는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 1형에 감염되거나 감염되지 않은 살아있는 세포에서 세포 중심을 향해 이동하는 식체체의 속도를 측정하는 방법을 설명하며, 회전 디스크 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 형광 감염 세포를 식별하고 명시야 현미경을 사용하여 식체를 검출합니다.

HIV-1 감염 라이브 차 인간 대 식세포에서 측정 Phagosome 마이그레이션 및 속도

우리는 폐 HIV 저수지를 평가하기 위하여 항레트로바이러스 치료에 만성 HIV 에 감염된 개별에게서 기관지 정맥 세척 액 및 일치한 말초 혈액을 처리하는 방법을 기술합니다. 이러한 방법은 초과민성 중합효소 연쇄 반응에 의한 면역phenotyping 및 HIV DNA/RNA 정량화에 사용될 수 있는 고순도 CD4 T 세포 및 폐포 대식세포의 획득을 초래한다.

기관지 충혈 유체 및 폐포 대식세포 및 CD4+ T 세포 면역체노티핑 및 HIV 저수지 평가를 위한 일치하는 혈액 처리

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

우리는 줄기 세포 이식, 질 내 인간 면역 결핍 바이러스 노출 및 액적 디지털 PCR RNA를 기반으로 인간화 및 인간 면역 결핍 바이러스 감염 NOG 마우스 모델의 생성 및 평가를위한 프로토콜을 개발했습니다. 정량화.

질 내 HIV 노출 및 HIV 감염 치료를 위한 인간화된 NOG 마우스

이 프로토콜은 인간화 마우스에서 HIV-1 RNA 복제를 성공적으로 억제하는 경구 조합 항레트로바이러스 약물을 전달하는 새로운 방법을 설명합니다.

HIV-1에 감염된 인간화 마우스에서 경구 조합 항레트로바이러스 치료

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

이 연구는 인실리코(in-silico ) 전략을 사용하여 Enumerated Etravirine이 HIV에 대한 유망한 치료제임을 확인했습니다. 분자 상호 작용 및 역학에 대한 우리의 발견은 가능한 HIV 치료 대안으로서 새로운 NNRTI의 합리적인 설계를 뒷받침합니다.

비뉴클레오티드 역전사효소 억제제의 정량적 구조-활성 관계, 활성 예측 및 분자 역학

배우세요 항레트로바이러스 나노입자 제조 및 대식세포 내 흡수·유지·방출 메커니즘을 평가하는 방법을. 이 기술은 HIV 치료를 위한 나노의학 연구에 활용됩니다.

Nanoformulated Antiretroviral 약물의 혈액 본 대식 세포 캐리지를위한 방법 개발

더 많은 동영상 탐색