내생 와일드 타입 BRCA1을 표현 세포를 사용하는 동종 재조합에 BRCA1 변이의 효과를 확인

다음 실험의 전반적인 목표는 시험관 내 상동 재조합 분석을 사용하여 BRCA one 단백질의 특정 변이체를 테스트하는 것입니다. 이는 내인성 야생형 BRCA one 단백질을 BRCA 1에 특이적인 짧은 간섭 RNA와 BRCA one 변이체 단백질을 세포로 재발현하기 위한 플라스미드의 형질주입을 통해 시험되는 변이체로 대체함으로써 달성되며, 두 번째 단계로 BRCA one 변이체 단백질을 발현하기 위한 짧은 간섭 RNA 및 플라스미드는 ISCE one 단백질을 발현하기 위한 플라스미드 외에 RET 절제됩니다. 이는 테스트 세포의 DNA 게놈의 특정 위치에서 DNA 손상을 일으킵니다. 다음으로, DNA 손상 및 복구가 발생할 수 있도록 세포를 2-3일 동안 배양하며, GFP 발현 세포의 유세포 분석을 기반으로 한 상동 재조합에 의한 DNA 복구에서 BRCA one 단백질의 특정 단백질 변이가 기능하는지 여부를 보여주는 결과를 얻습니다.

이 기술은 상동 재조합에 의한 DNA 손상 복구에서 특정 단백질 변이체를 분석하기 위한 다목적 시스템을 만들기 위해 확립된 두 가지 방법을 결합합니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이전에 확립된 방법이 BRCA 1의 유전적으로 녹아웃된 세포주에 의존한다는 것입니다. 우리는 HELOC 세포에서 유래한 보다 관리하기 쉬운 세포주를 사용하여 내인성 단백질의 RNA 간섭에 의한 BRC 1회 고갈을 가능하게 하고 이러한 세포에서 테스트 단백질을 다시 추가할 수 있습니다.

이제 변이체인 BRC one 단백질을 발현하여 상동 재조합을 테스트할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 시술 중 과도한 세포 사멸로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 세포 독성을 제한하면서 재조합 반응의 효과를 극대화하기 위해 절편 조건을 신중하게 설정하는 것이 중요합니다.

이 프로토콜이 시작되기 전에, hela DR 13 nine cell line은 안정적으로 transfection된 cell을 선택하기 위해 P-D-R-G-F-P Maintain 10cm Petri dish에서 cell-mycin으로 hela 세포를 transection하여 확립되었습니다. P-D-R-G-F-P 플라스미드 및 안정한 형질전환체의 재조합 기질은 GFP의 2개의 비활성 대립유전자를 함유합니다. 하나의 대립유전자는 ISCE one에 대한 18개의 염기쌍 제한 효소 인식 부위가 포함되어 있기 때문에 비활성화됩니다.

ISCE의 암호화 서열 발현에서 이러한 세포의 하나는 비활성 GFP의 두 번째 대립유전자에 이중 가닥 DNA 차단 또는 DSB를 생성합니다. 첫 번째 대립유전자의 I SCE E one site와 상관관계가 있는 염기서열 부분은 야생형입니다. 이 두 번째 GFP 대립유전자는 DSP의 상동 재조합 복구를 위한 염기서열 공여체로 기능할 수 있으며 첫 번째 transfection 전날 유세포 분석으로 쉽게 검출되는 활성 GFP 대립유전자를 생성합니다.

10 센티미터의 헬라 DR 13 9 개의 세포를 90 % 이상 융합 트립신이 2-3 분 동안 1 밀리리터의 세포를 주시합니다. 9ml의 D-M-E-M-F-B-S를 첨가하여 반응을 중지하고 피펫팅으로 세포 현탁액을 잘 혼합합니다. 24웰 플레이트의 웰당 40마이크로리터의 트립 주입 세포를 0.5밀리리터의 D-M-E-M-F-B-S에 추가하고 밤새 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다.

첫째 날에는 세포가 40%에서 50% 사이의 융합도를 가져야 합니다. 최적의 배지에서 플라스미드를 발현하는 내인성 b RCA 1과 B RCA one 돌연변이를 고갈시키기 위해 irna를 모두 혼합하여 transfection을 시작합니다. 그런 다음 핵산과 립을 최적의 배지로 결합합니다.

transfection 후 제조업체의 지침에 따라 lipectomy transfection을 진행합니다. 배양할 세포를 반환합니다. 4-6시간 후에 항생제가 포함되지 않은 배지로 미디어를 교체하십시오.

둘째 날에 세포를 되돌려 밤새 배양합니다. 트립신은 섭씨 37도에서 잠깐 배양한 후 각 웰에 0.3ml의 트립 트립신 시약을 첨가하여 세포를 트립신 시약에서 위아래로 피펫팅하여 세포를 느슨하게 하는 세포입니다. 트립신이 생성되면 24웰 플레이트의 세포를 2밀리리터의 D-M-E-M-F-B-S가 포함된 6웰 플레이트로 옮겨 트립신 활성을 중단합니다.

6개의 well plate가 초기 transfection으로부터 2일 전과 동일한 조건에서 밤새 배양되도록 합니다. 62.5 마이크로리터의 Optum에서 SIR A, BRCA one 발현 플라스마 DNA 및 ISCE one 발현 플라스미드 mutant를 준비합니다. 이 용액을 2.5마이크로리터의 LIPECTOMY 2060 2.5마이크로리터의 Optum과 혼합합니다.

4-6시간의 배양 후 세포를 transfection합니다. 항생제가 없는 D-M-E-M-F-P-S로 배지를 교체합니다. 6일째에 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.

트립신은 0.5ml의 트립 e 트립신 시약을 첨가하여 각 웰에 있는 세포입니다. 2ml의 D-M-E-M-F-B-S를 첨가하여 실온에서 5분 동안 1000RPM으로 원심분리하여 세포를 수집하여 반응을 중지합니다. 신선한 D-M-E-M-F-B-S 분석한다 10의 GFP 표정을 위한 1 밀리리터에 있는 세포를 재탁하십시오.

유세포 분석에 의해, 단일 살아있는 세포는 전방 및 크기 산란 매개변수를 사용하여 게이트됩니다. GFP 양성 세포는 GFP 형광 검출기를 사용하여 지시되며 결과는 히스토그램으로 표시됩니다. 나머지 세포는 형광으로 사진 촬영을 위해 다시 도금할 수 있습니다.

원하는 BRCA one의 현미경 검사는 상동 재조합에 의한 이중 가닥 DNA 절단의 복구 경로를 조절합니다. 상동 재조합에 의해 복구를 거친 세포는 형광 현미경으로 쉽게 검출됩니다. RNAi에 의한 BRCA one의 고갈은 검출된 GFP 양성 세포의 급격한 감소를 초래합니다.

FCA의 출력은 x축의 셀당 GFP 강도와 Y축의 셀 수가 있는 히스토그램입니다. transfected가 없는 경우, I SCE 1은 플라스미드를 발현합니다. GFP 양성 세포가 검출되지 않았습니다.

2열부터 6열까지의 결과는 모두 ISC 1을 발현하는 플라스미드를 3일째에 transfection한 세포에서 가져온 것입니다. 단일 실험의 일반적인 결과 세트에서 세포의 15.5%는 I SCE one 발현 후 GFP 양성이며 BRCA 1의 고갈을 비교하여 관련 없는 유전자에 대한 RNAi 고갈을 제어하고 빈 플라스미드 벡터를 다시 추가합니다. GFP 전환을 0.7%로 감소 외인성 야생형 BRCA 15-16% GFP 양성 세포를 획득하여 검출된 바와 같이 완전히 복원된 상동 재조합 추가.

유사하게, 알 수 없는 유의성을 가진 다른 변형의 발현. BRCA one I 21 B 돌연변이가 완전히 회복되었습니다. BRCA one dependent homologous recombination function added back of BRCA one M 18 T mutant는 벡터 control과 유사한 효과를 가졌습니다.

이 변이체는 내인성 단백질과 유사한 수준으로 발현되기 때문에 BRCA one M 18 T 변이체가 상동 재조합에서 기능하지 않음을 시사합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 세포의 성장을 모니터링하고, 세포가 천천히 성장하고 낮은 conf 유창성으로 사용되며, 사용되는 형질주입 혼합물의 양을 줄여야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 적시에 transfection 배지를 제거하는 것이 중요합니다.

transfection 후 며칠 동안 배지에 항생제가 포함된 경우 많은 양의 세포 독성이 있음을 발견했습니다. 이러한 이유로 모든 매체는 첫날 이후 항생제가 부족합니다. 이 기술은 유방암 연구 분야의 연구자들이 암 클리닉에서 임상적 중요성이 알려지지 않은 BRC one 변이체의 유전학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

우리는 이 연구에서 개발된 기능적 BRC one 분석법이 암 소인에 대한 BRC one 변이체의 영향을 더 잘 예측할 수 있기를 바랍니다.