Name: C2C12 Myoblast 세포를 사용하여 Bioenergetic 프로필 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-06T16:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 배우세요 C2C12 근육세포를 이용한 생체에너지 프로파일링 실험 방법을. XF 96 분석기로 산소 소비율과 ATP 생성, 프로톤 누출을 측정하여 미토콘드리아 기능을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

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본 실험에서는 C2C12 myoblast 세포는 씨호스 세포 배양 접시에 주어진 밀도에 씨앗을 품고있다. 기초 산소 소비 (OCR)와 세포외 산성화 (ECAR) 요금은 기본 요금을 수립하기 위해 측정합니다. 1. 세포 주입 세포는 metabolically 세포의 bioenergetic 프로필을 이동 다른 화합물의 세 추가 (연속)에 의해 불안정하게된다 는걸 알수 있습니다. 한 그룹은 통제 "화합물"로 추가 미디어를 실행하여, 컨트롤 역할을합니다. <ol><li> 첫 번째 주사 oligomycin입니다. Oligomycin은 F O 부분 ATP synthase의 (단지 V)의 양자 채널을 차단하여 ATP 합성을 억제. mitochondrial 연구, 그것은 주 3 (phosphorylating) 호흡을 방지하는 데 사용됩니다. 전지, 그것은 ATP 합성과 내부 mitochondrial 멤브레인에 걸쳐 자연 프로톤 누설을 극복하는 데 필요한 산소 소비의 비율에 전념 O2 소비량의 비율을 구분하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 두 번째 주사 FCCP입니다. FCCP은 (카르보닐는 청산 가리 - P - trifluoromethoxyphenylhydrazone) 모바일 이온 항공사입니다 ionophore입니다. 그것은 mitochondrial 멤브레인 대신 ATP synthase의 (단지 V)의 양자 채널에 걸쳐 수소 이온을 운반하여 ATP 합성을 방해하기 때문에 uncoupling 요원입니다. mitochondrial 막 잠재력이 붕괴는 ATP의 생성없이 에너지와 산소의 급속한 소비로 연결. 세포는 ATP를 생성하는 작용을 사용하여 자신의 에너지 균형을 유지하려고 시도로서이 경우에는 OCR 및 ECAR 모두 인해 uncoupling으로 OCR 및 ECAR 증가합니다. FCCP 치료는 최대한 억제 OCR 및 초기 기저 OCR 사이의 양적 차이로 정의 세포의 "여분의"호흡 용량을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 심지어 최대한의 생리적 또는 pathophysiological 자극의 조건 하에서 몇​​ 가지 여분의 호흡 능력의 유지는 생명력 및 / 또는 세포의 생존을 정의하는 주요 요인임을 제안되었습니다. 증가 에너지 수요의 조건 스트레스에 대응하는 세포의 능력은 mitochondria의 bioenergetic 용량의 영향을 상당 부분에 있습니다. 이 bioenergetic 용량은 mitochondria 및 전자 수송에 관련된 효소의 기능 용량 기판을 제공하는 세포의 능력 등 여러 가지 요인에 의해 억제 - 채굴입니다 </li><li> 세 번째 주사에 rotenone, 복잡한 I 억제제는 세포에 추가됩니다. 이것은 mitochondrial 호흡을 종료하고 계산하는 호흡에 기여 mitochondrial 및 비 - mitochondrial 분수를 모두 사용합니다. 세포가 더 glycolytic 상태로 교대로 하나는 에너지 균형을 유지하기 위해 ECAR에 수반하는 증가, 장애인 mitochondrial 기능으로 인해 OCR의 감소를 관찰합니다 Rotenone 콤플렉스에서 철 - S 센터 I ubiquinone로 (보조 효소 Q)에서 전자의 전송을 방지 mitochondrial 억제제이다. 단지 이러한 억제 내가 ATP의 형태로 사용할 에너지로 변환되는 NADH의 잠재 에너지를 방지할 수 있습니다. </li></ol> 2. 시약 및 재료 <ol><li> Oligomycin, FCCP 및 Rotenone 솔루션 (씨호스 미토 스트레스 테스트 키트) </li><li> DMEM 러닝 미디어 (씨호스 # 100965-000) </li><li> DMSO (시그마 D8418) </li><li> 소주 워터 (Gibco 15230-170) </li><li> 보정 버퍼 (씨호스 Bioscience) </li></ol> 3. 성장 매체 <ol><li> 500 ML DMEM (Gibco 11965-092) </li><li> 10% FBS (Hyclone SH90070.03) </li><li> 5 ML 펜 / Strep (Gibco 15140-122) </li><li> 5 ML 나트륨 Pyruvate (시그마 S8636) </li><li> 5 ML Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. 프로토콜을 심는 <ol><li> 전지 / 잘 성장 매체의 100 μL 10,000 전지 XF96 셀 문화 접시에 씨앗을 10 %의 CO 2 ° C 배양기 37에 배치됩니다. </li><li> 세포는 1 시간 이내에 XF96 세포 배양 판을 준수합니다. </li><li> 시딩 후 XF96 24 시간 이내에 분석 세포. </li></ol> 5. 검정 템플릿의 준비 <ol><li> 분석 마법사 (부록 I)를 사용하여 다음과 같은 그룹의 레이아웃과 템플릿을 생성합니다 : <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 열 및 그룹 할당을 식별 그림 1. 웰 그리드 레이아웃 </li></ol> 6. 컴파 운드 준비 <ol><li> 다음과 같이 XF DMEM 어세 미디어 다음 화합물 준비 : 10 음 Oligomycin, 30.0 음 FCCP, 20.0 μm의의 Rotenone, 이러한 농도는 화합물이 우물에 주입하는 경우 이루어집니다 10X 희석을 나타냅니다. 작업 농도는 다음과 같습니다 한 음 Oligomycin, 3.0 음 FCCP, 2.0 μm의의 Rotenone </li></ol> 7. 미디어 변화와 셀 준비 <ol> XF 프렙 역에서 셀 플레이트 플레이스 <li> 물론 당 160 μL에 매체의 최종 볼륨을 설정합니다. </li><li> 세포 분석 매체로 사전 평형 수 있도록 60 분 CO 2없이 37 ° C 배양기에서 알을 품다. </li></ol> 8. 센서 카트리지를 로딩 <ol><li> 37 따뜻한 화합물 ° C 이전에 센서 카트리지를로드하고 다음과 같이 연료 분사 장치를 포트에 화합물을 로드할 수 : <ol><li> 열 1-4 : 각각 포트 A, B 및 C로로드 16, 18, 그리고 XF 어세 미디어 (DMEM) 20 μL. </li><li> 열 5-12 : 포트에 Oligomycin 16 μL를 로드할 포트 B에 FCCP 18 μL를 로드할 포트 C에 Rotenone 20 μL를 로드할 </li></ol></li></ol> 9. 프로토콜 명령 <table border="1"><tbody><tr><td> 명령 </td><td> 시간 (분) </td><td> 포트 </td></tr><tr><td> 조정 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 평형을 유지하다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 루프 시작 </td><td> 배 </td><td></td></tr><tr><td> 혼합 </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> 잠깐 만요 </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> 조치 </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> 루프 엔드 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 주사 놓기 </td><td></td><td> </td></tr><tr><td> 루프 시작 </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> 혼합 </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> 잠깐 만요 </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> 조치 </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> 주사 놓기 </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> 루프 시작 </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> 혼합 </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> 잠깐 만요 </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> 조치 </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> 주사 놓기 </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> 루프 시작 </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> 혼합 </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> 잠깐 만요 </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> 조치 </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> 끝 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 프로토콜 명령

<ol><li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li>
<li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li>
<li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li>
<li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li>
<li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells%3A+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li>
<li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li>
<li>Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li>
<li>Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2%2B+transfer+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li>
</ol>

보 젠슨, 조지 W. 로저스, 데이비드 A. Ferrick 당 민 우,이 문서의 특징 시약 및 장비를 생산 Bioscience 씨호스의 직원입니다.

이 분석은 mitochondrial 기능을 탐사하기 위해 고전적인 실험에서 파생된과 세포 신진 대사, mitochondrial 기능, 그리고 전반적인 bioenergetics의 다양한 변화를 이해하기위한보다 복잡한 실험을 구축과 함께 프레임 워크 역할을합니다. 본 실험에 사용된 모든 성분이 최대한의 효과를 제공하는 농도를 위해 최적화해야합니다. 그 하나는 이러한 값을 확인할 별도의 적정 실험을 수행해야합니다. 적정 곡선이 매우 날카로운하는 경향, 그리고 너무 많은 FCCP 실제로 OCR의 반응을 축소 할 수 있듯이, FCCP 특히 중요합니다. 테스트 일반적인 범위 (최종 농도)과 같다 : <ul><li> 0.1-1.0 UG / Oligomycin의 ML </li><li> 0.1-5.0 음 ... FCCP </li><li> 0.1-1.0 음의 Rotenone </li></ul> 위의 각각의 화합물 (특히 FCCP)로 응답 검정 미디어 구성 (기본 유형, [포도당], [pyruvate] BSA의 존재 / 부재 등)에 의해 영향을받을됩니다. XF의 분석 미디어 구성이 변경되면 또한, 최적화를 다시 수행해야합니다. 존재와 pyruvate의 농도가 FCCP로 인해 최대한의 호흡 능력을 얻기에 특히 중요합니다. Bioscience 씨호스는 pyruvate의 누락이 FCCP하기 (기본 이상) maximally 반응 세포의 능력을 abrogates되는 세포 라인의 번호를 관찰했다. 일반적으로 1-10 MM의 pyruvate의 농도는 최대한 호흡을 얻기 위해 pyruvate의 최적 농도를 이해하기 위해 테스트해야합니다. 참고 [pyruvate]과 [포도당] 실험을위한 최적의 매체 조건을 얻기 위해 "교차 titrated"해야 할 수 있습니다. 본 실험의 전형적인 결과는 OCR 대 시간과 다른 표시 ECAR 대 시간을 보여주는 그래프 아래에 제공됩니다 : <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. OCR 대 시간 <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. ECAR 대 시간 세포 각 연속된 화합물로 취급됩니다으로서 여기에 우리는 OCR과 ECAR의 예상 반응을 관찰했다. oligomycin 들어, OCR은 mitochondrial 콤플렉스에서 V. 세포 OXPHOS을 통해 ATP를 합성 수 있으므로, 그들이 ATP에 대한 그들의 수요를 충족하기 위해 작용으로 되돌아 ATP 합성을 차단의 결과로 감소, 따라서 우리는 ECAR의 증가를 관찰. 이전과 같이, FCCP는 uncoupling 대리인 역할을합니다. 세포 이제 내부 mitochondrial 멤브레인 전체 프로톤 누수를 극복해야하므로 더 많은 O2가 mitochondrial 막 너머로 여분의 양자를 펌프에 소비이므로, OCR이 크게 증가합니다. 마지막으로, rotenone은 각각 mitochondrial 복잡한 I 및 복합 III을 억제하는가 전자 수송 체인의 중단에 전자의 흐름의 원인, 따라서 O2의 소비가 크게 줄어 듭니다. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 호흡 매개 변수 호흡과 ECAR의 예상 변화 외에도, 호흡 매개 변수의 숫자는이 데이터로부터 얻을 수 있습니다. 이것은 위의 그림에 요약입니다 : 여기서 우리는 세포의 기저 호흡, ATP의 생산뿐 아니라 양성자 기울기를 (H + 누설로 인한) 유지하는데 최선을 다해 금액에 전념 O2 소비의 비율에 대한 정보를 얻을 수 있습니다 참조하십시오. 또한, 우리는 uncoupled 호흡 (때로는 같은 여분의 호흡 능력 함)의 조건에서 최대한의 호흡 속도를 얻을 수 있습니다 그리고 마지막으로, 우리는 mitochondrial 프로세스에 의한하지 O2 소비의 양을 결정할 수 있습니다. 연구 급속하게 증가하고, 세포 bioenergetics을 평가 mitochondrial 장애를 파악하고 스트레스 및 / 또는 모욕에 대응하는 세포의 능력을 예측하는이 mitochondrial 프로필을 채용하고 있습니다. 이 실험적인 방법과 여분의 호흡 능력의 개념에 대한 자세한 정보와 내용은 다음과 같은 간행물 1-8를 참조 참조하십시오.

<table><tbody><tr><td>Oligomycin, FCCP, Rotenone 및 Antimycin A 용액</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td>Seahorse Mito Stress Test Kit</td></tr><tr><td>DMEM Running Media</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>증류수</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>교정 버퍼</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

c2c12 myoblast 세포를 사용하여 bioenergetic 프로필 실험

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

세포 신진 대사를 측정하고 mitochondrial 장애를 이해하는 능력은, 비만에 mitochondrial 함수의 역할을 이해, 당뇨병, 노화, 암, 심혈관 기능과 안전성 독성의 연구 발전을 위해 전 세계 과학자들을 수있게되었습니다. 세포 대사는 산소, 포도당, 지방산, 그리고 글루타민, 그리고 효소 제어 산화와 환원 반응 일련의를 통해 이후의 에너지 변환과 같은 기판 이해의 과정입니다. ATP 등 락트 산 및 세포외 환경으로 CO 2와 같은 열 및 화학적 부산물의 릴리스의 생산에서 이러한 세포 생화학 반응 결과. 산소 소비 속도 - - 또는 OCR 세포의 생리 상태, 그리고 그 세포의 상태의 변경에 대한 값진 통찰력은, 세포, mitochondrial 호흡의 지표에 의해 소비 산소의 비율을 측정을 통해 얻은 수 있습니다. 락트 산으로 포도당의 전환, 산소의 독립 : 세포도 작용을 통해 IE를 ATP를 생성합니다. 교양 우물에서, 락트 산은 양자의 기본 소스입니다. 또는 ECAR - 매체의 산성화는 엑스트라 셀룰러 산성화 속도를 제공 일으키는 세포를 둘러싼 세포 매체에 발표 양자를 통해 간접적으로 생산 젖산을 측정. 본 실험에서는 C2C12 myoblast 세포는 씨호스 세포 배양 접시에 주어진 밀도에 씨앗을 품고있다. 기초 산소 소비 (OCR)와 세포외 산성화 (ECAR) 요금은 기본 요금을 수립하기 위해 측정합니다. 세포는 다음 metabolically 세포의 bioenergetic 프로필을 이동 다른 화합물의 세 추가 (연속)에 의해 불안정하게된다 는걸 알수 있습니다. 이 분석은 mitochondria 평가하는 고전적인 실험에서 파생된과 mitochondria의 physiologic과 pathophysiologic 두 기능을 이해하기위한보다 복잡한 실험을 구축하고 스트레스 및 / 또는 모욕에 대응하는 세포의 능력을 예측하는있는 프레임 워크 역할을합니다.

세포의 mitochondrial 기능을 프로 파일링하는 방법에 대한 설명이 제공됩니다. 기초 호흡 속도, ATP 링크된 호흡, 양자 누설, 그리고 예비 용량 : 생성된 mitochondrial 프로필 한 실험에서 측정할 수 mitochondrial 함수의 네 가지 매개 변수를 제공합니다.

C2C12 Myoblast 세포를 사용하여 Bioenergetic 프로필 실험

세포 대사를 측정하고 미토콘드리아 기능 장애를 이해하는 능력 덕분에 전 세계 과학자들은 ...에 관한 연구를 진전시킬 수 있었습니다.

다음 실험의 전반적인 목적은 XF 96 extracellular flux analyzer를 사용하여 산화 대사의 여러 파라미터를 측정함으로써 살아있는 세포 및 분리된 미토콘드리아의 기능적 상태를 테스트하는 것입니다. 이러한 파라미터에는 기저 호흡, ATP 전환, 양성자 누출, 그리고 최대 호흡 또는 예비 호흡 능력이 포함됩니다. 이는 C2C12 근아세포에 미토콘드리아 호흡의 특정 조절제를 순차적으로 첨가하고, 호흡의 지표인 산소 소비율(OCR)의 변화와 해당 작용을 통해 ATP를 생성하는 포도당의 젖산 전환을 측정함으로써 수행됩니다.세포 내의 또 다른 주요 에너지 경로는 ECAR 또는 세포 외 산성화율로 측정됩니다. 이를 통해 세포의 수명을 결정하는 데 미토콘드리아 기능이 수행하는 핵심적인 역할에 대한 통찰을 제공하는 미토콘드리아 프로파일링 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 David Nichols입니다.저는 경력 내내 미토콘드리아를 연구해 온 전문가이며, 제 연구에서 사용한 가장 중요한 장비는 산소 전극이었습니다. 분리된 미토콘드리아를 사용하여 다양한 조건에서의 산소 흡수 속도를 측정할 수 있다면, 매우 방대하고 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 하지만 세포, 특히 멀티웰 플레이트나 커버스립에서 배양된 세포로 연구 대상을 옮기면 기존의 고전적인 방법으로는 측정이 불가능합니다.이는 주요한 문제였으나, 수년 전 멀티웰 플레이트 형식으로 여러 세포의 호흡을 병렬적으로 연구할 수 있는 멀티웰 플레이트 분석법이 개발되면서 해결되었습니다. 오늘 여러분이 보실 실험은 매우 간단하지만 많은 정보를 얻을 수 있는 실험으로, 배양 세포의 기본적인 미토콘드리아 생체 에너지 기능을 모니터링하기 위해 저희가 고안한 것입니다. 우선, XF 96 세포 배양 플레이트의 웰당 100 µL의 성장 배지에 10,000개의 세포를 분주한 후, 37 °C, 10% CO2 인큐베이터에 넣으십시오.세포를 시딩하고 24시간 후에 XF 96에서 분석할 수 있습니다. 분석 마법사(Assay Wizard)를 사용하여 다음과 같은 그룹 레이아웃의 템플릿을 생성합니다. 1번부터 12번 열까지 모두 10,000개의 C two C 12 세포를 포함합니다.파란색의 첫 번째 그룹은 대조군 세포로 사용됩니다. 빨간색의 두 번째 그룹에는 oligo Mycin, FCCP 및 roone 약물을 투여합니다. 다음으로, 프로토콜의 서면 설명서에 기재된 대로 X-F-D-M-E-M 분석 배지에서 화합물을 준비하십시오.Oligo Mycin, FCCP, rotenone. 이 화합물들은 XF cell MIT stress test kit에 미리 분주되어 있습니다. XF prep station을 사용하여 성장 배지를 DMEM running medium으로 교체하십시오.마지막으로, 센서 카트리지에 주입할 화합물을 추가하기 전 세포가 분석 배지에 미리 평형을 이룰 수 있도록, 이산화탄소가 없는 37 °C 인큐베이터에서 60분 동안 세포를 배양합니다. 이때 화합물의 온도를 37 °C로 맞춥니다. 그다음, 다음과 같이 주입구에 적재합니다. 1번부터 4번 컬럼의 경우, A, B, C 포트에 XF assay medium 또는 DMEM을 각각 16, 18, 20 µL씩 적재합니다.5번부터 12번 컬럼까지, 포트 A에 16 µL의 oligomycin을, 포트 B에 18 µL의 FCCP를, 그리고 포트 C에 20 µL의 rotenone을 로딩합니다. 다음으로, 프로토콜 명령 설정에서 루프 횟수를 3회로 설정합니다. 혼합 시간을 3분으로, 측정 시간을 3분으로 설정합니다. 마지막으로 시작 버튼을 클릭합니다.보정(calibration)이 완료되면 카트리지를 로드하라는 화면의 안내 지침을 따르십시오. 사용자 프롬프트에 따라 실험용 셀 플레이트를 추가하십시오. 그런 다음 계속하기를 클릭하여 분석(assay)을 실행하십시오.실험이 종료되면 플레이트를 제거합니다. 이 분석법은 미토콘드리아 기능을 프로파일링하는 고전적 실험에서 파생되었으며, 다양한 화합물이 세포 대사, 미토콘드리아 기능 및 전반적인 생체 에너지 활동에 미치는 영향을 이해하기 위한 더 복잡한 실험을 구축하는 프레임워크 역할을 합니다. 여기서는 각 화합물을 순차적으로 처리함에 따라 산소 소비율에서 예상되는 반응을 관찰했습니다.Ligamycin 처리 결과, 미토콘드리아 복합체 V에서 ATP 합성이 차단되어 ATP가 감소하였습니다. 세포는 ligamycin 처리 후 산화적 인산화를 통해 ATP를 합성할 수 없게 되었으며, ATP 수요를 충족시키기 위해 해당 작용으로 전환되었습니다. 이에 따라, 앞서 설명한 바와 같이 해당 작용의 지표인 세포 외 산성화 속도(ECAR)의 증가가 관찰되었습니다. FCCP는 탈커플링제로 작용하여 양성자 재진입의 제한을 제거합니다.호흡이 가속화되며 이제는 전자 전달에 의해 제한됩니다. 마지막으로, rote known이 미토콘드리아 복합체 I을 억제하며, 이로 인해 전자 전달계의 전자 흐름이 중단되고 결과적으로 산소 소비가 급격히 감소합니다. 여기에서 세포의 기초 호흡, ATP 생성에 사용되는 산소 소비 백분율, 그리고 양성자 누출로 인해 양성자 구배를 유지하는 데 사용되는 양에 관한 정보를 얻습니다.또한, 때로는 예비 호흡 용량(spare respiratory capacity)이라고 불리는 비결합 호흡 조건에서 최대 호흡률을 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 미토콘드리아 과정에 의한 것이 아닌 산소 소비량을 결정할 수 있습니다. 지금까지 Seahorse 장비를 통해 확인하셨습니다.XF 96은 세포 내 미토콘드리아의 생체 에너지학(BIE)에 관한 방대한 정보를 제공하는 일련의 실험입니다. 매우 중요한 기본 실험인 실험 1번을 통해 기저 호흡, ATP 회전율, 미토콘드리아 양성자 누출 및 예비 호흡 능력을 확인할 수 있습니다. 이러한 파라미터들은 세포 내 미토콘드리아의 생체 에너지 상태에 대한 근본적인 정보를 제공합니다.

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

myoblast 이식의 성공 여부를 평가하는 비 침습적 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 그의 표현 다른 이미징 modalities를 이미징 할 수 있습니다 유전자로 구성된 통합 된 퓨전 리포터 유전자의 장점을 걸립니다. 여기, 우리는...

이식 근육 전구 세포를 타겟팅 할 수 분자 이미징

해당작용은 여러 생물학적 시스템에서 정의하는 대사 마커입니다. H+의 세포외 플럭스를 측정하여 해당과정을 모니터링하는 것은 일반적이지만, 정량적이고 명확한 보정이 필요합니다. 여기에서는 세포 외 산성화의 호흡기 및 해당작용 원인을 구별하기 위해 세포 외 플럭스 데이터를 수집하고 수정하는 방법을 보여줍니다.

세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

이 프로토콜에서는, 우리는 최적화 된 C2C12 세포의 유지 보수, 유전자 형질 전환 / 전달 및 심근 분화를 포함한 근긴장 성 이영양증 1 근원 세포 모델을 설정하는 절차를 제시한다.

C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링

내피 세포의 미토콘드리아는 혈액 - 뇌 장벽 무결성을 유지하는 것이 중요하다. 우리는 대뇌 혈관 내피 세포에 생체 에너지 기능을 측정 할 수있는 프로토콜을 소개합니다.

대뇌 혈관 내피 세포의 생체 에너지 기능의 평가

신진대사에 대한 연구는 면역학 연구와 점점 더 관련성이 높아지고 있습니다. 여기에서는 마우스 비장 세포와 T 및 B 림프구에서 해당작용 및 미토콘드리아 호흡을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

최적화 된 프로토콜은 림프구에 해당 작용과 미토콘드리아 호흡을 분석하는

이 프로토콜의 목표 spectrophotometrically 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 extracellular 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 고 이러한 세포 외 전자 수락자로 발생할 수 있는 효소의 상호 작용을 분석 하는입니다.

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

우리는 작은 머리핀 (sh) RNA를 사용하여 C2C12 근구 세포재이상체에서 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질을 코딩하는 유전자를 안정적으로 무너뜨리는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 C2C12 근강초 동안 mRNA, 단백질 및 세포 수준에서 의 녹다운 효율의 유효성을 검증하기 위한 방법을 myotube 분화로 표적화한다.

작은 헤어핀 (sh)RNA를 사용하여 C2C12 근강 세포주에서 세포 외 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운

실시간 세포 대사 플럭스 분석은 pH 및 산소 센서를 사용하여 미토콘드리아 및 글리콜 아데노신 삼인산염 생산에 해당하는 산소 소모율 및 세포외 산성화 속도를 측정합니다. 원고는 조골 세포의 에너지 상태와 세포 생물 에너지 상태의 특성화 및 해석을 이해하는 방법을 설명합니다.

실시간 세포 대사 플럭스 분석기를 사용하여 조골세포 생물에너지 모니터링

인간 망막 색소 상피 세포(H-RPE)의 대사 상태는 건강과 기능을 반영합니다. 여기에 제시된 것은 고해상도 호흡 측정을 사용하여 H-RPE의 실시간 대사 플럭스를 검사하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

고분해능 호흡 측정법을 이용한 일차 인간 망막 색소 상피 세포의 생체 에너지 실시간 분석

분리된 말초 혈액 단핵 세포는 면역 기능 및 장애, 대사 질환 또는 미토콘드리아 기능의 분석에 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 전혈에서 PBMC를 준비하고 후속 냉동 보존을 위한 표준화된 방법을 설명합니다. 냉동 보존은 이 시간과 장소를 독립적으로 만듭니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포의 냉동 보존 및 생체 에너지 평가

배우세요 C2C12 근육세포를 이용한 생체에너지 프로파일링 실험 방법을. XF 96 분석기로 산소 소비율과 ATP 생성, 프로톤 누출을 측정하여 미토콘드리아 기능을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

C2C12 Myoblast 세포를 사용하여 Bioenergetic 프로필 실험

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