내생 와일드 타입 BRCA1을 표현 세포를 사용하는 동종 재조합에 BRCA1 변이의 효과를 확인

다음 실험의 전반적인 목적은 인 비트로(in vitro) 상동 재조합 분석법을 사용하여 BRCA1 단백질의 특정 변이체를 테스트하는 것입니다. 이는 먼저 BRCA1 전용 짧은 간섭 RNA(siRNA)와 테스트할 BRCA1 변이 단백질을 재발현시키기 위한 플라스미드를 세포 내로 형질전환하여 내성 야생형 BRCA1 단백질을 테스트 대상 변이체로 교체함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 테스트 세포의 DNA 게놈 내 특정 부위에 DNA 손상을 유도하는 ICN1 단백질 발현 플라스미드와 더불어, 돌연변이 BRCA1을 발현하는 플라스미드 및 짧은 간섭 RNA가 함께 도입됩니다. 이후 DNA 손상과 복구가 일어날 수 있도록 세포를 2~3일 동안 배양합니다. 마지막으로 GFP 발현 세포의 유세포 분석을 통해 BRCA1 단백질의 특정 변이체가 상동 재조합에 의한 DNA 복구 기능을 수행하는지 여부를 확인하여 결과를 얻습니다.

본 기술은 두 가지 기존 방법론을 결합하여 상동 재조합에 의한 DNA 손상 복구 과정 중 특정 단백질 변이체를 분석할 수 있는 다각적인 시스템을 구축합니다. 기존 방법과 비교했을 때 본 기술의 주요 장점은, 이전의 방법들은 BRCA1 유전자가 유전적으로 제거된(knockout) 세포주에 의존했다는 점입니다. 본 연구에서는 HELOC 세포 유래의 보다 관리하기 쉬운 세포주를 사용하여, 내인성 단백질의 RNA 간섭을 통한 BRCA1 고갈 및 해당 세포 내 테스트 단백질의 재도입(add back)을 가능하게 하였습니다.

이제 변이 BRC1 단백질을 발현시켜 상동 재조합을 테스트할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 과정 중 발생하는 과도한 세포 사멸로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 세포 독성을 제한하면서 재조합 반응의 효과를 극대화할 수 있도록 형질전환 조건을 세심하게 설정하는 것이 중요합니다.

본 프로토콜을 시작하기 전에, P-D-R-G-F-P로 hela 세포를 형질전환하여 hela DR 13 nine 세포주를 구축하였습니다. 안정적으로 형질전환된 세포를 선별하기 위해 10 centimeter 페트리 접시의 pur mycin 배지에서 해당 세포주를 배양하십시오. P-D-R-G-F-P 플라스미드와 안정적 형질전환체 내의 재조합 기질은 두 개의 비활성 GFP 대립유전자를 포함하고 있습니다. 그중 하나의 대립유전자는 ISCE one에 대한 18 base pair 제한효소 인식 부위가 포함되어 있어 비활성 상태입니다.

이 세포들에서 ISCE1의 코딩 서열 발현은 비활성 GFP의 두 번째 대립유전자에 이중 가닥 DNA 절단(DSB)을 생성합니다. 첫 번째 대립유전자의 ISCE1 부위와 상관관계가 있는 서열 부분은 야생형입니다. 이 두 번째 GFP 대립유전자는 DSB의 상동 재조합 수선을 위한 서열 공여자(donor)로 기능할 수 있으며, 결과적으로 활성 GFP 대립유전자가 생성되어 첫 번째 형질전환 전날 유세포 분석법으로 쉽게 검출할 수 있습니다.

최소 90% 합류(confluent) 상태인 10 cm 디쉬의 HeLa DR 13 9 세포를 준비합니다. 1 mL의 trypsin을 사용하여 2~3분 동안 세포를 처리합니다. 9 mL의 DMEM-FBS를 첨가하여 반응을 중지시키고, 피펫팅을 통해 세포 현탁액을 잘 혼합합니다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 0.5 mL의 DMEM-FBS가 들어있는 상태에서 trypsin 처리된 세포 40 µL를 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.

1일 차에 세포의 합류도가 40에서 50% 사이여야 합니다. 내인성 b RCA one을 고갈시키기 위한 irna와 B RCA one 돌연변이 발현 플라스미드를 optimum media에서 혼합하여 형질전환을 시작합니다. 그 후, 핵산을 Lipofectamine과 함께 optimum media에서 혼합합니다.

제조사의 지침에 따라 리포펙션(lipofection) transfection을 진행하십시오. transfection 후 세포를 다시 인큐베이터로 옮겨 배양합니다. 4~6시간 후에 항생제가 포함되지 않은 배지로 교체하십시오.

둘째 날에 세포를 다시 배양기에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다. 각 웰에 0.3 milliliters의 trip le trypsin 시약을 첨가하여 세포를 트립신 처리합니다. 37 °C에서 짧게 배양한 후, 트립신 시약 내에서 세포를 피펫팅하여 떼어냅니다. 트립신 처리가 완료되면, 트립신 활성을 중단시키기 위해 세포를 24-웰 플레이트에서 2 milliliters의 D-M-E-M-F-B-S가 들어 있는 6-웰 플레이트로 옮깁니다.

최초 transfection으로부터 2일 전과 동일한 조건에서 6-웰 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 62.5 µL의 Optum에 SIR A, BRCA1 돌연변이 발현 플라스미드 DNA 및 ISCE1 발현 플라스미드를 준비합니다. 이 용액을 2.5 µL의 LIPECTOMY 2060 및 2.5 µL의 Optum과 혼합합니다.

4~6시간의 배양 후 세포 형질전환을 진행합니다. 배지를 항생제가 없는 D-M-E-M-F-P-S로 교체합니다. 6일째에 세포를 다시 배양기에 넣습니다.

각 웰에 0.5 mL의 트립신 시약을 첨가하여 세포를 트립신 처리합니다. 2 mL의 DMEM-FBS를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 실온에서 1000 RPM으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다. 세포를 1 mL의 신선한 DMEM-FBS에 재현탁하고, 웰당 10,000개의 세포를 대상으로 GFP 발현을 분석합니다.

유세포 분석법을 통해, 전방 산란광(forward scatter) 및 측방 산란광(side scatter) 파라미터를 사용하여 살아있는 단일 세포를 게이팅합니다. GFP 양성 세포는 GFP 형광 검출기를 통해 선별하며, 결과는 히스토그램으로 나타냅니다. 남은 세포들은 형광 사진 촬영을 위해 다시 플레이팅할 수 있습니다.

원하는 BRCA1의 현미경 관찰은 상동 재조합을 통한 DNA 이중 가닥 절단 복구 경로를 조절합니다. 상동 재조합에 의해 복구가 이루어진 세포들은 형광 현미경으로 쉽게 검출됩니다. RNAi를 통한 BRCA1의 고갈은 검출되는 GFP 양성 세포의 급격한 감소를 초래합니다.

FCA의 결과는 x축에 세포당 GFP 강도가, y축에 세포 수가 표시된 히스토그램으로 나타납니다. 발현 플라스미드를 형질전환하지 않은 경우, GFP 양성 세포가 검출되지 않습니다.

두 번째부터 여섯 번째 열의 결과는 모두 3일 차에 ISCE1 발현 플라스미드가 형질전환된 세포에서 얻은 것입니다. 단일 실험의 전형적인 결과 세트에서, ISCE1 발현 및 관련 없는 유전자에 대한 대조군 RNAi 결핍 시 15.5%의 세포가 GFP 양성을 나타냈습니다. 이와 비교하여 BRCA1 결핍 및 공벡터(empty plasmid vector) 추가 시 GFP 전환율은 0.7%로 감소했습니다. 외인성 야생형 BRCA1을 추가하면 15~16%의 GFP 양성 세포가 검출되어 상동 재조합이 완전히 회복되었습니다.

마찬가지로, 의미 불명 변이의 또 다른 발현 결과입니다. BRCA1 21B 돌연변이는 BRCA1 의존적 상동 재조합 기능을 완전히 회복시켰습니다. BRCA1 M18T 돌연변이를 다시 도입했을 때는 벡터 대조군과 유사한 효과가 나타났습니다.

이 변이체는 내인성 단백질과 유사한 수준으로 발현되었으므로, 이는 BRCA1 M18T 변이체가 상동 재조합에서 기능을 하지 않음을 시사합니다. 이 절차를 수행할 때 세포의 성장을 모니터링하는 것이 중요하며, 세포가 낮은 합류도에서 느리게 성장하므로 사용되는 transfection 혼합물의 양을 줄여야 합니다. 또한, 적절한 시점에 transfection 배지를 제거하는 것이 중요합니다.

형질전환 후 며칠 동안 배지에 항생제가 포함되어 있을 경우 세포독성이 높게 나타나는 것을 확인하였습니다. 이러한 이유로, 개발 후 1일 차 이후의 모든 배지에서는 항생제를 제외하였습니다. 이 기술은 유방암 연구 분야의 연구자들이 암 클리닉에서 임상적 의미가 알려지지 않은 BRC 1 변이체의 유전학적 특성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

본 연구에서 개발된 기능적 BRC one 분석법이 BRC one 변이가 암 소인에 미치는 영향에 대한 예측 능력을 향상시킬 수 있기를 기대합니다.