Name: Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 배우세요 지질 입방상(LCP)을 이용한 막 단백질 결정화 방법을 통해 고품질 결정을 얻는 기술입니다. LCP-FRAP 선별법과 최적화 과정을 통해 X선 회절 분석용 결정을 효율적으로 제조할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH 보조금 GM073197 및 RR025336의 부품에 투자했다.

meso의 결정화 실험에의 일반적인 개요는 Fig.1 1,2로 표시됩니다. 사전 결정 LCP - FRAP의 assays은 선택 사항입니다 있지만, 그들은 크게 특히 어려운 막 단백질 3의 경우, 초기 결정화 조건 검색하는 과정을 가속하실 수 있습니다. 1. LCP의 단백질 Reconstitution <ol><li> 세제 솔루션에 대한 관심의 막 단백질을 정화하고 ~ 10 단백질 / 세제 단지 집중 - 20 MG / ML을 통해 - 집중 세제 1,4에 관심을 찍어. </li><li> 전송 ~ LCP 호스트 지질 (일반적으로 monoolein) 또는 40 1.5 ML 플라스틱 관과 부화에 지질 혼합물의 25 MG ° C 몇 분 동안 지방질이 녹으까지. </li><li> 100 μL 가스 기밀 주사기에 주사기의 커플러를 연결합니다. </li><li> 조정 볼륨 피펫을 사용하여 용융 지질과 주사기를로드합니다. 주사기에있는 지방질의 볼륨을 기록합니다. </li><li> 단백질 솔루션 - 투 - 지질 비율 3분의 2 V /에서 단백질 솔루션으로 앞으로 100 μL 주사기를 로드할 대 </li><li> 주사기의 커플러를 통해 함께 두 주사기를 연결합니다. </li><li> 지질 mesophase가 균질 될 때까지 주사기가 앞뒤로, 커플러의 내부 주사 바늘을 통해 지방질과 단백질을 이동 번갈아 plungers 누르십시오. LCP는 기계적 혼합시 자발적으로 형성하고, 단백질은 LCP의 지질 이중층에 재구성된다. LCP의 형성은 작은 각도 X - 선 회절 1을 사용하여 가능하면 교차 polarizers 장착된 현미경으로 볼 때 그 투명성과 겔형 일관성에 의해 및 birefringency의 부재에 의해 검증, 또는 수 있습니다. </li></ol> 2. LCP - FRAP 사전 결정화 Assays LCP - FRAP의 assays는 심사 조건 3 다양한에서 LCP의 재구성 막 단백질의 확산 특성을 측정하기 위해 고안되었습니다. LCP의 막 단백질의 장거리 확산은 성공적인 결정을 위해 필수적입니다 있으나, LCP의 미세 구조는 큰 단백질이나 oligomeric 단백질 집계의 확산을 constrains. meso의 결정화 실험에서 실패를위한 일반적인 이유는 확산의 손실로 이어지는 빠른 단백질 집합입니다. 이것은 단백질의 집계 문제는 특정 단백질 구조, 호스트 지질 및 심사 솔루션 3 구성에 따라 달라집니다 것으로 나타났습니다. <ol><li> ~ 1분의 100의 단백질 / 염료 비율에서 형광 염료 (Cy3 또는 이와 유사한 것)와 단백질을 분류, unreacted 염료를 제거하고 ~ 1 MG / ML에 단백질을 집중. 레이블 중 무료 아민 또는 무료 thiols. 무료 아민을 라벨 때, predominately 자유 N - 말단 레이블을 7과 7.5 사이의 산도를 사용합니다. 아미노산 라벨은 또한 lipids 단백질 2,3 공동 정화 레이블을 수있다는 점에 유의하십시오. </li><li> Reconstitute로 제 1에서 설명한 LCP의 표시 단백질). </li><li> 대신 결정화 화면 2 LCP - FRAP 검사 솔루션을 사용) 제 3에서 설명한대로 분석 번호판을 설정합니다. </li><li> 20 접시를 품어 ° 평형 상태를 달성하기 위해 최소한 12 시간 동안 어둠 속에서 C. </li><li> 10X 목표를 사용하여 잘 첫 LCP - FRAP 기차역과 집중 플레이스 접시 중 하나를. </li><li> 처음 이전 표백 상태를 캡처 5 형광 이미지를 취득. </li><li> 레이저를 트리거. 표백 지점의 중앙에 표시된 단백질의 70 % - 펄스의 레이저 전원과 전화 번호는 표백제 ~ 30으로 조정해야합니다. </li><li> 바로 레이저를 실행 후, 가장 빠른 속도로 ~ 200 이미지의 빠른 사후 표백 시퀀스를 녹음 시작합니다. </li><li> 단백질의 확산 속도에 따라 10-20의 이미지로 사이의 지연 시간을 선택 ~ 50 이미지의 느린 후 표백제 순서의 기록과 함께하십시오. </li><li> 모든 프레임에있는 표백제 지점 내부의 강도를 통합하고 레이저 표백 영역 밖의 참조 지점의 평균 농도로 표백 현장 내부의 강도를 나누어 수집하는 동안 강도 변동을 표백과 빛을 위해 수정. </li><li> 1 같은 사전 표백 강도와 0으로 동등한 초기 표백 강도를 확인하기 위해 수정된 강도를 정상화. </li><li> 다음 방정식 5를 사용하고, 표준 강도 대 시간, F (t)의 곡선에 맞게 : F (t) = M X EXP (- 2T / T) × (I 0 (2T / T) + I 1 (2T / T)), (Eq.1) M은 diffusing 분자의 모바일 분수이고, T는 특성 확산 시간, T는 전 0 각 기록된 프레임의 실시간이며 1 0 회와 베셀 함수를 수정 제 1 순서입니다. </li><li> 확산 계수, D를 같이 계산 : D = R 2 / 4T (Eq.2) 어디 R은 표백 지점의 반경이다. </li><li> t으로 이동2.13) - 다음 잘하고 단계를 반복 2.5) O. </li><li> 다른 심사 조건 얻은 모바일 분수와 확산 계수를 비교합니다. 디자인 새로운 결정은 단백질 보급과 단백질 확산이 관찰되지 않은에 대한 제외 조건을 촉진하는 구성 요소에 따라 화면. 단백질은 검사 조건에도 확산하지 않은 경우, 심사 공간을 확대하거나 새로운 단백질 구조하려고 생각합니다. </li></ol> 3. LCP 결정화 평가판 설정 <ol><li> LCP의 Reconstitute 단백질 등) 제 1에서 설명한. </li><li> 반복 주사기 자동 지급기에 부착된 10 μL 가스 기밀 주사기로 단백질 라덴 LCP을 전송합니다. </li><li> 10 μL 주사기로 짧은 이동식 바늘 (게이지 26, 10mm 길이)를 연결합니다. </li><li> 2x2 사각형을 형성 네 인접한 웰스의 표면에 LCP 200 NL의 boluses 하는걸. </li><li> 해당 결정화 화면 솔루션 1 μL와 LCP의 boluses 각 오버레이. </li><li> 18mm 정사각형 유리 coverslip와 모자 네로드 웰스. 우물을 봉인하기 위해 coverslip에 부드러운 압력을 적용합니다. </li><li> 전체 접시가 가득 때까지 네 우물의 다음 세트) 단계 3.4) -3.6를 반복합니다. </li><li> 주기적으로 크리스탈 형성과 성장에 대한 확인, 일정한 온도에서 접시를 품어. </li></ol> 4. LCP에서 결정 수확 <ol><li> 선형 편광 회전 및 분석기가 장착된 가변 줌과 스테레오 현미경으로 단백질 결정과 접시를 놓습니다. </li><li> 평생 잘가 볼 분야 내에서 배치되도록 낮은 전력 축소를 사용하여 관심있는 잘 중점을 둡니다. </li><li> 세라믹 모세관 절삭 석의 날카로운 모서리를 사용하여 잘 경계 안에 사각형을 만드는 네 뇌졸중의 coverslip 유리를 점수. </li><li> coverslip 유리의 두께를 통해 흠집을 전파하기 위해 강한 날카로운 점 핀셋으로 득점 주위에 누르십시오. </li><li> 점수 광장의 반대편 구석에 펀치 구멍이 작은. </li><li> 이후 단계 동안 탈수를 줄이기 위해 구멍 중 하나를 통해 침전제 솔루션의 몇 가지 μL를 주입. </li><li> 직각 날카로운 바늘 프로브를 사용하면 컷 아웃 광장을 무료로 하나 또는 두 개의 면을 따라 유리를하다. </li><li> 조심스럽게 입방 위상 볼러스에 대한 유리 스퀘어 시청을 올려요. 볼러스이 coverslip에 붙어있다면, 우물의 바닥에 유리를 통해 광장과 장소를 플립. </li><li> 와 보충 침전제 솔루션의 추가 몇 μL를 추가 cryo - protectant, 필요한 경우, 우물에 노출 입방 위상 볼러스 위에. </li><li> 현미경의 배율을 증가하고 수정하는 데 중점을 둡니다. </li><li> 수확 루프를 볼 수있을만큼 가벼운 유지하면서, 편광과 복굴절 결정과 배경 사이의 대비를 증가 분석기 사이의 각도를 조정합니다. </li><li> 크리스탈 크기를 일치 직경 MiTeGen MicroMount를 선택하고 다음 MicroMount에 그것을 떠서하여 LCP에서 직접 크리스탈을 수확. </li><li> 플래시 액체 질소의 수확 크리스탈 MicroMount을 동결하고, X - 레이 데이터 수집 6 싱크로 트론 소스 beamline로 보내주십시오. </li></ol> 5. 대표 결과 : 설계 인간 베타 2 아드레날린 G 단백질 결합 수용체 (β 2 AR - T4L)은 baculovirus sf9 곤충 세포를 감염 dodecylmaltoside (DDM) / 부분 역 작용제 carazolol 7 바운드 cholesteryl hemisuccinate (CHS) 세제 용액에 정화로 표현되었다. 단백질은 Cy3 NHS 에스테르로 표시하고 LCP - FRAP 미리 결정화 assays (그림 2)에 사용되었다. LCP - FRAP assays의 결과에서 선택한 여러 조건에 따라 거친 그리드 화면 초기 크리스탈처럼 조회 (그림 3)을 생산. 침전제 조건 추가 최적화 회절 품질 결정 (그림 4)를 굴복. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 전형적인 LCP의 결정화 실험의 흐름 차트. 회색 상자에서 단계를 현재 프로토콜에서 설명하지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> monoolein 기반 LCP의 β 2 AR-T4L/carazolol과 그림 2. LCP - FRAP 분석. A) LCP - FRAP 분석 결과는 96 - 웰 플레이트의 각 샘플이 순차적으로 표백하고 형광 복구는 30 분 보육 후에 측정되는, 자동으로 높은 처리량 모드에서 수행했습니다. 각 예제에서 모바일 분수를 나타내는 얻은 형광 recoveries은 모든 96 샘플 꾸몄다 있습니다. 심사 솔루션은 두 가지 다른 농도 48 다른 소금과 함께 0.1 M 트리스 산도 8, 30 % V / V PEG 400이 포함되어 있습니다. B) 여러 세일즈맨을위한 형광 복구 프로필resentative 조건. 실선 곡선은 EQ로 맞는를 나타냅니다. 1.The 모바일 분수와 확산 계수는 Eqs를 사용하여 결정됩니다. 1 2. 나 염화가 들어있는 예제에서 10 % 미만의 빠른 회복은 단백질과 함께 공동 정화 찬란 표시 lipids 때문입니다. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. β 2 AR-T4L/carazolol의 초기 결정 조회수가 황산 나 포함, LCP - FRAP 식별 가장 유망 조건 주위에 굵은 격자 심사에 의해 얻은 (패널 A)과 나 편대 (패널 B). 단백질은 Cy3 NHS 에스테르로 표시되고 형광 이미지는 605 nm의에서 543 nm의 여기에서와 방사를 사용하여 촬영하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. β 2 AR-T4L/carazolol의 최적화 결정. (패널 A와 B) 나 황산의 존재에서 재배 결정의 이미지와 K 편대는 (패널 C와 D) 브라이트 모드 (패널 A 및 C)에서 찍은 상호 polarizers을 (패널 B와 D)를 사용하고 있습니다.

<ol><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LCP-FRAP+assay+for+pre-screening+membrane+proteins+for+in+meso+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth+Design%22%5BJournal%5D)">LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization.</a> J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).</li>
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<li>Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centering+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+micrometer+size+X-ray+synchrotron+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+nanoliter-volume+dispenser+for+highly+viscous+materials+used+in+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization.</a> J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+screens%3A+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

프로토콜은 meso의 결정화 실험의 수행에 관련된 기본 단계에 대한 기본적인 시각 지침을 제공합니다. 심층의 가능한 함정을 강조 이러한 프로토콜에 관한 세부 사항 더, 결점이나 대안 노선은 다른 1,2 사용할 수 있습니다. 옵션 LCP - FRAP의 assays은 가장 유망한 단백질 구조, LCP 호스트 지질 및 지질 첨가제뿐만 아니라, 가능한 precipitants 및 버퍼 조건 3 범위를 제한을 선택합니다 이전 단계에서 도움이 될 수 있습니다. 초기 결정화 히트가 발견되면, 그것은 더 나은 품질의 결정을 얻기 위해 최적화해야합니다. meso의 결정화 조건의 최적화는 LCP 1의 구성과 관련된 추가적인 매개 변수의 추가와 함께 가용성 단백질에 대한 조건을 최적화하기 위해 본질적으로 비슷합니다. lipidic mesophase 재배 막 단백질 결정은 일반적으로 세제 용액에서 얻어진 결정보다 크기가 작은,하지만, 더 많은 현대적인 싱크로 트론 소스 6 microfocus를 사용 강하게 benefitting, 따라서 가능한 beamlines 명령했다. , 결정 또는 분석 번호판을 설정 LCP - FRAP의 assays를 실시하고 결정을 감지 포함한 meso의 결정,에 관련된 절차의 대부분은 허용, 1,2,8,9 반 또는 완전히 자동되었습니다 조건의 큰 범위의 심사 단백질과 지방질의 소비 소량 동안. 한편, LCP 및 수정 수확의 단백질 reconstitutions 수동 더 지루한 작업을 유지하고, 따라서, 개선을위한 필요가있다.

<table><tbody><tr><td>100 &amp;mu;L 가스 기밀 시린지</td><td>Hamilton Co</td><td>7656-01</td><td>시린지 2개가 필요함</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L 가스 기밀 시린지</td><td>Hamilton Co</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>시린지 커플러</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-02 30902</td><td>커플러는 참고문헌 10에 설명된 대로 가용한 부품을 사용하여 제작할 수 있음</td></tr><tr><td>반복 정밀 분주 시린지</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td>반복 정밀 분주 시린지는 분주 부피를 약 3배 정도 줄이도록 수정할 수 있음&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>짧은(0.375&amp;#8221;) 평평한 팁의 탈착식 바늘(포인트 스타일 3, 게이지 26)</td><td>Hamilton Co</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 유리 샌드위치 플레이트</td><td>Marienfeld</td><td>08 900 03</td><td>수동 조작의 경우, 표준 현미경 유리 슬라이드와 구멍이 뚫린 양면 테이프를 사용하여 유리 샌드위치 플레이트를 조립하는 것이 더 편리함&lt;sup&gt;1,2,12&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787-01</td><td></td></tr><tr><td>monoolein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7765</td><td></td></tr><tr><td>결정화 스크리닝 키트</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>시판되는 대부분의 스크리닝 키트를 초기 스크리닝에 사용할 수 있음. LCP를 지속적으로 파괴하는 조건은 더 나은 적합성을 위해 2배 희석하여 사용할 수 있음&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>모세관 절단석</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-334</td><td></td></tr><tr><td>미세 핀셋</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>각진 날카로운 프로브</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13650</td><td></td></tr><tr><td>MicroMounts</td><td>MiTeGen</td><td>M1-Lxx-xx</td><td>결정 크기에 맞는 MicroMount 직경을 선택함</td></tr></tbody></table>

lipidic mesophases의 막 단백질의 결정화

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

막 단백질은 전달, 운송 및 에너지 변환, 그리고 같은 고장과 질병의 다수 연루된다 신호에 관한 살아있는 세포에서 중요한 기능을 수행합니다. 그러나, 멤브레인 단백질의 구조와 기능 이해 강하게 인해 회절 품질 결정 자신의 solubilization 및 생성과 관련된 문제로, 주로 그들의 가용성 파트너의 뒤쳐지고있다. lipidic mesophases의 결정체 (또한 meso 또는 LCP 결정화에서라고도 함) 성공적으로 미생물 rhodopsins, 광합성 단백질, 바깥쪽 막 베타 두통 및 G 단백질 결합 수용체의 고해상도 구조를 얻기 위해 적용했던 ​​유망 기술입니다. meso에 결정은 네이티브처럼 막 환경을 활용하고 일반적으로 낮은 용매 컨텐츠 및 세제 솔루션에서 전통적인 결정에 비해 더 나은 주문과 수정을 생산하고 있습니다. 방법은 어려운 것은 아니지만 점성 mesophase 자료를 취급하는 지질 위상 행동과 실천의 이해를 필요로합니다. 여기 LCP을하고, 분석 또는 결정화 판에 LCP의 nanoliter의 일부를 분배 미리 결정화 assays를 실시하고으로부터 결정을 수확하여 다음 주사기 믹서를 사용하여 LCP의 지질 이중층의 막 단백질을 reconstituting의 간단하고 효율적인 방법을 입증 LCP 매트릭스. 단, 결정화 실험, 광범위한 검사 및 최적화와 마찬가지로 필요하며, 성공적인 결과는 반드시 보증하지 않습니다,이 프로토콜은 meso의 결정화 실험의 접근에 대한 기본적인 가이드를 제공합니다.

프로토콜은 LCP 결정화 시련과 수확 결정을 설정, LCP - FRAP 미리 결정화 assays과 초기 조건을 찾는 lipidic 입방 단계 (LCP)에서 단백질의 reconstitution부터 막 단백질의 회절 품질 결정을 얻기 위해 필수적인 단계를 설명 .

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

막 단백질은 신호 전달, 수송 및 에너지 변환과 관련된 생세포 내의 중요한 기능을 수행하며, 이에 따라 ...

다음 절차의 전반적인 목표는 X선 결정학을 통한 구조 분석을 위해 막 단백질의 고품질 결정을 얻는 것입니다. 이는 단백질을 지질 입방상(lipid cubic phase) 막으로 재구성하고 침전제 용액과 함께 배양함으로써 달성되며, 광범위한 결정화 공간과 결정화 실험의 제한된 피드백으로 인해 결정 핵 생성 및 성장이 유도됩니다. 지질 입방상 광퇴색 후 형광 회복 또는 LCP Frap Prec 결정화 분석법은 가장 유망한 결정화 조건을 선택하기 위해 개발되었습니다.이 분석법은 스크리닝 양을 줄이고 초기 결정화 히트(hit)를 얻을 가능성을 높여줍니다. 초기 히트가 발견되면, 결정 성장을 개선하기 위해 최적화 실험을 수행합니다. 마지막으로, 최적화된 결정을 수확하여 액체 질소에 급속 냉각시킨 후 방사광 가속기에서 데이터 수집을 진행합니다.결과는 LCP 내의 BE two two adrenergic receptor 초기 결정을 얻기 위한 LCP FRA 분석법의 효과적인 활용을 보여주며, 이에 대한 추가 최적화를 통해 회절 품질의 결정을 얻었습니다. 이 기술은 반복 입방상을 통해 제공되는 천연 상태와 유사한 막 환경을 활용하며, 일반적으로 결정화 및 계면활성제 용액과 비교하여 용매 함량이 낮고 정렬 상태가 더 좋은 결정을 생성합니다. 일반적으로 이 방법이 생소한 사용자는 지질 질량 상의 높은 점도와 점착성 특성으로 인해 재료 취급에 어려움을 겪을 수 있습니다.하지만 적절한 도구를 사용하고 기술을 숙달하면, 이 절차는 다른 단백질 결정화 기술보다 더 어렵지 않으며 자동화 및 고처리량 분석에 적합합니다. 그럼 시작하겠습니다. 계면활성제 용액에서 목적하는 막 단백질을 정제하고, 단백질-계면활성제 복합체를 약 10 to 20 mg/mL로 농축하십시오.약 25 mg의 A LCP 호스트 지질 또는 지질 혼합물을 플라스틱 튜브로 옮기고, 지질이 녹을 때까지 40 °C에서 몇 분 동안 배양합니다. 다음으로, 100 µL 가스 밀폐형 시린지에 시린지 커플러를 부착합니다. 가변 부피 피펫을 사용하여 녹은 지질을 시린지에 채웁니다.주사기 내 지질의 부피를 기록하고, 부피비 기준으로 지질 대비 단백질 용액의 비율이 2:3이 되도록 충분한 양의 단백질 용액을 다른 100 µL 주사기에 채웁니다. 주사기 커플러를 통해 두 주사기를 서로 연결합니다. 지질 메조페이즈(meso phase)가 균질해질 때까지 주사기 플런저를 교대로 밀어 지질과 단백질이 커플러의 내부 바늘을 통해 앞뒤로 이동하게 합니다.LCP는 기계적 혼합 시 자발적으로 형성되며, 단백질은 LCP의 지질 이중층 내로 재구성됩니다. LCP의 형성은 투명하고 젤 같은 일관성, 그리고 교차 편광자가 장착된 현미경으로 관찰했을 때 복굴절이 나타나지 않는 점, 또는 가능하다면 소각 X선 회절(small angle x-ray diffraction)을 통해 확인할 수 있습니다. LCP FRAP 분석을 시작하려면 서면 프로토콜에 설명된 대로 단백질과 염료의 비율을 약 100:1로 하여 단백질을 형광 염료로 표지하십시오.반응하지 않은 염료를 제거하고 단백질을 약 1 mg/mL로 농축합니다. 다음으로, 표지되지 않은 단백질과 동일한 방식으로 LCP 내에서 표지된 단백질을 재구성합니다. 분석 플레이트를 준비합니다.LCP wrap 스크리닝 솔루션을 사용합니다. 먼저 단백질이 함유된 LCP를 반복 분주기가 장착된 10 µL 가스 밀폐형 시린지로 옮긴 다음, 10 µL 시린지에 짧은 탈착식 바늘을 장착합니다. 인접한 4개 웰의 표면에 LCP를 200 nL씩 분주하여 2x2 정사각형 모양을 만들고, 각 LCP 볼루스 위에 해당 LCP FRA 스크리닝 솔루션을 1 µL씩 덮어줍니다.스크리닝 용액을 분주한 후, 용액이 채워진 4개의 웰을 18mm 정사각형 유리 커버슬립으로 덮습니다. 커버슬립에 가벼운 압력을 가해 웰을 밀봉합니다. 플레이트 전체가 채워질 때까지 다음 4개의 웰 세트에 대해 이 과정을 반복합니다.채우기가 완료되면 플레이트를 호일로 덮습니다. 플레이트를 20 °C에서 최소 12시간 동안 배양합니다. 평형 상태에 도달하기 위해 플레이트 하나를 LCP Frap 스테이션에 놓고 10배 대물렌즈를 사용하여 첫 번째 웰의 초점을 맞춥니다.FRAP 데이터 획득은 사용자가 모든 획득 파라미터를 먼저 입력한 후 시작 버튼을 누르는 image pro 스크립트를 사용하여 자동으로 수행됩니다. 일반적인 획득 시퀀스는 5장의 표백 전 이미지를 기록하는 것으로 시작하며, 그 다음 표백 레이저를 트리거함과 동시에 가능한 가장 빠른 속도로 약 200장의 이미지를 빠르게 회복 시퀀스로 스트리밍합니다. 이어서 단백질 확산 속도에 따라 이미지 간 간격을 1초에서 20초 사이로 설정하여 50장의 이미지를 느린 회복 시퀀스로 촬영합니다. 데이터 수집이 완료되면, 모든 프레임에서 표백 지점 내부의 강도와 레이저 표백 영역 외부에 배치된 참조 지점의 강도를 적분하여 보정합니다.데이터 획득 중 빛의 변동 및 퇴색으로 인해 발생하는 편차에 대한 적분 강도 곡선에서, 보정된 강도를 정규화하여 퇴색 전 강도는 1, 초기 퇴색 강도는 0이 되도록 합니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 시간 대비 정규화된 강도 곡선을 피팅하여 이동 분율(mobile fraction)과 확산 계수(diffusion coefficient)를 구합니다. 이 절차를 다음 시료에 대해서도 반복하며, 서로 다른 스크리닝 조건에서 얻은 이동 분율과 확산 계수를 비교합니다. 단백질 확산을 촉진한 성분을 기반으로 하고 단백질 확산이 관찰되지 않은 조건은 제외하여 새로운 결정화 스크린을 설계함으로써 LCP 결정화 시험을 설정합니다.이전과 같이 LCP에서 단백질을 재구성한 다음, LCP frap 때와 마찬가지로 결정화 플레이트를 준비하되 결정화 스크리닝 용액을 사용합니다. 또는 결정화 플레이트가 준비되면 로봇을 이용하여 결정화 실험을 설정할 수 있으며, 이를 일정 온도에서 배양하면서 주기적으로 결정의 형성 및 성장을 확인합니다. 단백질 결정이 성장하면, 결정이 담긴 플레이트를 선형 회전 편광판과 분석기가 장착된 가변 줌 스테레오 현미경 아래에 둡니다.저배율 줌을 사용하여 관심 있는 웰(well) 전체가 시야에 들어오도록 맞춥니다. 세라믹 모세관 절단석의 날카로운 모서리를 사용하여 웰 경계 내부에 사각형이 되도록 커버 슬립 유리를 네 번 긁어 표시합니다. 날카로운 끝의 핀셋으로 표시된 외곽선을 따라 눌러 긁힌 부분이 커버 전체 두께까지 전달되도록 합니다.슬립 글라스의 표시된 정사각형 양 끝 모서리에 작은 구멍 두 개를 뚫습니다. 이후 단계에서 탈수 현상을 줄이기 위해 구멍 중 하나를 통해 침전제 용액을 몇 µL 주입합니다. 각진 날카로운 니들 프로브를 사용하여 한두 면의 유리를 깨뜨려 잘라낸 정사각형 조각을 분리합니다.입방상 볼루스(cubic phase bolus)를 확인하며 유리 사각형을 조심스럽게 들어 올립니다. 필요한 경우, 웰(well)에 노출된 입방상 볼루스 위에 동결 보호제가 첨가된 침전제 용액을 수 마이크로리터 추가합니다. 현미경의 배율을 높여 결정에 초점을 맞춥니다. 하베스팅 루프(harvesting loop)를 볼 수 있을 정도의 충분한 빛을 유지하면서, 편광판과 분석기 사이의 각도를 조절하여 frt 결정과 배경 사이의 대비를 높입니다.그런 다음 과잉 지질을 제거하고, 결정 크기에 맞게 선택한 mighty gen micro mount로 LCP에서 결정을 직접 떠서 수확합니다. 수확한 결정이 담긴 micro mount를 액체 질소로 급속 냉동시킨 후, X-선 데이터 수집을 위해 방사광 가속기 빔라인으로 운송합니다. 엔지니어링된 beta two adrenergic receptor를 S SI three NHS ester로 표지하고, 96-well 플레이트의 각 샘플을 순차적으로 표백한 후 30분 동안 배양하여 형광 회복을 측정하는 자동 고처리량 모드의 LCP Frep prec 결정화 분석에 사용하였습니다. 각 샘플의 가동 분율(mobile fraction)을 나타내는 획득된 형광 회복 값을 96개 샘플 전체에 대해 도표로 나타내었습니다.스크리닝 용액은 0.1 molar tris pH 8, 30% volume by volume PEG 400을 함유하며, 두 가지 서로 다른 농도의 48가지 서로 다른 염과 결합되어 있습니다. 몇 가지 대표적인 조건에 대한 형광 회복 프로파일이 제시되어 있습니다. 실선 곡선은 정규화된 강도 대 시간의 피팅을 나타내며, sodium chloride가 포함된 시료에서 10% 미만의 빠른 회복이 나타나는 것은 형광 표지된 지질로 인한 것입니다.단백질과 함께 공정제하여, sodium sulfate와 sodium formate를 포함하고 LCP Frap을 통해 확인된 가장 유망한 조건 주변에서 조밀한 그리드 스크리닝을 수행함으로써 olol과 복합체를 이룬 beta two adrenergic receptor의 초기 결정 히트를 얻었습니다. 침전제 조건의 추가 최적화를 통해 회절 품질의 결정을 얻었습니다. 여기의 결정 이미지들은 sodium sulfate와 potassium formate 존재 하에 성장시킨 것으로, 명시야 모드(brightfield mode)로 촬영되었습니다.동일한 결정은 직교 편광판을 사용하여 관찰할 수도 있습니다. 지질 입방상(lipid cubic phases) 내 단백질 재구성에 숙달되면, 재구성은 10~15분 이내에 완료될 수 있으며, 96웰 결정화 플레이트의 수동 설정은 1시간 이내에 가능합니다. 하이 모드의 L three B wrap 분석은 96웰 플레이트당 약 2시간이 소요되며, H 결정은 웰당 약 10~20분이 소요됩니다. 이 비디오에서 보여주는 절차는 단백질 결정화 실험에 접근하기 위한 기본적인 가이드를 제공합니다.하지만 다른 결정화 실험과 마찬가지로 광범위한 스크리닝과 최적화 과정이 필요하며, 성공적인 결과가 반드시 보장되는 것은 아닙니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

본는 lipidic mesophases 수동으로 막 단백질의 결정화 실험을 설정 캐퍼리 막 구조 및 기능 생물학 그룹의 구현 절차를 설명합니다.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

주문한 막 단백질 배열의 형성을위한 2 차원 (2D) 결정화 실험을 평가하는 것은 전자 crystallography에 매우 중요하고 어려운 작업입니다. 90kDa - 여기에 대한 심사와 15의 범위에서 주로 작은 막 단백질의 2D 결정을 식별하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.

전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

Bicelles은 지질 이중층 내에서 막 단백질 (MPS)를 유지하지만, 결정화 로봇에 의해 높은 처리량 검사를 용이하게 독특한 위상 동작을 가지고 지질 / amphiphile 혼합물입니다. 이 기술이 성공적으로 prokaryotic과 진핵 소스 모두에서 고해상도 구조의 수를 생산하고 있습니다. 이 비디오는 매체에서 crystallizations 재판 (수동뿐만 robotically) 및 수확 결정을 설정, bicelle 혼합물로 의원을 포함, lipidic bicelle 혼합물을 생성하기위한 프로토콜을 설명합니다.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

여기가 macromolecular X-선 결정학을 사용하여 구조 결정에 사용 lipidic mesophases의 막 단백질의 높은 처리량 결정에 로봇 접근 방식을 설명합니다. 방법 통합 점성과 끈적 끈적한 단백질을이고 mesophase을 처리 할 수​​있는 로봇을 소개합니다.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

여기가 macromolecular X-선 결정학을 사용하여 구조 결정에 사용하기 위해 lipidic 입방와 스폰지 단계에서 재배 수확 및 cryo-시원한 막 단백질 결정에 대한 구조 및 기능 생물학 그룹 팀장 막에서 구현 절차를 설명합니다.

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

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β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

X선 자유전자 레이저 및 싱크로트론 소스에서 연속 결정학을 위한 지질 입방상의 막 단백질 미세결정의 준비 및 전달 절차를 설명합니다. 이러한 프로토콜은 또한 용해성 단백질 미세결정의 통합 및 전달에 적용할 수 있으며, 이로 인해 액체 주입에 비해 샘플 소비를 크게 줄일 수 있습니다.

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전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

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우리는 하나의 세포에서 형광을 사용하여 conformational 변화의 특정 사이트 분석과 함께 막 단백질의 이온 전달의 속도론을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 이온 채널 전송기 및 이온 펌프에 적응하고 단백질 subunits 사이의 거리 제한을 결정하기 위해 이용하실 수 있습니다.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

배우세요 지질 입방상(LCP)을 이용한 막 단백질 결정화 방법을 통해 고품질 결정을 얻는 기술입니다. LCP-FRAP 선별법과 최적화 과정을 통해 X선 회절 분석용 결정을 효율적으로 제조할 수 있습니다.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

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