Qiagen Miniprep 키트를 사용하여 세균의 플라스미드 식민지에서 DNA를 정화

저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 생리학 및 생물물리학과 Mike Halen 교수 연구실 소속입니다. 오늘은 박테리아에서 DNA를 정제하기 위해 collagen mini fabricate를 사용하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 과정은 부위 특이적 돌연변이 유발 실험의 한 단계로 수행됩니다.

플라스미드를 얻은 후, 선택한 클론에 원하는 돌연변이가 포함되어 있는지 확인하기 위해 삽입물을 시퀀싱하겠습니다. 미니 프렙(mini preparation)을 수행하기 전에, 어제 진행한 내용을 간단히 소개하겠습니다. 박테리아를 배양하기 위해, 먼저 개별 튜브에 5 mL의 LB 배지를 접종해야 합니다.

보시는 바와 같이, 튜브에 박테리아를 넣기 전의 배지는 투명합니다. 그런 다음 P1000 파이펫을 사용하여 agar 플레이트에서 단일 콜로니를 접종하며, 오염을 방지하기 위해 매번 팁을 교체합니다. 이후 튜브를 쉐이커에 넣고 300 RPM으로 최소 8시간 동안 배양하며, 보통은 하룻밤 동안 배양합니다.

콜라겐 미니 조제 키트에는 세 가지 중요한 완충액이 포함되어 있습니다. 각각 P one, P two, N three입니다. P one은 RNA가 포함되어 있어 보통 4°C에서 보관하며, P two는 상온에 둡니다. N three의 경우, 실험 시작 8시간 전에 미리 준비합니다.

보시는 바와 같이, 박테리아가 내부에서 증식하고 있기 때문에 현재 배지가 탁해진 상태입니다. 배지 5 µL를 다른 플레이트에 도말하겠습니다. 이렇게 클론을 확인해 두면, 나중에 다시 박테리아로 바로 돌아갈 수 있어 별도의 형질전환을 다시 수행할 필요가 없습니다. 배지를 원심분리하고 나면 튜브 바닥에 박테리아 펠렛이 잘 형성된 것을 볼 수 있으며, 환경 오염을 방지하기 위해 상층액은 표백제에 버리고 펠렛만 남겨둡니다.

이제 버퍼 P1을 박테리아 펠릿에 첨가합니다. P1은 박테리아를 재현탁하기 위한 재현탁 버퍼입니다. 이제 파이펫으로 용액을 위아래로 섞어 박테리아와 버퍼를 혼합하겠습니다.

이 단계에서는 용액에 박테리아 덩어리가 보이지 않아야 합니다. 이제 재현탁된 박테리아를 새로운 Eppendorf 튜브로 옮기겠습니다. 저는 항상 튜브에 라벨을 붙여 혼동을 방지하고 어떤 용액이 어떤 클론에서 나왔는지 알 수 있도록 합니다.

이제 각 튜브에 buffer P 2를 첨가합니다. buffer P 2는 박테리아를 용해하기 위한 용해 버퍼(lysis buffer)입니다. buffer P 2를 첨가한 후에도 용액이 여전히 투명하지 않은 것을 볼 수 있습니다. 이제 모든 튜브를 여러 번 뒤집어 용액이 잘 섞이도록 합니다.

이제 용액이 투명해진 것을 볼 수 있습니다. 이제 각 튜브에 중화 완충액인 버퍼 N3를 첨가합니다. 버퍼 N3를 첨가하자마자 단백질 침전이 즉시 나타나지만, 용액을 충분히 혼합하기 위해 튜브를 여러 번 뒤집어 줍니다.

용액을 충분히 혼합합니다. 이것이 버퍼 3를 첨가한 후의 모습입니다. 이제 원심분리기를 사용하여 10분 동안 원심분리하여 단백질 침전물을 가라앉히겠습니다. Cal VAC 6S를 조립했습니다.

모든 부품을 순서대로 조립한 다음 진공 시스템에 연결합니다. 이제 캘리브레이션 준비 보조 도구인 스트랩을 매니폴드에 고정합니다. 오늘은 하나만 진행할 예정이므로 다른 슬롯들은 차단합니다.

이제 진공 상태가 양호하게 형성되었습니다. 보시는 것처럼 튜브에 맞춰 스트랩에 표시를 해두었으며, 진공 펌프를 켜면 진공이 잘 유지됩니다. 튜브를 원심분리한 후, 바닥에 단백질 펠릿이 형성된 것을 볼 수 있으며 DNA는 상층액에 여전히 용해되어 있을 것입니다.

이제 DNA가 포함된 상층액을 카우-프렙(cow prep) 스트립으로 옮깁니다. 여기서 언급해야 할 점은 교차 오염을 방지하기 위해 항상 팁을 교체해야 한다는 것입니다. 이제 진공 장치를 켭니다. 다시 진공 장치를 끄고, 현재 필터 내에 DNA가 포함되어 있는 스트립을 세척하기 위해 버퍼 PB를 첨가합니다.

이제 필터를 세척하기 위해 스트립에 PB 용액을 가하며, 이때 스트립의 필터에는 여전히 DNA가 포함되어 있습니다. 스트립을 건드리지 않는다면 팁을 교체할 필요가 없습니다. 이제 버퍼 PB와 동일한 방식으로 스트립에 버퍼 P를 가합니다.

진공 펌프를 켠 후 이 과정을 두 번 반복하겠습니다. 보시는 것처럼 현재 P 용액이 스트립을 통과하고 있으며, 필터가 완전히 건조되도록 진공 상태를 5분 더 유지하겠습니다. 5분간의 진공 처리 후, 박스에서 스트립을 꺼내 Kimwipe로 감쌉니다. 그리고 테이블에 가볍게 두드려 잔류 P 버퍼를 제거합니다.

이제 P buffer가 거의 떨어지지 않는 것을 볼 수 있으며, DNA는 여전히 필터 내에 남아 있어야 합니다. 여기 수집용 마이크로 튜브가 있으며, 스트립에 맞게 라벨을 붙였습니다.

이제 차량용 진공 청소기를 열어 수집용 마이크로 튜브와 함께 다시 조립하고, 스트랩이 마이크로 튜브와 일치하는지 확인합니다. 현재 매니폴드의 모습은 이와 같아야 합니다. 여기 스트립에서 마이크로 튜브로 DNA를 용출하도록 준비된 진공 매니폴드의 모습입니다.

스트립이 위에 있고 그 바로 아래에 동일하게 라벨링된 튜브가 있습니다. 이제 진공 없이 스트립에 멸균수를 가하고 1분 동안 그대로 둡니다. 이번에는 진공 시간이 길어지면, 보시는 바와 같이 물이 스트립을 통과하여 수집 마이크로 튜브로 들어갑니다.

물에 DNA가 포함되어 있습니다. 모든 물이 수집될 수 있도록 진공 상태를 잠시 유지합니다. 다음은 해당 단계 이후 DNA 용액이 담긴 수집 마이크로 튜브입니다.

안녕하세요, 지금까지 칼슘 미니 프렙 키트를 사용하여 박테리아로부터 DNA를 정제하는 방법을 보여드렸습니다. 이제 올바른 클론을 확인하기 위해 삽입물을 서열 분석하였으며, 이 방법의 사용에 대해 언급해야 합니다. DNA의 양은 보통 마이크로그램 수준입니다.

실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사합니다.