Name: 마우스 침샘에 줄기 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 마우스 침샘에서 줄기 세포를 분리하는 최적화된 방법을. 효소 및 기계적 소화를 사용하여 살리스피어를 배양하고 재생 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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1. 리젠트 준비 <ol><li> 버퍼 : 1 % (W / V) 행크의 균형 소금 용액에 소 혈청 알부민 </li><li> Reconstitute 효소. Hyaluronidase 효소 : 버퍼에 용해 40mg / ML. Collagenase II : 23mg / ML, 버퍼에 용해. 각 절연 신선한 신선한 효소 솔루션을 사용합니다. 4 녹아 저장 ° C 소화에 사용까지. </li><li> 증류수 50 MM의 염화칼슘. 0.2 UM 기공 크기의 필터를 통해 소독을 필터링합니다. </li><li> 마우스 침샘 (MSG) 배지 : DMEM : 페니실린과 F12 (100 IU / ML), 스트렙토 마이신 (100 μg / ML), glutamax (2 ㎜), 표피 성장 인자 - 2 (20 NG / ML), fibroblast의 성장 인자 -2 (20 NG / ML), N2 보완 (1 %), 인슐린 (10 μg / ML)과 dexamethasone (1 μm의). </li></ol> 2. 기계 및 효소 조직 소화 <ol><li> 해부 침샘을 나가는거야. </li><li> 작은 배양 접시에있는 무균 곡선 해부 가위를 사용하여 동질적인 펄프로 분비 잘라. </li><li> 80mg 턱밑 조직마다 버퍼의 1mL를 사용하여, 14 ML 튜브에 다진 조직을 수집합니다. 버퍼의 일부를 사용하여 조직의 깨끗한 배양 접시를 씻어. </li><li> 25 μL collagenase 효소 II 솔루션, 25 μL hyaluronidase 효소 솔루션 80 MG 조직 당 250 μL 염화칼슘 용액 다음 80 MG 조직마다 버퍼의 또 다른 한 ML을 추가합니다. 2.9 편의를 위해 T25 조직 문화 flasks에서 수행할 수 있습니다 - 조직의 대용량과 함께 일하고있다면, 2.4이 단계를 반복합니다. </li><li> 20 분 ° C 37 세트 떨고 waterbath에 품어. 튜브를 제거하고 다시 조직을 통해 철저하게 효소를 섞어 피펫으로 씹다. </li><li> 또 다른 20 분 대한 waterbath로 바꿉니다. </li><li> 팔분에 대한 400 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 각 80 MG 조직 2 ML 버퍼에 Resuspend, 이상과 같은 효소와 염화칼슘 추가를 반복합니다. 물 목욕을 흔들어 20 분 알을 품다. 튜브를 제거하고 철저하게 효소를 섞어 피펫으로 씹다. </li><li> 물 목욕을 흔들림의 마지막 20 분 알을 품다. , 위와 같이 원심 분리하여 세포를 수집 뜨는 폐기. </li></ol> 3. 워싱 단계 <ol><li> 2 ML 버퍼와 효소의 무료 조직을 씻어 피펫으로 조직의 각 80 MG를 Resuspend. </li><li> 수집하는 등 이전에 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 80 MG 조직 당 한 ML 버퍼를 사용하여 씻어 반복합니다. 수집 뜨는 폐기하기 위해 원심 분리기. </li></ol> 4. 필터링 <ol><li> 80 MG 조직 당 한 ML 버퍼에 Resuspend 조직 솔루션입니다. </li><li> 50 ML 팰컨 튜브를 통해 배치 100 μm의 기공 크기의 필터 솔루션을 추가합니다. 필터가 차단 될 수 있으므로, 컬럼마다 다진 조직 솔루션의 3 개 이상 MLS를 적용하지 마십시오. 을 통해 침투 수 있습니다. 피펫으로 필터의 아래쪽에 매달려 필터링된 자료를 제거하고, 여과액 추가할 수 있습니다. </li><li> 50mL 튜브에서 여과물을 5 ML 튜브 50 μm의 기공 크기의 필터를 적용 26 게이지 바늘로 주사기를 사용하십시오. 필요한 경우 피부를 느슨해진하여 지원을 통해 필터링할 수 있습니다. </li><li> 원심 분리기 튜브는 이전에 수집합니다. 뜨는 폐기하십시오. </li></ol> 5. 도금 및 매체 <ol><li> 하나의 볼륨으로 모든 알약을 결합합니다. 자동 셀 카운터 또는 혈구계를 사용하여 계산합니다. </li><li> 0.4 X 10 6 12 잘 플레이트 잘 당 세포, 또는 2.67의 밀도에 플레이트 세포 T25 조직 배양 플라스크 당 X 10 6 세포. 각 T25 플라스크에 각각 잘 또는 6 ML 1 ML의 MSG 매체를 추가합니다. </li><li> 37 품어 ° C. 분야는 하루에 2 명확하게 표시해야합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : 문화 2-3일 후, 전지 (salispheres)의 작은 집계는 문화에 분명합니다. Salispheres 문화에서 10 일 기간 동안 크기로 성장할 것입니다. salispheres 대표 위상 콘트라스트 현미경 이미지는 그림 1에 표시됩니다. 줄기 세포 관련 마커 단백질을 표현 Proliferating 전지는 최적의 3-5 일 이후 절연 사이에,이 분야에서 고립, 그리고 기능, 타액 생산 acinar 세포로 분화 능력이있다 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2484/2484fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 체외에서 Salisphere 형성. 현재 프로토콜을 사용하여 기계적 소화 효소에 따라 증가하는 크기의 분야는 부동 문화에서 찾을 수 있습니다. 패널 며칠 0 (A), 4 분야의 대표적인 위상 콘트라스트 현미경 이미지 (B), 7 (C) 10 (D)입니다. 스케일 바 = 50 μm의.

<ol><li>Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Nape&ntilde, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+xerostomia+%28dry+mouth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Odontology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth).</a> Odontology. 97, 76-83 (2009).</li>
<li>Denny, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenchymal+cell+proliferation+and+mechanisms+for+maintenance+of+granular+duct+and+acinar+cell+populations+in+adult+male+mouse+submandibular+gland%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland.</a> 235, 475-485 (2005).</li>
<li>Man, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+a+perinatal+cellular+phenotype+in+submandibular+glands+of+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat.</a> J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

조직 배양 방법은 줄기 세포 함유 생쥐의 침샘에서 salispheres을의 격리에 대한 재현성 프로토콜을 나타냅니다 여기에서 설명한. 이러한 방식으로 분리된 세포를 사용하는 연구는 침샘에 줄기 세포 9 재생 능력을 강조했습니다. salispheres에서 파생된 C - 키트 + 세포 백의 이식은 조사 마우스 침샘의 기능 회복을 유도. 이러한 데이터는 흥분하고 xerostomia를위한 줄기 세포 기반 치료의 조사를위한 출발점을 제공합니다. 많은 아베는 줄기 세포의 전체 마커 단백질 발현 프로파일, 조사 귀밑샘 분비 관이 그 반대의 기능을 구출하기 턱밑 분비의 능력, 그리고 생체내 줄기 세포 틈새에서 putative의 특성을 포함하여, 그러나 탐험으로 남아 세포. 결국, 인간의 조직 샘플과 분리된 세포를 사용하여 인간의 환자 xerostomia의 치료에 대한 후속 가능성이 프로토콜의 번역이 설명한 방법의 가장 흥미로운 응용 프로그램입니다.

<table><tbody><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>&amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C에서 보관</td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>4 &amp;#x00B0;C에서 보관</td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>인산염 완충 식염수(PBS)로 10 &amp;#x03BC;g / mL 농도의 스톡 용액을 제조한다. 1회 분량으로 소분하여 &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C에서 보관한다.</td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>PBS로 25 &amp;#x03BC;g / mL 농도의 스톡 용액을 제조한다. 1회 분량으로 소분하여 &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C에서 보관한다.</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>제조사 지침에 따름.</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>수돗물로 2 mg / mL 농도의 스톡 용액을 제조한다. 용해 전 빙초산을 사용하여 물의 pH를 2-3으로 조정한다.</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;M 공경 멸균 세포 스트레이너</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>세포 스트레이너 캡이 포함된 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브 (50 &amp;mu;M 공경)</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 침샘에 줄기 세포의 분리

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

인간과 마우스 양쪽 원산지 성숙 침샘은 구강에 타액의 생산과 배설을 용이 각각 다섯 세포 유형의 최소 구성됩니다. 묽은 및 점액 acinar 세포는 각각 단백질과 선 (腺)의 점액 생산 공장이며, 타액 생산의 출처를 나타냅니다. 일단 합성, 타액의 여러 효소 및 기타 proteinaceous 구성 요소는 구강의 구멍에 한 가지 큰 덕트를 통해 타액의 최종 퇴학까지 상피 타입 형태를 베어링 ductal 세포의 일련을 통해 분비됩니다. 타액의 구성도이 과정에서 ductal 세포에 의해 수정됩니다. 이러한 Sjögren 증후군과 같은 질병의 발현에서와 같은 내분비선을 통해 머리와 목 암, 타액 생산을위한 방사선 치료와 같은 일부 임상 상황에서 극적으로 1,2을 줄일 수있다. 결과 xerostomia, 구강 건조의 주관적인 느낌이, 제비와 대화할 수있는 환자의 능력뿐 아니라 영향을뿐만 아니라, 치과 카리 에스의 개발을 장려하고 괴로워하는 사람에 대한 사회적 쇠약 수 있습니다. 위에서 언급한 임상 조건에서 타액 생산의 복원 따라서 충족되지 임상 필요성을 대표하고, 이러한 여러 연구 침샘 3-5의 재생 능력을 보여준 것처럼. 마우스와 인간의 몸에서 6-8 내의 여러 조직에서 세포의 줄기 세포와 같은 인구의 고립을 더욱, 우리는 마우스 침샘에서 분리된 줄기 세포가 조사 타액의 타액 생산을 구출하는 데 사용할 수있는 설명 방법을 사용 보였습니다 땀샘 9,10. 이 발견은 multipotent 자기 갱신 기능을 통해 세포를 포함하는 microenvironment로 침샘의 탐사에도 인간 xerostomic 조건의 치료를위한 줄기 세포 기반 치료법​​의 개발을위한 방법으로 불법 체류자합니다.

마우스 침샘에서 줄기 세포의 격리를 위해 최적화된 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 효소와 소화 기계를 고용하고, 줄기 세포의 특징과 세포를 포함하는 salispheres의 절연을 수 있습니다.

인간과 생쥐 모두의 성숙한 타액선은 최소 5가지의 세포 유형으로 구성되며, 각 세포 유형은 ...의 생성 및 배출을 촉진합니다.

본 실험 절차의 전체적인 목표는 신경 SIV 샘에서 추정 줄기세포를 분리하는 방법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 성체 마우스로부터 턱밑샘을 채취합니다. 절차의 두 번째 단계는 곡선 가위를 사용하여 조직을 균질한 펄프 형태로 처리하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 콜라게나아제(collagenase)와 더 높은 농도의 라이아제(liase) 효소를 사용하여 조직을 추가로 소화시키는 것입니다. 조직이 과도하게 소화되지 않도록 주의해야 합니다. 완전한 세포 현탁액에서는 구체(sphere)가 많이 생성되지 않으므로, 2~3개의 세포로 이루어진 클러스터 상태가 최적입니다.절차의 마지막 단계는 균질액을 100 micron 및 50 micron 필터로 여과하는 것입니다. 최종적으로, 전체 SIV 샘의 기계적 및 효소적 소화를 결합하여 사용하여 siv 샘 줄기세포의 배양 및 분리를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 응용 범위는 방사선 치료로 인해 발생할 수 있으며 구강 건조증으로도 알려진 Xerostomia의 치료까지 확장됩니다.침샘 줄기세포는 두경부암 환자의 구강건조증을 치료하는 데 사용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전에 완충액, 마우스, 침샘 배양액, 배지 및 효소 용액을 준비하십시오. 동봉된 서면 프로토콜에 따라 모든 해부 및 조직 배양 단계는 멸균된 조직 배양 후드 내에서 수행되어야 합니다.마우스의 타액선을 분리 및 해부한 후, 저울로 타액선 조직의 무게를 측정하고 기록합니다. 스패튤라를 사용하여 타액선을 작은 페트리 접시에 옮기고, 곡선 해부 가위를 사용하여 타액선을 균질한 펄프 형태로 잘게 다집니다. P 1000 피펫 팁의 끝부분을 잘라 개구부를 더 넓게 만듭니다.이를 사용하여 조직 80 mg당 1 mL의 완충액을 페트리 접시에 피펫팅하고, 균질물을 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 조직 80 mg당 1 mL의 완충액을 페트리 접시에 다시 한 번 붓습니다. 남아 있는 작은 조직 조각들을 수집하기 위해, 이 용액을 원심분리 튜브에 추가합니다.그런 다음 염화칼슘 용액 250 µL, 히알루로니다아제 용액 25 µL, 그리고 콜라게나아제 25 µL를 빠르게 첨가합니다. 조직 80 mg당 두 종류의 효소 용액을 사용합니다. 조직과 효소 혼합물이 담긴 튜브를 37 °C의 진탕 수조에 넣고 20분 동안 배양합니다.배양 후 튜브를 꺼냅니다. 이전과 같이 끝부분을 제거한 P 1000 팁을 사용하여 조직과 효소 용액을 약 10회 충분히 혼합합니다. 튜브를 37 degrees Celsius 항온수조에 넣고 20분 동안 추가로 배양합니다.두 번째 배양 기간이 끝난 후, 샘플을 400 ×g에서 8분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 상층액을 제거하고, 시작 조직 80 mg당 2 mL의 완충액을 사용하여 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다. 그 다음 염화칼슘 용액 250 µL, 히알루로니다제(hyaluronidase) 용액 25 µL 및 콜라게나제(collagenase) 용액 25 µL를 추가합니다. 조직 80 mg당 두 가지 효소 용액을 첨가합니다.그런 다음 튜브를 37 °C 진탕 수조에 넣고 20분 동안 배양합니다. 수조에서 조직을 꺼내어 이전 배양 단계와 동일하게 반복합니다. 샘플을 400 ×g에서 8분 동안 원심분리합니다.한 번 더 반복한 후 상층액을 제거합니다. 이전 원심분리 후, 조직을 여과하기 위한 세척 준비가 완료되었습니다. 튜브에 버퍼 2 mL를 피펫으로 넣고 잘 섞어줍니다.재현탁 후 펠릿을 부유시킵니다. 샘플을 400 ×g에서 8분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 피펫으로 상층액을 제거합니다.튜브에 조직 80 mg당 1 mL의 완충액을 넣고 다시 균질화합니다. 펠릿을 재현탁합니다. 원심분리를 반복합니다.8분 동안 400 ×g로 원심분리합니다. 원심분리하는 동안, 50 mL 원심분리 튜브 위에 100 micron 공극 크기의 필터를 배치하여 여과 단계를 준비합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 버리고, 조직 80 mg당 최종 1 mL의 완충액을 튜브에 피펫으로 넣습니다. 펠렛이 완전히 재현탁되도록 끝단 절단기가 장착된 P 1000 팁을 사용하여 피펫팅을 반복합니다.그런 다음 균질액을 100 micron 공극 크기의 필터로 옮기고, 필터를 통해 50 milliliter 원심분리 튜브로 스며들게 합니다. 필터가 막힐 수 있으므로 균질액을 3 milliliter 이상 넣지 않는 것이 중요합니다. 이 용량을 초과한 경우, P 1000 피펫을 사용하여 필터 하단에 모인 조직을 제거하고, 이 조직을 여과액이 들어 있는 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다.26 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기를 사용하여 50 mL 원심분리 튜브에서 균질액을 흡입한 후, 5 mL 튜브 위에 장착된 50 µm 공극 크기의 필터 캡에 도포합니다. 균질액이 필터를 통해 스며들도록 둡니다. 여과 속도가 느린 경우, 필터 캡이 너무 조여져 있을 수 있으므로 느슨하게 조절하십시오.균질액이 필터를 통해 튜브로 모두 통과했을 때 씰이 필터링을 방해할 수 있습니다. 샘플을 400 ×g에서 8분 동안 원심분리하십시오. 원심분리 후, 펠렛 형태의 세포를 플레이트에 도말할 준비가 됩니다.타액선 세포는 조직 80 mg당 1 mL의 MSG 배지로 재현탁하는 것으로 시작합니다. 표준 프로토콜에 따라 세포 수를 측정하십시오. 여기서는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정합니다.0.4 × 10⁶ 개의 세포에 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산하고, 이를 바탕으로 분주 가능한 웰 수를 결정합니다. 12-웰 배양 플레이트의 각 웰에 MSG 배지 1 mL를 첨가합니다. 세포 현탁액이 충분히 혼합되었는지 확인한 후, 각 웰에 0.4 × 10⁶ 개의 세포에 해당하는 부피의 세포 현탁액을 첨가합니다.플레이트를 37 °C, 5% 이산화탄소 배양기에 옮깁니다. 2일간 배양한 후, 배양물에 SLOs 구체가 형성되었는지와 세포 내 ace의 결핍 여부를 확인합니다. 이는 설명된 방식대로 처리된 마우스 침샘 조직을 위상차 현미경으로 배양 0일부터 10일까지 관찰한 예시이며, 작은 세포 응집체들이 SLOs 구체로, 이 기간 동안 크기가 계속 성장합니다.여기에는 줄기세포 마커인 Protein C kit에 대한 대표적인 3~5일 차 SLOs 구체 배양의 면역 염색 결과가 나타나 있습니다. 유세포 분석으로 분석한 결과, sea kit의 발현을 통해 SLOs 구체 배양 내에 추정 줄기세포가 존재함이 확인되었습니다. 3~5일 된 SLOs 구체는 또한 분화되어 실제 타액선과 유사한 형태의 선 및 도관 유사 구조를 형성할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 마우스 침샘에서 침샘과 줄기세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

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Ex vivo Live Cell Imaging을 통한 타액선의 세포 간 상호 작용 조사

배우세요 마우스 침샘에서 줄기 세포를 분리하는 최적화된 방법을. 효소 및 기계적 소화를 사용하여 살리스피어를 배양하고 재생 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

마우스 침샘에 줄기 세포의 분리

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