Nanoformulated Antiretroviral 약물의 혈액 본 대식 세포 캐리지를위한 방법 개발

본 절차의 목적은 nano art라고 지칭하는 결정질 항레트로바이러스 나노입자를 제조하고, 이의 세포 내 흡수, 분비 및 항레트로바이러스 특성을 테스트하는 것입니다. 이는 먼저 초음파 균질화 또는 습식 밀링을 통해 항레트로바이러스 약물을 처리함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 역류 원심분리 여과법으로 일차 단핵구를 분리한 후, nano art 입자의 물리적 특성을 규명하는 것입니다.

이들은 macrophage colony stimulating factor(MCSF)가 함유된 DMEM에서 7일 동안 배양되며, 이는 단핵구 유래 대식세포로의 분화를 유도합니다. 세 번째 단계는 인간 단핵구 유래 대식세포에서 nano art의 섭취, 유지 및 방출을 테스트하는 것입니다. 이 절차의 마지막 단계는 단핵구 유래 대식세포에서 nano art의 인비트로(in vitro) 항레트로바이러스 효능을 테스트하는 것입니다.

최종적으로, 나노 아트의 세포 내 촉진된 흡수 및 서서히 방출되는 특성과 강력한 항레트로바이러스 효능을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 약물 농도 측정과, 역전사 효소 활성 측정을 통한 감염된 배양 상층액 물질의 테스트를 통해 결정됩니다. 안녕하세요, 저는 네브래스카 대학교 의료센터의 Howard Gelman 박사 연구실에서 박사후 연구원으로 재직 중인 Hanta Aldi입니다.

우리가 제시하는 방법들은 세포 기반 약물 전달 시스템이 중개 연구 활동을 개발하는 데 어떻게 활용될 수 있는지를 포함하여 나노 의학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 반감기가 연장된 나노 제형의 항레트로바이러스 요법을 사용하여 달성할 수 있습니다. 우리의 연구는 임상적 활용을 위한 나노 ART의 잠재적 사용 가능성을 뒷받침합니다.

안녕하세요, 저는 Carol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratory에서 연구 중인 MD PhD 학생 Ari Noche입니다. Gendelman 박사의 지도하에, 저희가 여기서 보여드리는 기술의 응용 분야는 항레트로바이러스 요법까지 확장됩니다. 나노 제형 화합물은 생체 이용률과 약동학을 동시에 개선하는 동시에 약물 관련 부작용을 줄일 수 있기 때문입니다. 임상적으로 사용 가능한 항레트로바이러스 약물을 나노입자로 재포장함으로써, 복약 순응도를 높이고 질병 결과에 긍정적인 영향을 줄 수 있을 것입니다.

안녕하세요, 저는 하워드 젠델만(Howard Gendelman) 박사입니다. 저는 임상 과학자이자 네브래스카 대학교 메디컬 센터의 약리학 및 실험 신경과학과 교수 겸 학과장입니다. 저희의 전반적인 목표는 항레트로바이러스제를 단순화하여 쉽게 이용 가능하게 하고, 생체 내 분포와 약동학을 개선하는 것입니다.

이제 Ari와 Sean이 연구실로 안내하여 이 나노입자들의 제조 및 개발 과정을 보여드리겠습니다. Nebraska Medical Center 대학에서의 임상적 유용성 및 개발 과정입니다. 습식 밀링(wet milling)을 통해 나노 입자를 제조합니다. 먼저 나노 제형 제작에 사용할 약물 결정과 다양한 계면활성제를 정량한 후, T 18 ultra Turrax 믹서를 사용하여 pH 7.8의 10 mM HEPS 버퍼에 완전히 분산될 때까지 혼합합니다. 연속 밀링을 위한 제형 내 약물 함량은 1~2% 사이여야 합니다.

칠러와 컴프레서가 켜져 있는지, 그리고 토출 압력이 약 100 PSI인지 확인하십시오. 이제 분쇄 매질을 탱크에 넣을 수 있도록 설정하고 분쇄 챔버에 비즈 50 milliliters를 추가합니다. 깔때기를 사용하여 기계적 씰의 누출을 방지하기 위해 나사산이나 분쇄 챔버 외부 어디에도 비즈가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 이제 밀링 챔버의 O-링이 제자리에 있는지 확인하십시오.

그다음 적절한 스크린 메쉬 크기를 선택하고 너트를 조여 뚜껑을 고정합니다. 스크린 메쉬 크기는 비드 크기의 최소 절반 이상이어야 합니다. 연속 밀링 중에 제품이 필터를 막는 것을 방지하려면 큰 스크린 메쉬 크기를 사용하십시오.

분쇄 챔버를 내린 후, 다양한 양의 계면활성제가 포함된 약물 현탁액을 제품 투입구에 추가합니다. 현탁액의 최소 부피는 100 milliliters여야 합니다. 이는 분쇄 챔버의 과열을 방지하고 부품 마모를 줄여 비드 오염을 피하기 위함입니다.

다음으로 펌프를 작동시킵니다. 제어 장치를 사용하여 포뮬레이션에 필요한 유량을 조절하십시오. 그런 다음 교반기를 켜고 제어 장치에서 속도를 조정합니다.

속도는 분당 600회에서 4,320회까지 높일 수 있습니다. 마이크로 서(micro sur)의 경우, 분쇄 챔버 상단에 부착된 온도계를 사용하여 과열되지 않는지 온도를 모니터링하십시오. 이제 다양한 속도와 유량으로 샘플을 밀링하고, 회절 광산란 말번 제타 사이저(diffraction light scattering malvern zeta sizer)를 이용한 크기 및 전하 측정을 위해 제형의 약 1 mL 정도의 소량 분주액을 취하십시오.

원하는 크기가 되면 제어 장치를 사용하여 밀링을 중단하고, 펌프를 켠 상태에서 샘플을 플라스크에 수집하여 약물이 완전히 배출되도록 합니다. 작업이 완료되면 펌프 전원을 끄고 비즈를 제거하여 세척하십시오. 이제 밀 현탁액을 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리기를 10,000 rotations per minute로 설정하여 30분 동안 작동시킵니다.

원심분리 사이클이 완료되면 상층액의 양을 측정하고, 동일한 양의 신선한 계면활성제 용액으로 교체합니다. 재현탁이 완료되면 현탁액을 밀링 챔버로 옮겨 10분 동안 밀링합니다. 약 1mL의 aliquot를 취하여 Zeta sizer를 사용해 샘플의 크기와 전하를 다시 측정합니다.

마지막으로, 균질화를 통해 나노 아트를 제작하기 위해 HPLC를 사용하여 나노 아트 제형의 농도를 측정합니다. Avastin Emulex C five를 사용하여 앞서 설명한 대로 약물 결정과 다양한 계면활성제를 준비하고, 현탁액을 균질화 용기에 옮긴 후 재순환을 시작합니다. 시료 균질화를 시작하기 전에 칠러가 켜져 있는지 확인하십시오.

압력계 수치가 20,000 ± 2000 PSI가 될 때까지 압력을 점진적으로 높이고, 목표 입자 크기에 도달할 때까지 균질화를 계속합니다. 이 과정은 보통 45분에서 60분 정도 소요됩니다. 주기적으로 약 1 mL의 aliquot을 취하여, 앞서 설명한 균질화 현탁액 측정 방식과 동일하게 제타 사이저 원심분리기를 사용하여 샘플의 크기와 전하를 측정합니다.

그런 다음 Resus 현탁액을 C five 균질기로 옮깁니다. 순환을 다시 시작하고 균질화 압력을 20,000 ± 2000 PSI로 되돌린 후, cold Palmer 초음파 처리기를 이용한 초음파 처리를 통해 30분 동안 균질화하여 제조합니다. 클로로메탄 PLGA 및 약물 용액을 1% PVA 계면활성제 용액에 붓고 초음파 처리기의 얼음 수조에 넣습니다.

50% amplitude로 초음파 처리를 시작하십시오. 다만, 시료의 양이 적은 경우에는 amplitude를 약 30%까지 낮출 수 있습니다. 시료를 10분 동안 초음파 처리하십시오. 입자 크기 분석을 위해 소량의 aliquot를 취합니다. 입자 크기가 1.5 microns보다 크면, 총 16분까지 2분 간격으로 시료를 추가로 초음파 처리하십시오.

현미경 하에서 20배 배율로 시료를 관찰하고 그 결과를 기록합니다. 스터러를 사용하여 현탁액에 적절한 와류를 형성하고 실온에서 밤새 계속 혼합합니다. 24시간 후 현탁액을 수집하여 50 milliliter 원심분리 튜브에 붓습니다.

샘플을 5°C에서 8,000 rpm의 속도로 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고, 샘플의 절반은 75 mL의 여과된 역삼투수로, 나머지 절반은 75 mL의 0.5% CTAB(trimethyl ammonium bromide) 계면활성제로 재현탁합니다. 샘플을 5°C에서 8,000 rpm의 속도로 20분 동안 다시 원심분리하고, 각 펠렛을 총 20 mL의 mannitol 용액으로 재현탁합니다. 마지막으로, 균질화 또는 초음파 처리로 제조된 입자의 경우, Zeta Sizer를 사용하여 입자 크기를 측정하고 HPLC를 사용하여 샘플의 농도를 측정합니다.

현미경 관찰을 준비하기 위해, 제조된 나노 아트 현탁액을 가져와 10초 동안 초음파 처리합니다. 초음파 프로브를 사용하여 20% 진폭으로 처리하며, 현미경 슬라이드 커버 글라스를 가져와 도립 현미경 위에 놓습니다. 커버 글라스 위에.

나노 아트 현탁액 15 µL를 인산 완충 식염수 100 µL와 혼합하고, 피펫팅을 여러 번 반복하여 섞어줍니다. 그런 다음 20배율 대물렌즈를 사용하여 나노입자의 형태를 관찰합니다. 샘플은 주사 전자 현미경 관찰을 위해 준비할 수도 있습니다.

여기서는 원심분리를 통해 혈중 단핵구(monocytes)를 분리한 후, 1 × 10⁶ cells/mL 농도의 정제된 단핵구를 다음의 첨가제가 포함된 DMEM에 현탁시킨 후 A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F 저전압 전계 방출 주사전자현미경으로 얻은 이미지를 보여줍니다. 그 다음 6-well plate의 각 well에 2 × 10⁶ cells/well의 밀도로 분주하고, 5% CO₂가 공급되는 습윤한 환경에서 7일 동안 배양하여 단핵구가 대식세포(macrophages)로 분화되도록 하여 세포 섭취 및 수집을 분석합니다. nano art를 배양액과 혼합하여 최종 농도가 100 µM이 되도록 조절하고, 원하는 시점 또는 세포에 nano art가 완전히 채워졌을 때 각 well에 처리 배지 1 mL를 첨가합니다.

모든 처리 배지를 제거하고, 세포에 흡수되지 않은 입자들을 제거하기 위해 1 mL의 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 셀 리프터를 사용하여 웰 바닥에서 부착 세포를 떼어내어 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 그다음, 세포를 4 °C에서 1000 RCF로 10분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거하고 100% Methanol 200 µL를 추가하여 세포를 용해시킵니다. 소닉 프로브를 사용하여 20% amplitude에서 2~5초 동안 펠릿을 짧게 초음파 처리하여 nano art를 용해합니다. 약물 함량을 분석할 때까지 샘플을 -80 °C에서 보관하십시오. 여기서 보는 바와 같이, 마이크로톰으로 절편을 제작한 후 투과 전자 현미경을 사용하여 nano art의 세포 내 잔존 여부를 시각화할 수도 있습니다.

세포 흡수 및 수집 분석을 위해 이전에 설명한 방식대로 나노 아치 방출 처리 세포를 분석하는 자세한 내용은 이 논문의 본문을 참조하십시오. 다만, 세척 후 세포를 수집하는 대신, 지정된 날짜에 또는 배지가 노란색으로 변하는 것으로 표시된 날에 PBS를 MCSF와 나노 아트가 포함되지 않은 세포 배양액 2 mL로 교체하십시오. 원하는 날짜에 배지의 절반을 교체하십시오. 반복군 세포와 함께 세포 배양액 1 mL를 수집하여 약물 분석을 진행하십시오.

나노 아트 이초점 현미경(bifocal microscopy)을 이용한 실시간 섭취를 시각화하려면, 먼저 Vibrant와 같은 DRE를 준비하여 배지에 첨가하십시오. 제조사의 지침에 따라 염료가 포함된 배지를 성숙한 단핵구 유래 대식세포에 추가한 다음, 1 mL의 배양액으로 세포를 세 번 헹구어 과잉 염료를 제거합니다. 이제 형광 표지된 나노 아트를 배양액과 혼합하여 나노 아트가 포함된 처리 배지를 추가합니다. 공초점 현미경으로 이미징하기 직전에 60배 대물렌즈를 사용하여 4시간 동안 30초 간격으로 이미지를 캡처하십시오.

마지막으로, HIV-1 감염 및 감염성 분석을 수행할 수 있습니다. 먼저 art 방출 시각화 단계에서 설명한 대로 세포를 처리합니다. 그런 다음 원하는 날짜에 모든 배지를 제거하고, 세포당 0.01의 감염 다중도로 HIV-1 αA가 포함된 MCSF 미포함 배지로 교체한 후 24시간 동안 배양합니다.

그런 다음 바이러스 배지를 제거하고 신선한 바이러스 배지로 교체한 후, 세포를 10일 동안 배양합니다. 이때 감염 후 10일까지 세포가 생존할 수 있도록 이틀마다 또는 필요에 따라 배지의 절반을 교체합니다. 96-웰 플레이트의 각 웰에서 10 µL의 배지를 수집하여 역전사 분석을 수행할 때까지 -80 °C에서 보관합니다. 이어서 HIV-1 p24 검출을 수행할 수도 있습니다.

여기서 나노 아트 처리 0.011일 후, 다중 감염(multiplicative infection) 상태에서 바이러스에 노출된 세포의 형태를 쉽게 확인할 수 있습니다. 이 단핵구 유래 대식세포에서는 바이러스 감염의 증거가 나타나지 않으며, 나노입자가 세포질 내에 분명하게 보입니다. 여기의 세포들은 나노 아트 처리 10일 후에 바이러스에 노출되었습니다.

이 세포들 중 일부는 P 24 염색과 다핵거대세포 형성에 의해 확인된 바와 같이 감염되었으나, 처리하지 않은 세포와 비교했을 때 여전히 상당한 보호 효과가 있었습니다. B의 세포질 내에는 나노입자가 여전히 보이지만 a에서 보였던 것만큼 많지는 않으며, 나노아트(nano art)를 처리하지 않은 세포에서는 이러한 구조가 나타나지 않는다는 점에 유의하십시오. 이 살아있는 세포 공초점 영상에서 녹색으로 표시된 것은 대식세포이며, 적색으로 표시된 것은 나노아트입니다.

여기에서 세포가 나노입자를 매우 적게 축적하는 것을 확인할 수 있습니다. 반면, 여기서는 증가된 적색 형광에서 알 수 있듯이 입자를 빠르게 축적합니다. 이러한 차이는 HPLC를 사용하여 약물 섭취를 분석했을 때 나타나는 결과와 일치하며, 또한 세포가 입자를 능동적으로 섭취하는 것을 확인할 수 있습니다.

세포 내 나노 아트 축적 속도의 차이는 크기, 모양 및 전하와 같은 물리적 특성이 대식세포의 나노 아트 섭취 및 유지 능력에 미치는 영향을 반영합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 습식 밀링 균질화 및 초음파 처리 기술을 사용하여 나노 아트를 제조하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 방법들은 항레트로바이러스 나노입자를 제조하는 데 효과적입니다.

습식 밀링(Wet milling)과 균질화는 지질 계면활성제 내에서 큰 약물 결정 입자를 더 작은 나노 입자로 분획하는 역할을 하며, 초음파 처리 기술은 폴리머 내에서 개별 나노 크기의 약물 액적을 생성합니다. 본 연구에서는 또한 나노 입자 운송을 평가하기 위한 테스트 플랫폼으로 인간 단핵구 유래 대식세포를 사용하는 방법을 시연하였습니다. 당사의 테스트 방법은 입자가 세포에 의해 섭취, 유지 및 방출되는 능력뿐만 아니라 바이러스 복제를 억제하는 능력을 매우 간단하게 스크리닝할 수 있게 해줍니다.

이를 통해 연구자는 in vivo에서 성공 가능성이 가장 높고, 궁극적으로 감염된 환자에게 사용될 가능성이 큰 나노 아트를 식별할 수 있습니다. 이러한 실험의 전체 결과는 저희의 Online Nano 논문에 게재되었습니다. 해당 논문의 제목은 "Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics"이며, Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010년에 발표되었습니다.

대단히 감사합니다.