2011년 2월 1일
이 프로토콜은 대장균의 표현 metagenomic 도서관에서 cellulolytic 활동에 높은 처리량 화면을 설명합니다. 화면이 솔루션을 기반으로하고 고도의 자동화, 그리고 흡광도 측정으로 최종 판독과 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 메타유전체학(metagenomic) 라이브러리에서 클론을 발현하는 셀룰라아제를 식별하는 것입니다. 이는 복제된 라이브러리를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양한 후 로봇을 사용하여 이전에 만들어진 메타유전체 라이브러리를 먼저 복제함으로써 수행됩니다. 그런 다음 대장균 클론의 성장을 측정하고 용해, 완충액 및 기질을 복제된 라이브러리에 추가합니다.
궁극적으로 플레이트 리더를 사용한 발색 흡광도 측정을 통해 셀룰라아제 활성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 미생물학 및 면역학과의 스티븐 할람 연구실의 Keith입니다. 오늘 우리는 메타유전체학(metagenomic) 라이브러리의 고처리량 기능 스크리닝을 위한 절차를 보여드리겠습니다.
우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 메타유전체 라이브러리에서 바이오민 셀룰라아제 활성을 연구합니다. 시작하겠습니다. 이 프로토콜을 시작하기 전에 384웰 플레이트 형식으로 저장된 메타유전체학(metagenomic) 라이브러리를 준비합니다.
본 연구에서는 PCC one copy control SMID 벡터를 라이브러리 숙주로 사용하여 Farge T one resistant TRANSFECT max EPI 300 T one resistant e coli cells를 라이브러리 숙주로 사용하여 라이브러리를 포함하는 플레이트를 영하 80도에서 제거하고 약 20분 동안 섭씨 37도에서 해동했습니다. 한편, QIX two의 자외선 살균 기능을 사용하여 로봇을 15분 동안 살균합니다. 멸균 튜빙 프로그램을 통해 매니폴드에 부착된 미디어 병을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 Q fill three를 설정합니다.
Q는 적절한 양의 미디어에 대해 3을 채우고 45마이크로리터 볼륨을 채우도록 설정합니다. 각각에서 매체가 보일 때까지 로봇의 퍼지 기능을 사용하여 튜브와 매니폴드에서 공기를 잘 퍼지합니다. 매니폴드의 각 핀에서 Q 채우기 3개를 사용하여 원하는 수의 플레이트를 LB 매체로 채웁니다.
각 플레이트를 채우는 데 약 20초가 걸립니다. 다음으로, 라이브러리 플레이트와 새 플레이트를 Q 픽의 적절한 영역에 로드합니다. 로봇으로 세척조를 적절한 시약으로 채우십시오.
뒤쪽 욕실에는 2%micro 90, 중간 욕실에는 오토클레이브 증류수, 전면 욕실에는 80%에탄올이 있습니다. qix two의 복제 프로그램을 사용하여 적절한 헤드와 소스 및 대상 플레이트의 수와 유형을 선택합니다. 또한 복제 간에 정리하도록 헤드를 설정합니다.
일반적으로 각 수조에서 6 사이클이면 충분합니다. 기계의 용량은 한 번에 10 개의 플레이트입니다. 실행할 컴퓨터를 설정합니다.
복제하는 데 약 15분 정도 걸립니다. 384핀 헤드의 전체 용량. 플레이트가 복제되면 습도 상자에서 24시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 성장시킵니다.
긴 배양 시간이 필요한 이유는 arabinose의 추가로 높은 copy number of smid가 유도되기 때문입니다. 한편, 서면 프로토콜에 설명된 대로 Q 채우기 3 로봇을 청소합니다. 배양 후 섭씨 37도의 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다.
뚜껑을 옆으로 치우고 플레이트를 Rapid Stack과 함께 제공된 매거진 적재 플랫폼에 놓습니다. 소프트웨어가 추적하지 않으므로 플레이트의 순서를 추적해야 합니다. 더미의 맨 아래에 있는 판을 읽습니다.
먼저 래피드 스택에서 매거진 하나를 제거합니다. 비어 있는지 확인하고 읽을 접시 더미에 밀어 넣습니다. 매거진의 손잡이를 잡으면 플레이트가 매거진에 장착됩니다.
매거진을 올바른 방향으로 빠른 스택에 로드합니다. 연결된 컴퓨터에서 스캔 프로그램을 엽니다. 새 세션을 선택하고 적절하게 이름을 지정합니다.
평평한 바닥 384 웰 플레이트를 플레이트로 호출하도록 선택합니다. 플레이트 레이아웃 영역에 입력합니다. 마법사 버튼을 선택하고 플레이트에 384개의 미지수를 추가하려면 선택합니다.
프로토콜 영역에서 웰 루프 옵션을 선택하고 384개의 웰을 입력합니다. 우물 루프 아이콘이 화면 왼쪽의 흐름 트리에 나타납니다. 아이콘을 선택하고 클릭하여 측광 측정을 추가합니다.
600나노미터에서 읽도록 설정합니다. 프로토콜을 고유한 이름으로 저장하고 스캔 프로그램을 닫습니다. 그런 다음 polara RS 프로그램을 엽니다.
메인 페이지의 VARI 스캔 제목 아래에 고속 스택 장치에 연결된 기기를 나열하는 표에서 run session 옵션을 클릭합니다. 그러면 중간에 순서도와 함께 분석 창이 나타나야 합니다. 실행 세션 항목을 선택한 다음, 저장된 스캔의 이름을 찾습니다.
화면 오른쪽에 나타나는 드롭다운 메뉴에서 다시 실행됩니다. 프로토콜이 선택되면 실행을 클릭합니다. 이 분석은 어떤 잡지를 소스로 사용할 것인지, 어떤 잡지가 비어 있는지 묻는 상자가 나타납니다.
화면의 아래쪽 상자는 앞면 매거진 진에 해당합니다. 빠른 스택과 Vario 스캔이 모두 켜져 있는지 확인하고 시작을 클릭합니다. 빠른 스택은 플레이트를 플레이트 리더에 자동으로 로드하여 플레이트를 지속적으로 측정할 수 있습니다.
Vario 스캔에 로드되는 첫 번째 플레이트를 관찰하여 읽을 기계의 올바른 정렬을 확인하십시오. 25개의 플레이트에는 약 50분이 소요됩니다. Barrios 스캔이 완료되면 전체 매거진을 제거하고 매거진 로딩 플랫폼에 놓습니다.
플랫폼의 바깥쪽 직사각형을 들어 올리면 매거진이 미끄러져 떨어져 플레이트가 중간에 더미로 남아 있어야 합니다. 마지막으로, 용액 기반 스크린을 위해 플레이트의 뚜껑을 교체합니다. 셀룰로오스 활성을 위해 먼저 미리 만들어진 10배의 용해 스톡을 사용하여 분석 혼합물을 준비합니다.
서면 프로토콜에 설명된 대로 pH 5.5에서 50밀리몰의 아세트산 칼륨 완충액을 혼합합니다. 그런 다음 DMSO에서 밀리리터당 최대 75mg의 스톡, 발색 디페닐 또는 DNP 세포 살생물제 기질을 준비하고 기질이 완전히 용해되었는지 확인합니다. DNP 세포 살생물제 원액을 최종 농도 밀리리터당 0.1mg으로 분석 혼합물에 첨가합니다.
각 플레이트는 약 20ml의 용액을 사용하며 데드 볼륨을 허용하기 위해 추가로 50ml가 필요하다는 점을 명심하십시오. Q fill three를 사용하여 각 플레이트에 대한 분석 혼합물에서 이전과 같이 Q fill three를 설정합니다. 각 플레이트를 채우는 데 약 20초가 걸립니다.
분석 혼합물이 추가되면 섭씨 37도에서 12-16시간 동안 플레이트를 배양합니다. 습도 상자에서 섭씨 37도 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 뚜껑을 옆으로 치우고 이전과 같은 방식으로 급속 스택과 함께 제공된 매거진 적재 플랫폼에 플레이트를 놓습니다.
스캔 프로그램을 열고 400나노미터에서 판독하도록 설정해야 하는 측광 측정을 제외하고 이전과 같이 설정합니다. 그런 다음 POLARA RS 프로그램에 매개변수를 입력합니다. 앞에서 설명한 바와 같이.
Vario 스캔이 플레이트를 읽을 수 있도록 합니다. 실행 후에는 플레이트를 제거하고 폐기하십시오. 흡광도 판독값을 열어 내보내려면 소프트웨어를 다시 스캔하고 선택하십시오.
기존 파일을 엽니다. 세션이 저장된 디렉토리를 선택하고 더하기 아이콘을 눌러 목록을 확장합니다. 제목 제목 아래에는 container one to container N이라는 옵션이 있습니다.플레이트 수에 따라 페이지 상단의 메뉴 표시줄에서 분석할 첫 번째 플레이트를 선택하고 데이터 보고서 내보내기를 선택합니다.
플레이트 레이아웃 및 측광 데이터와 같은 내보내기 옵션을 선택합니다. 보고서 보기를 클릭한 다음 파일 저장을 클릭합니다. 원하는 디렉토리를 선택합니다.
출력 형식은 Microsoft Excel 스프레드시트입니다. 여기서, 단일 384의 흡광도 판독값. 표시된 바와 같이 양성 클론을 포함하는 웰 플레이트는 셀룰라아제 활성을 발현하지 않는 클론에 비해 흡광도의 현저한 증가를 보여줍니다.
분석 시간, 플레이트의 위치 또는 DNP 농도의 차이는 절대 흡광도 판독값에 영향을 줄 수 있습니다. 플레이트 평균 또는 컬럼 평균을 초과하는 흡광도의 차이와 같은 상대적 흡광도 판독값은 셀룰라아제 양성 클론을 식별하는 보다 강력한 방법입니다. 방금 메타유전체학(metagenomic) 라이브러리에서 셀룰라아제 양성 클론을 식별하는 방법을 보여드렸습니다.
이 절차를 수행할 때 DNP 세포 바이오 측을 DMSO에 용해시키고 플레이트를 습도 챔버에서 배양하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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이 프로토콜은 Escherichia coli에서 발현된 메타게놈 라이브러리의 셀룰로시 활성에 대한 고처리량 스크리닝을 설명합니다. 이 절차는 자동화된 프로세스 및 흡광도 측정을 통해 셀룰라아제 발현 클론을 식별합니다.
High throughput screening of metagenomic libraries for cellulase activity addresses the challenge of discovering novel bioconversion enzymes from uncultivable microbes. Quantitative, automated absorbance-based assays enable rapid identification of functional cellulases, supporting predictive confidence in early enzyme discovery. This workflow enhances portfolio value by accelerating the triage and validation of candidate biocatalysts for industrial applications.
This solution-based, absorbance assay integrates into the discovery continuum from environmental sampling to lead enzyme identification and preclinical validation.