C2C12 Myoblast 세포를 사용하여 Bioenergetic 프로필 실험

다음 실험의 전반적인 목적은 XF 96 extracellular flux analyzer를 사용하여 산화 대사의 여러 파라미터를 측정함으로써, 살아있는 세포 및 분리된 미토콘드리아의 기능적 상태를 테스트하는 것입니다. 이러한 파라미터에는 기저 호흡, ATP 회전율, 양성자 누출, 그리고 최대 호흡 또는 여유 호흡 능력이 포함됩니다. 이는 C2C12 근아세포 세포에 미토콘드리아 호흡의 특정 조절제를 순차적으로 첨가하고, 호흡의 지표인 산소 소비율(OCR)의 변화와 해당 작용을 통해 ATP를 생성하는 포도당의 젖산 전환을 측정함으로써 달성됩니다.

세포 내의 또 다른 주요 에너지 경로 또한 ECAR 또는 세포외 산성화율로 측정됩니다. 이를 통해 세포의 수명을 결정하는 데 있어 미토콘드리아 기능이 수행하는 핵심적인 역할에 대한 통찰을 제공하는 미토콘드리아 프로파일링 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 David Nichols입니다.

저는 경력 내내 미토콘드리아 연구자로 활동해 왔으며, 제 연구에서 사용한 가장 중요한 장비는 산소 전극이었습니다. 분리된 미토콘드리아를 사용하여 다양한 조건에서 산소 섭취율을 측정할 수 있다면, 매우 방대하고 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 하지만 세포, 특히 멀티웰 플레이트나 커버슬립에서 배양된 세포로 넘어가게 되면 기존의 고전적인 방법들은 작동하지 않습니다.

이는 주요한 문제였으나, 수년 전 멀티웰 플레이트 형식으로 세포의 호흡을 병렬적으로 연구할 수 있게 해주는 멀티웰 플레이트 분석법이 개발되면서 해결되었습니다. 오늘 보시게 될 실험은 배양 세포의 기본적인 미토콘드리아 생체 에너지 기능을 모니터링하기 위해 저희가 고안한 매우 간단하지만 정보가 풍부한 실험입니다. 우선, 100 µL의 성장 배지에 웰당 10,000개의 세포를 분주하여 XF 96 세포 배양 플레이트에 씨딩한 후, 37 °C, 10% CO2 인큐베이터에 넣으십시오.

세포는 시딩 후 24시간 뒤에 XF 96에서 분석할 수 있습니다. Assay Wizard를 사용하여 다음과 같은 그룹 레이아웃의 템플릿을 생성합니다. 1번부터 12번 컬럼까지 모두 10,000개의 C2C12 세포를 포함합니다.

파란색의 1번 그룹은 대조군 세포로 사용됩니다. 빨간색의 2번 그룹에는 oligo Mycin, FCCP 및 roone 약물을 투여합니다. 다음으로, 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로 X-F-D-M-E-M 분석 배지에서 화합물을 준비합니다.

Oligo Mycin, FCCP, rotenone으로 알려진 이 화합물들은 XF cell MIT stress test kit에 미리 분주되어 있습니다. XF prep station을 사용하여 성장 배지를 DMEM running medium으로 교체하십시오.

마지막으로, 센서 카트리지에 주입할 화합물을 첨가하기 전 세포가 분석 배지와 미리 평형을 이룰 수 있도록 이산화탄소가 없는 37 °C 인큐베이터에서 60분 동안 배양합니다. 이때 화합물 또한 37 °C로 맞춥니다. 그 다음, 다음과 같이 주입구에 로딩합니다. 1번부터 4번 컬럼의 경우, A, B, C 포트에 각각 16, 18, 20 µL의 XF 분석 배지 또는 DMEM을 로딩합니다.

5번부터 12번 컬럼까지, 포트 A에는 16 µL의 oligomycin을, 포트 B에는 18 µL의 FCCP를, 포트 C에는 20 µL의 rotenone을 주입하십시오. 그다음, 프로토콜 명령 설정을 반복 횟수 3회, 혼합 3분, 측정 3분으로 정의하십시오. 마지막으로 시작 버튼을 클릭하십시오.

보정이 완료되면 카트리지를 로드하라는 화면상의 안내 지침을 따르십시오. 사용자 프롬프트에 따라 실험용 셀 플레이트를 추가하십시오. 그런 다음 계속 버튼을 클릭하여 분석을 실행하십시오.

실험이 종료되면 플레이트를 제거하십시오. 본 분석법은 미토콘드리아 기능을 프로파일링하는 고전적인 실험에서 유래되었으며, 다양한 화합물이 세포 대사, 미토콘드리아 기능 및 전반적인 생체 에너지 활동에 미치는 영향을 이해하기 위한 더 복잡한 실험을 구축하는 프레임워크 역할을 합니다. 본 실험에서는 각 화합물을 순차적으로 처리함에 따라 산소 소비율에서 예상되는 반응을 관찰하였습니다.

Ligamycin 처리에 의해 미토콘드리아 복합체 5에서 ATP 합성이 차단됨에 따라 ATP 수치가 감소했습니다. Ligamycin 처리 후 세포가 산화적 인산화를 통해 ATP를 합성할 수 없게 되었으므로, ATP 수요를 충족하기 위해 당분해 과정으로 전환되었습니다. 따라서 이전에 보여준 바와 같이 당분해의 지표인 세포외 산성화율(ECAR)의 증가가 관찰되었습니다. FCCP는 언커플링 제제로 작용하여 양성자 재진입의 제한을 제거합니다.

호흡이 가속화되며 이제는 전자 전달에 의해 제한됩니다. 마지막으로 rotenone이 미토콘드리아 복합체 I을 억제하여 전자 전달계의 전자 흐름을 중단시키며, 이에 따라 산소 소비량이 급격히 감소합니다. 여기에서 세포의 기저 호흡, ATP 생성에 사용되는 산소 소비 백분율, 그리고 양성자 누출로 인한 양성자 기울기 유지에 사용되는 양에 대한 정보를 얻습니다.

또한, 때때로 예비 호흡 용량(spare respiratory capacity)이라고 불리는 비커플링 호흡 조건 하에서 최대 호흡률을 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 미토콘드리아 과정에 의한 것이 아닌 산소 소비량을 결정할 수 있습니다. 방금 Seahorse를 통해 이를 확인하셨습니다.

XF 96은 세포 내 미토콘드리아의 생체 에너지학(BIE)에 관한 방대한 정보를 제공하는 일련의 실험입니다. 매우 중요한 기본 실험인 실험 1번은 기초 호흡, ATP 회전율, 미토콘드리아 양성자 누출 및 예비 호흡 능력에 대한 정보를 제공합니다. 이러한 파라미터들은 세포 내 미토콘드리아의 생체 에너지 상태에 대한 근본적인 정보를 제공합니다.