Name: Axonal 개발 제어하기 위해 뉴런의 기계 조작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 학습하세요 뉴런의 기계적 조작을 통해 축삭을 연장하고 미세다인 범위의 힘을 정밀 측정하는 방법을. 교정된 유리 바늘을 사용하여 축삭 발달의 생물물리학적 특성을 연구할 수 있습니다.

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우리는 기꺼이이 방법론의 개발에 박사 로버트 E. Buxbaum의 중요한 기여를 인정합니다.

<ol><li>Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+growth+cone+adhesion+to+culture+surfaces+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation.</a> J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).</li>
<li>Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+neurite+outgrowth+from+chick+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons.</a> J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeidemann%2C+SR+%22The+Neuron+in+Tissue+Culture%22">The Neuron in Tissue Culture</a>. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).</li>
<li>Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+is+required+for+growth+cone+function+but+not+neurite+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac is required for growth cone function but not neurite assembly.</a> J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+mechanical+behaviors+of+the+cytoskeleton+in+living+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts.</a> J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).</li>
<li>Yoneda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Exerted+by+a+Single+Cilium+of+Mytilus-Edulis+.1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1.</a> Journal of Experimental Biology. 37, (1960).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Tension+Produced+by+Nerve-Cells+in+Tissue-Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture.</a> Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Fass, J. N., Odde, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+force-dependent+neurite+elicitation+via+anti-beta1+integrin+antibody-coated+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads.</a> Biophys J. 85, 623-636 (2003).</li>
<li>Yang, S., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Force+Sensors+and+Their+Applications+in+the+Study+of+Cell+Mechanical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mech%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response.</a> Exp Mech. 49, 135-151 (2009).</li>
<li>Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag+Force+as+a+Tool+to+Test+the+Active+Mechanical+Response+of+PC12+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites.</a> Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+growth+cones+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that growth cones pull.</a> Nature. 340, 159-162 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+and+production+of+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior and production of traction force.</a> J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

세포 세력을 적용하고 측정하는 기술은 오랜 역사 9 있습니다. 우리의 방법은 원래 전동 유압 장치 10 사용하여 일정한 속도로 &#39;견인&#39;뉴런으로 우리와 유사한 유리 바늘을 사용 데니스 브레이의 작품 동기했다. 스테퍼 모터 11, 자석 구슬 12, microfabricated 대들보 13, 유체 흐름 14 : 포함 세포 세력을 적용 다양한 대체 수단이 있습니다. 세포 탐침이 궁극적으로 알려진 강성의 굽힘 빔에 대해 보정한다는 점에서 후자는 우리의 접근 방식과 유사하며 세포 측정 광학 현미경 관찰에 따라 달라집니다. 다른 방법에 비해, 우리의 방법 3의 주요 장점은 동시에 생명 과학학과의 전형적인 장비 (현미경 및 micromanipulators)를 사용하여 μdyne 범위에서 세력을 적용하고 평가할 수있는 능력입니다. 이러한 방법...

<table><tbody><tr><td>R-6 모세관</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>R-6 유리 외경 0.9mm, 내경 0.6 mm, 8&quot;</td></tr><tr><td>BB-CH 풀러</td><td>Mecanex S.A., Geneva, Switzerland</td><td>BB-CH puller</td><td>CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 설정의 Mode 4 Alt 사용</td></tr><tr><td>0.001&quot; Chromel 와이어</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>피복 없음, 열전대 와이어, 50ft 스풀(현재 Chromega로 명명됨)</td></tr><tr><td>0.003&quot; Constatan 와이어</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>피복 없음, 열전대 와이어, 50 ft 스풀</td></tr><tr><td>정밀 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox #5</td></tr><tr><td>범용 현미경 붐 스탠드</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 또는 90430</td><td>대부분의 브랜드나 유형의 붐 스탠드 사용 가능</td></tr><tr><td>기계식 마이크로매니퓰레이터</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>3축 직접 구동 조동 마이크로매니퓰레이터</td></tr><tr><td>유압식 마이크로매니퓰레이터</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>현재 MMO-203으로 제공됨, 3축 이동 가능 유형</td></tr><tr><td>니들 홀더</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>3개 세트</td></tr><tr><td>단일 기구 홀더</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>이중 기구 홀더</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>기계식 마이크로매니퓰레이터</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>포스트 마운트, 프로브 홀더 1개, RH 모델 430001</td></tr><tr><td>조이스틱 기계식 마이크로매니퓰레이터</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>도립 현미경</td></tr><tr><td>Vibraplane 제진대</td><td>Kinetic Systems</td><td>1200 시리즈</td><td>사용 모델 1201-02-12</td></tr><tr><td>Ringcubator</td><td>자체 제작 (참고문헌 19 참조)</td><td></td><td>참고문헌 19, 아래 나열된 업데이트된 컨트롤러 필요</td></tr><tr><td>프로그래밍 가능 온도 컨트롤러</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>단종된 PXV3 온도 컨트롤러 대체품</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>도립 현미경, 1980년경 모델</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-10 양안 해부 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>다른 해부 현미경도 사용 가능</td></tr></tbody></table>

axonal 개발 제어하기 위해 뉴런의 기계 조작

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

의 연결을 axons의 세포 조작 및 확장 10-1000 μdyne 범위 1,2의 병력을 측정하고 적용의 마이크로 섬유 가능 보정 유리로 수행할 수 있습니다. 포스 측정은 직접 경험 방법 3 보정하는 유리 바늘의 굽힘 Hookean의 관찰을 통해 얻을 수 있습니다. , fabricating 보정, 처리하고, 세포에있는 바늘을 사용하는 장비의 요구 사항 및 절차를 완전히 설명되어 있습니다. 무력이 기술은 방법의 유연성을 보여주 적용되었습니다 및 향후 조사 4-6위한 예제로 주어진되는 이전에 사용되며 다른 세포 유형을 정권. 기술적인 장점은 조작에 의해 만들어진 세력의 지속적인 &#39;시각&#39;과 직접적으로 세포 다양한 행사에 개입하는 능력입니다. 뿐만 아니라 분리 및 교양 세포 8 어떤 유형에 기계적 측정, 이들은 직접적인 자극과 axonal 성장과 철회 7 규정을 포함합니다.

2에서 1,000 사이 microdyne 범위에서 뉴런에 힘을 응용 프로그램의 직접 측정은 눈금 유리 바늘을 사용하여 높은 정밀도로 달성하고 있습니다. 이 방법론은 axonal 개시, axonal 긴장, axonal 연신율의 속도 및 힘 벡터를 포함 axonal 개발의 여러 측면을 제어하고 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

Axonal 개발 제어하기 위해 뉴런의 기계 조작

교정된 유리 마이크로파이버를 사용하여 세포 조작 및 신경세포 축삭 연장을 수행할 수 있으며, 이 마이크로파이버는 ...에서 힘을 측정하고 가할 수 있는 능력을 갖추고 있습니다.

본 실험의 목적은 힘을 정확하게 측정하면서 축삭을 신장시키는 것입니다. 이는 직접 보정된 와이어 기준 바늘을 제작함으로써 달성되며, 와이어 기준 바늘 보정 후 원하는 힘 범위에 맞춰 보정된 중간 바늘과 작업 바늘을 준비합니다. 다음으로, 축삭을 신장시키기 위해 작업 바늘을 이용하여 성장 원추를 견인합니다.결과적으로 나타나는 축삭 신장을 기록하고, 보정된 바늘의 굴곡을 기반으로 힘을 측정합니다. 이 방법은 축삭 신장의 생물물리학에 관한 핵심적인 질문들에 답할 수 있습니다. 조정 가능한 마이크로니들 풀러와 유리 모세관을 사용하여 끝이 가늘어지는 형태의 길이 약 4 mm 바늘을 제작함으로써 이 절차를 시작하십시오.바늘을 덮개가 있는 160 millimeter 페트리 접시에 보관하십시오. 다음으로, 끝부분이 부러진 유리 바늘 내부에 0.001 inch 크로말 와이어를 삽입하여 와이어 보정 바늘을 만듭니다. 와이어를 끝부분에서 26 millimeters 길이만큼 끌어낸 후 순간접착제로 고정하십시오.와이어의 말단 1mm를 굽혀 갈고리 모양으로 만듭니다. 그런 다음 0.003인치 직경의 일정한 와이어 1m를 사용하여 마이크로 웨이트(micro weights)를 제작합니다. 와이어의 길이를 측정하려면 미터 자에 테이프로 고정하십시오.가능한 한 직선으로 펴지도록 돕습니다. 1m 길이의 와이어의 무게를 잰 후, 정확하게 1cm 길이의 조각들로 자릅니다. 와이어 조각 여러 개를 꽃병 모양으로 구부립니다.와이어 니들을 보정하려면 측정 수직선이 있는 해부 현미경과 마이크로 매니퓰레이터가 필요합니다. 현미경은 옆으로 90도 기울여 설치합니다. 유니버설 붐 스탠드를 사용하여 와이어 니들의 하향 편향을 관찰할 수 있도록 합니다.마이크로 조작기의 툴 홀더에 와이어 니들을 장착하여 현미경의 광축과 수직이 되도록 합니다. 와이어 니들의 갈고리 부분을 방사형 표시선과 일직선이 되도록 맞춥니다. 갈고리에 1cm 마이크로 웨이트를 걸고 편향도를 기록합니다.기준 와이어의 굽힘 상수는 미세 분동의 질량을 관찰된 편차로 나눈 값과 같습니다. 보정을 마친 후, 면도날을 사용하여 웨이포인트의 훅을 잘라내어 중간 유리 바늘을 보정하기 위한 다음 단계의 바늘을 준비합니다. 오큘러 레드le(ocular redle)가 장착된 도립 현미경이 필요합니다.현미경 스테이지의 한쪽에는 와이어 니들을 고정하는 데 사용되는 기계식 마이크로 매니퓰레이터가 있으며, 반대쪽에는 중간 유리 니들을 이동시키는 데 사용되는 유압식 마이크로 매니퓰레이터가 있습니다. 마이크로 매니퓰레이터를 이용해 보정하며, 10배율 시야에서 물이 담긴 160 mm x 30 mm 페트리 접시 내 광학 시야 중심에서 두 니들이 45도 각도로 만나도록 조절합니다. 다음으로, 각 편향에 대해 일련의 편향 과정을 수행합니다.해제 후 유리 바늘의 초기 굴절량과 최종 제로 부하 위치를 기록하십시오. 이를 통해 10쌍의 데이터 포인트가 생성됩니다. 선형 회귀 분석을 위해 10쌍의 데이터를 준비하려면, 기록된 데이터 쌍의 두 번째 값에서 초기 굴절량을 뺍니다.선형 회귀 분석의 기준점을 zero deflection인 0으로 설정하기 위해, force가 0일 때의 제어 쌍(control pairs) 5개를 10개의 실험 데이터 쌍에 추가합니다. 이 15개의 데이터 쌍을 사용하여 선형 회귀 분석을 계산합니다.중간 유리 니들의 용수철 상수는 와이어 니들의 기지 굽힘 상수를 회귀선 기울기로 나눈 값과 같습니다. 그다음, 앞서 설명한 방식대로 작업용 유리 니들을 중간 유리 니들에 대해 교정합니다. 마이크로미터당 2미크론 미만의 유리 니들은 적절한 강성 범위에 맞추기 위해 길이를 약간 줄일 수 있습니다.부착 인자 용액이 담긴 10 milliliter 비커 위에 찰흙 덩어리를 잡고, 바늘 끝부분만 순차적으로 용액에 잠기도록 바늘을 찰흙 옆면에 눌러 고정합니다. 바늘을 0.1% polylysine 용액에 30분 동안 담급니다. 그 후, 부착 인자로 바늘을 처리하면서 conval a 용액에 30분 동안 담급니다.인큐베이터 또는 현미경 스테이지 가열 시스템을 켭니다. 이를 통해 스테이지가 열평형 상태에 도달하게 합니다. 진동 격리대 위에 설치된 견인 워크스테이션은 유압 매니퓰레이터가 장착된 도립 현미경으로 구성되며, 이 매니퓰레이터는 더블 툴 홀더가 삽입되는 균형 잡힌 맞춤형 확장 장치를 고정하고 있습니다.보정되지 않은 기준 바늘을 최대한 길게 돌출되도록 바늘 홀더에 삽입합니다. 이 조립체를 이중 도구 홀더의 오른쪽에 배치합니다. 그런 다음, 처리된 작업 바늘을 기준 바늘 길이의 절반 정도만 돌출되도록 바늘 홀더에 삽입하여 이중 도구 홀더의 왼쪽에 배치합니다.수직 제어 장치가 완전히 위로 올라가도록 유압 마이크로 조작기를 사전 설정하십시오. 그런 다음 좌우 조절 나사를 사용하여 두 바늘 끝을 서로 맞닿게 하십시오. 바늘의 위치를 잡으십시오.따라서 팁들을 측면에서 육안으로 확인하고, 상하 조절 나사를 사용하여 팁들을 동일한 평면상에 맞춥니다. 툴 홀더를 회전시켜 바늘 팁들을 배지 표면 위의 광로에 위치시킵니다. 팁들을 가파르게 내립니다.베이스에 있는 볼 조인트 나사를 조입니다. 10배율 대물렌즈를 사용하여 배양 접시 바닥의 세포 위쪽을 향해 초점을 맞춥니다. 바늘을 배지로 내려 현미경 시야에서 바늘 끝을 찾습니다.배양 접시 내부로 너무 깊게 내리기 전에, 바늘 쪽을 좌우 또는 앞뒤로 움직여 그림자를 찾으십시오. 바늘이 보이면 좌우 조절 나사를 돌려 어떤 바늘이 발견되었는지 확인하십시오.나사와 함께 움직이면 기준 바늘이며, 움직이지 않으면 보정 바늘입니다. 두 바늘의 위치를 모두 확인하면, 이중 툴 홀더의 미세 조정 다이얼을 사용하여 두 바늘을 일직선으로 맞춥니다.목표는 바늘 팁 사이의 간격을 약 50 micrometers로 유지하거나 모니터상에서 약 1인치가 되도록 하는 것입니다. 기준점은 배양 접시보다 더 위에 위치해야 하며, 따라서 초점이 다소 맞지 않는 상태여야 합니다. 견인 바늘이 접시 위에서 초점이 맞으면, 최종적으로 조정된 이 위치의 이미지를 기록하십시오.바늘 사이의 간격을 기준 거리인 0으로 설정합니다. 바늘을 시료 평면 위로 올린 뒤 시야 가장자리에 배치합니다. 서면 프로토콜의 지침에 따라 실험에 사용할 축삭을 선택합니다.바늘을 축삭의 성장 원추 가까이로 이동시키고 영점 거리를 다시 기록합니다. 다음으로, 진동 격리 테이블의 공압을 높여 성장 원추를 바늘 위로 조작합니다. 견인 바늘을 성장 원추 아래쪽 옆에 배치한 다음, 바늘을 배양 접시 바닥으로 내립니다.이렇게 하면 바늘이 위로 굴절되어 디쉬를 따라 구부러지며 성장 원추(growth cone) 쪽으로 미끄러져 들어가고, 이후 성장 원추를 밀어내어 위쪽으로 이동시키게 됩니다. 성장 원추가 바늘 끝에 걸릴 정도로만 바늘을 디쉬 바닥에 누르되, 바늘 위로 미끄러져 뒤로 밀려나지 않도록 주의하십시오. 고정 상태가 안정될 때까지 20분 동안 기다립니다.성장 원추(growth cone)가 바늘 위에 놓이면, 바늘을 오른쪽으로 이동시키고 약간 들어 올려 약간의 장력을 가합니다. 바늘을 들어 올릴 때 바늘이 아래로 움직이는 것을 보완하기 위해 바늘을 약간 앞으로 이동시키며 들어 올립니다. 부착된 돌기가 바늘에서 수직으로 뻗어 나와 배양 접시 표면 위에 위치할 때까지 단계적으로 바늘을 들어 올립니다. 바늘을 세포체에서 멀어지는 방향으로 이동시켜 견인(towing)을 수행합니다.장력을 점진적으로 증가시키면서 바늘 사이의 간격이 벌어지는 것을 통해 힘을 소량씩 관찰합니다. 성장 원추(growth cone)가 바늘에서 분리되는 징후가 있는지 주의 깊게 관찰하십시오. 증발에 대응하기 위해 매시간 물을 추가하여 디쉬 내의 배지 수준을 유지하십시오.디쉬 측면의 표시를 사용하여 초기 깊이를 나타내고, 피펫을 사용하여 디쉬 측면의 바늘과 떨어진 곳에 물을 천천히 첨가하십시오. 실험 종료 전 바늘을 디쉬에서 들어올리기 전에 영점 거리를 다시 확인하십시오. 화면의 수평축을 따라 바늘의 위치를 읽으십시오.또한 세포체의 위치와 바늘의 분리 거리에서 하중이 없는 제로 거리를 뺀 값에 바늘의 굽힘 상수를 곱한 값이 가해지는 힘의 마이크론 단위와 일치하는 시간을 기록하십시오. 표시됨. 여기 축삭 발달 제어를 위해 선택할 수 있는 여러 세포들이 있는 예시 시야가 있습니다. 커다란 성장 원추를 가진 수평 축삭이 좋은 선택입니다.세포체는 화면 가장자리 근처에 배치하고, 니들을 성장 원추(growth cone) 가까이 가져갑니다. 아무것도 부착되지 않은 니들 사이의 간격을 촬영하여 이를 기준 거리(zero distance)로 설정합니다. 실험을 시작하기 전, 견인 니들을 성장 원추에 접촉시켜 자발적인 부착이 이루어지는지 확인합니다.그 다음 바늘을 성장 원추(growth cone) 안으로 조금 더 밀어 넣습니다. 바늘을 디쉬 바닥 방향으로 낮추어 바늘이 굽어지게 함으로써 성장 원추 내부로 미끄러져 들어가 이를 떼어내는 푸시 업(push up) 조작을 수행합니다. 이때 전방으로 약간의 장력을 추가로 가했습니다.15분 후, 축삭은 바늘의 전진 운동에 따라 신장된 것처럼 보입니다. 다음으로, 견인 바늘에 더 많은 장력을 가하고 바늘을 들어 올리기 시작합니다. 바늘 간의 간격이 넓어지는 것을 통해 추가적인 장력이 가해지고 있음을 알 수 있습니다.이 시점에서 축삭이 뚜렷하게 신장되고 있습니다. 기준 바늘은 앞으로 이동하지 않았으나, 축삭이 바늘 방향으로 성장하면서 긴장도가 감소했습니다. 또한, 바늘들을 약간 들어 올린 상태입니다.여기서 견인 바늘에 더 많은 장력을 가합니다. 굴곡된 견인 바늘에 가해진 장력에 반응하여 상당한 성장이 일어났습니다. 실험 마지막 단계에서 최종 제로 점검을 수행합니다.전체 과정이 이 타임랩스 시퀀스에서 시연됩니다. 이 영상을 시청하고 나면 니들을 보정하고, 성장 원추를 니들 위로 조작하며, 축삭을 신장시키는 동안 힘을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

독특한 조직 공학 방법은 축삭 스트레치 성장을 recapitulating하여 문화의 수많은 신경 섬유를 길어지다하기 위해 개발되었다; 신경이 확대 본체의 성장과 함께 길어지다 약자 신경계의 성장의 한 형태.

액슨 스트레치 성장의 연결을 성장의 Mechanotransduction

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

신경 세포의 형태 형성 및 마이그레이션 적절한 두뇌 발달의 기초가 중요 이벤트입니다. 여기서 우리는 유 전적으로 배양 소뇌 과립 뉴런과 형태와 신경 세포의 이동성 특성의 평가를위한 개발 소뇌를 조작하는 방법을 설명합니다.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

레이저 nanodissection 결합 이광자 이미징은, 세포 내 해상도 중추 신경계 퇴행성 및 재생 공정을 연구하는 유용한 도구이다. 이 프로토콜은, 라벨 이미지 및 생체 내에서 소뇌 피질에서 하나의 등반 섬유를 해부하는 방법을 보여줍니다.

소뇌 축삭의 레이저 Nanosurgery<em&gt; 생체</em

생화학적 분석과 결합된 광학 현미경 기술은 네트린 의존성 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외세포작용의 관여를 밝힙니다. 이러한 기술의 조합을 통해 축삭돌기 분지 및 세포 모양 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 식별할 수 있습니다.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

이 프로토콜은 랫트에서 분리된 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런의 분리와 축삭 정렬을 향상시키기 위한 정적 사전 스트레치 세포 배양 시스템에서 DRG 뉴런의 배양을 설명하며, 이후 슈반 세포(SC)의 공동 배양은 수초화를 촉진합니다.

접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 3 차원 크기의 마이크론 크기의 구조물은 관 모양의 하이드로 겔에 둘러싸인 집적 된 신경 세포군에 걸친 길쭉한 정렬 축색관으로 구성됩니다. 이러한 살아있는 비계는 신경 회로를 재구성하거나 조절하기위한 기능적 중계 역할을하거나 회색 - 흰색 물질 신경 조직학을 모방 한 생물 여과 테스트 베드 (bifidelic test-bed) 역할을 할 수 있습니다.

신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

이 절차는 신경 돌기를 유도하는 마이크로 피펫에 고정 된 폴리 -D- 라이신 - 코팅 된 비드를 사용하여 마이크로 유체 챔버에서 조직화 된 신경을 신속하게 개시, 연장 및 연결하는 방법을 설명합니다.

재귀 신경 회로의 연구 : 빠른 신경 돌기 확장과 기능적 신경 연결을위한 새로운 방법

Neurite outgrowth assay는 재생 신경 세포 과정에 대한 정량적 가치를 제공합니다. 이 반자동 소프트웨어의 장점은 마스크를 생성하여 세포체와 신경돌기를 별도로 분할하고 신경돌기 길이, 분지점 수, 세포체 클러스터 면적 및 세포 클러스터 수와 같은 다양한 파라미터를 측정한다는 것입니다.

Neurite Outgrowth 측정을 위한 새로운 반자동 소프트웨어의 표준화 

이 프로토콜은 축삭 손상 후 신경 대사 역학을 모델링하는 미세유체 시스템을 설명하여 내재 대사 리모델링의 이미징, 다중 오믹스 분석 및 기계론적 연구를 가능하게 합니다.

축삭 손상 모델 구성 및 다중 오믹스 분석 가능을 위한 미세유체 칩

학습하세요 뉴런의 기계적 조작을 통해 축삭을 연장하고 미세다인 범위의 힘을 정밀 측정하는 방법을. 교정된 유리 바늘을 사용하여 축삭 발달의 생물물리학적 특성을 연구할 수 있습니다.

Axonal 개발 제어하기 위해 뉴런의 기계 조작

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