Name: 에어 리퀴드 인터페이스에서 마우스 호흡기 상피 세포 및 실험 담배 연기에 노출의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 배우세요 마우스 기관지 상피 세포 분리 및 에어 리퀴드 인터페이스 배양법을 통한 담배 연기 독성 연구 방법. 이 기법은 면역형광 현미경으로 분화된 단층 세포를 관찰하여 폐 질환 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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우리는 귀중한 전문 기술 지원 및 박사 Shivraj Tyagi에 대한 Emeka Ifedigbo 감사합니다. 우리는 또한 현미경 도움을위한 하버드 NeuroDiscovery 센터를 주셔서 감사합니다. 이 작품은 힐레어 램, 그리고 AMK 최에게 수여 NIH 보조금, R01 - HL60234, R01 - HL55330, R01 - HL079904에 부여 09PRE2250120 Predoctoral 미국 심장 협회가 일부 지원되었다.

전체 프로토콜은 동물의 조직, 세포 증식에​​ 대한 50-10일, 공기 - 액체 인터페이스에서 세포 차별 화를위한 추가 10-14일에서 세포 isolations 2 일 필요합니다. 추가 하루 세포 노출과 샘플 수확이 필요합니다. 1. 마우스 상피 세포 Tracheobronchial (MTEC)의 분리. 참고 : 모든 절차를 아래에서 설명을 검토한 결과, 브리검 앤드 위민스 병원 / 하버드 메디컬 스쿨 지역에있는 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 시작하기 전에 : <ul><li> 항생제가 들어있는 햄의 F12 미디어를 준비합니다. 250 ML 햄의 F12 기저 미디어 (Cellgro)는 100 X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10 2 U/mL-10 2 MG / ML) 솔루션과 1000 X Fungizone 솔루션 250 μL의 2.50 ML를 추가합니다. 최대 4 주 4 ° C에 보관하십시오. </li><li> 0.15 %의 Pronase의 솔루션을 준비합니다. 항생제가 들어있는 햄의 F12 미디어 10 ML 15 MG의 Pronase를 추가합니다. 신선한 확인 및 사용 전까지 얼음 계속. </li><li> 깨끗한 작업 표면 살균 수술 악기 작은 동물 수술에 적합하고, 세포 isolations의 층상 조직 문화 후드를 준비합니다. 다른 모든 장비는 humidified CO 2 incubators, 추운 방, 탁상 세포 원심 분리기, 거꾸로 현미경, 그리고 일회용 플라스틱 피펫 문화 도자기를 포함한 동물 세포 배양을위한 표준으로 간주됩니다. </li><li> 콜라겐을 준비 I 솔루션 (0.02 N 아세트산에 50 μg / ML). 12 잘 트랜 스웰 플레이트 (코닝)의 각 우물에 피펫 1.0 ML의 콜라겐 솔루션입니다. parafilm에 싸서 실온에서 평평한 표면에 밤새 서 보자. </li></ul><ol><li> 상업에 사용할 마우스 변형 (남 6-8주 오래된 즉, C57Bl / 6)를 사용하여, 2 유도 마취법 같은 CO와 같은 안락사의 승인 방법을 사용하여 마우스를 안락사. 일반적으로 6 마우스는 씨앗 12 잘 트랜 스웰 플레이트를 충분한 세포를 (1.5-2.0 X 10 5 셀 / 마우스) 수율 것입니다. </li><li> 필드를 소독 70 % EtOH 솔루션과 동물 시체 스프레이. </li><li> 깨끗한 수술 가위와 메스로 tracheal 주위 피부를 제거하고, 기관을 폭로. 복부를 열고 가슴을 따라 잘라와 갈빗대를 제거합니다. 기관의 끝 부분이 노출 때까지 조직을 제거합니다. </li><li> 얼음에 항생제를 포함하는 30 ML 햄의 F12 미디어를 포함하는 50 ML 원뿔 관에 플레이스 tracheas. </li><li> 멸균 층상 흐름 후드에서 항생제를 포함하는 10 ML 햄의 F12 미디어를 포함하는 멸균 100mm 페트리 접시에 tracheal 조직을 전송합니다. </li><li> 부드럽게 무균 포셉, 외과 가위로 결합 조직을 해부하다. </li><li> 린스에 항생제를 포함한 10 ML 햄의 F12 미디어를 포함하는 새로운 100mm 페트리 접시에 tracheal 조직을 전송합니다. 루멘을 폭로 수직 축을 따라 tracheas 컷. </li><li> 10 ML 0.15 %의 Pronase 솔루션을 포함하는 50 ML 튜브에 tracheas을 전송하고 4 박 품어 ° C. </li><li> 두 번째 날에는 미리 준비하십시오 : <ul><li> DNAse I 솔루션을 준비합니다. 항생제는 -20 1 ML aliquots하고 저장하십시오 10 MG / ML 소 혈청 알부민 (BSA) 재고 솔루션 2 ML, 그리고 원유 췌장 DNAse I. 10 밀리그램을 추가 포함 햄의 F12 미디어 ° C 18 ML하려면 (에 해동 사용하기 전에 얼음). </li><li> 20% 태아 소 혈청 (FBS)과 항생제가 들어있는 햄의 F12 미디어를 준비합니다. 200 ML 햄의 F12 기저 미디어 (Invitrogen)는 50 ML 열 inactivated FBS, 100 X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10 2 U/mL-10 2 MG / ML) 솔루션, 그리고 1000 X Fungizone 솔루션 250 μL의 2.5 ML를 추가 . </li><li> 항생제를 포함하는 MTEC 기본 매체를 준비합니다. 위해 475.5 ML DMEM/F12 기본 미디어 (Cellgro)는 7.5 ML 1 M HEPES 솔루션, 200 MM의 글루타민 솔루션, 7.5 % NaHCO 3 솔루션, 100 X 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션 5 ML 2 ML 10 ML, 500 μL를 추가 1000 X Fungizone 솔루션 </li><li> MTEC medium/10 % FBS를 준비합니다. 항생제를 포함하는 MTEC 기본 매체 45 ML하기 위해, 5 ML 열을 inactivated FBS를 추가합니다. </li></ul></li><li> 부드럽게 튜브 (1.8 단계에서) 10-12 번, 바위 그리고 그것이 4 30~60분에 대한 독립하자 ° C. </li><li> 튜브와 바위 12 회 20 % FBS와 항생제를 포함하는 10 ML 햄의 F12 미디어를 추가합니다. </li><li> 20% FBS와 항생제를 포함하는 10 ML 햄의 F12 미디어를 포함하는 세 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. </li><li> 얼음이 솔루션을 별도로 설정 Pronase 솔루션에서 tracheas를 제거합니다. 햄의 F12를 포함하는 첫번째 원뿔 관에 tracheas을 전송하고 관에게 12 번 반전. 이 과정 두 번 더 반복합니다. </li><li> 한 50 ML 튜브로 단계 1.13에서 세 supernatants와 Pronase 솔루션을 결합합니다. 나머지 조직을 폐기하십시오. </li><li> 10 4 분 ° C, 그리고 뜨는 폐기를 위해, 1400rpm에서 원심 분리기 (A - 4-62 로터가 장착된 Eppendorf 5810R의 원심 분리기 390 XG). </li><li> 부드럽게 한 ML DNAse 솔루션에서 펠렛을 (100-200 μL / 기관) resuspend얼음에 5 분 알을 품다. </li><li> 5 4 분 ° C, 그리고 뜨는 폐기에 대한 1400rpm (390 XG)에서 원심 분리기. </li><li> 10% FBS를 포함하는 8 ML MTEC 매체에있는 세포 펠릿을 Resuspend </li><li> Primaria 판에 플레이트 세포 현탁액 (팔콘). 37 품어 ° 95 %의 공기 분위기에서 C, 5 시간 (주 : 이것은 섬유아 세포에 대한 부정적인 선택 단계)에 대한 5 % CO 2. </li><li> 접시의 세포 현탁액을 모아서 4 ML MTEC 10 % FBS를 포함하는 두 접시와 린스. 풀 세포 현탁액하고 50 ML 원뿔 관에 함께 씻는다. </li><li> cytospin과 셀 카운팅 1 ML을 보존. 5,000 RPM (Eppendorf 5415D)에서 5 분 탁상 원심 분리기의 회전. 나머지 뜨는 500 μL와 re​​suspend 펠렛을 제거합니다. Trypan 블루 중요한 염색법의 방법을 사용하여 셀 카운팅 100 μL를 사용합니다. cytospin 분석 100 μL 4 aliquots을 절약 </li><li> 4, 1400rpm (390 XG)에서 나머지 15 ML의 세포 현탁액을 스핀 ° C, 10 분. </li></ol> 2. 에어 리퀴드 인터페이스에서 전파 및 MTEC의 분화 retinoic 산 주식 솔루션을 준비합니다. 증권 솔루션 A : 95 % EtOH에 5 MM 주식 솔루션을 만들기 위해 어둠 속에서 Retinoic 산성 (미스터 300.44 g / 몰)을 나가는거야. -80에서 호일 포장 튜브에 저장 ° C. 필요에 따라, 50 μL 증권에게, 500 μL BSA 솔루션 (100 MG / ML)와 49.5 ML 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)을 추가하여 재고 솔루션 B를 (5 μm의) 준비합니다. 호일에 저장소가 최대 4 주 동안 -80 ° C에서 튜브를 감쌌다. retinoic 산성을 포함하는 MTEC 확산 매체를 준비합니다. 항생제를 포함하는 45.7 ML MTEC 기저 미디어로, 2.5 ML 열 - inactivated FBS, 1 ML Retinoic 산 주식 B, 250 μL 인슐린 솔루션 (4 MM HCL 2 MG / ML의 인슐린), 250 μL 표피 성장 인자 솔루션 (/ 5 μg을 추가 1 MG / ML BSA가 들어있는 HBS의 ML EGF), 200 μL 소 뇌하수체 추출 (HBS 1 MG / ML BSA를 포함한 15 MG / ML), 50 μL 트랜스페린 솔루션 (HBS 1 MG / ML BSA를 포함한 5 MG / ML 트랜스페린 ), 50 μL 콜레라 독소 솔루션 (HBS 1 MG / ML BSA를 포함한 100 MG / ML). 최종 미디어 준비를 소독 필터와 준비 2 일 이내에 사용합니다. <ol><li> 트랜 스웰 플레이트에서 콜라겐 솔루션을 제거, 5 분 후드 아래에 서서하게하고, PBS로 2 회 씻는다. </li><li> 다음 원심 분리는 물론 당 7.5 X 10 4 -1.0 X10 5 세포의 도금을 촉진하는 확산 미디어 (500 μL)의 적절한 볼륨에있는 세포 펠렛을 resuspend. 트랜 스웰 폴리 카보 네이트 막 삽입의 혀끝의 표면에 피펫 500 μL 세포 현탁액. 트랜 스웰의 기초 구획으로 확산 미디어 1.5 ML를 추가합니다. </li><li> 37 빠져들 MTEC 문화를 품어 ° 95 % 공기가 들어있는 humidified 인큐베이터에서 C, 7-10 일 동안 5 % CO 2. </li><li> 미디어에게 처음을 변경하기 전에 3 일 기다려. 매일 미디어를 변경합니다. 전극 (EVOM Ohmvoltometer, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다)를 사용 transepithelial 세포 저항의 육안 검사 및 측정에 의해 문화를 모니터링합니다. </li><li> 세포가 합류 나타나고 상피 저항 1000 Ω / cm 2에 도달하면, 세포가 ALI에서 차별화하는 준비가되어 있습니다. </li><li> 2 % NuSerum을 포함 MTEC 기저 미디어를 준비합니다. 2퍼센트 V / V.의 최종 농도 MTEC 기본 매체 NuSerum 추가 사용하기 전에 1 X 10 -7 M의 최종 농도 retinoic 산성 주식 B를 추가합니다. 신선한 준비 2 일 이내에 사용합니다. </li><li> 세포 꼭대기의 미디어를 제거하고 2% Nuserum 및 retinoic 산성을 포함하는 750 μL MTEC 기초 매체와 기저 미디어를 대체하여, 10-14 일 동안 차별을 허용합니다. 기초 미디어를 변경하고 MTEC는 매일 2 % NuSerum를 포함하는으로 혀끝의 측면을 씻으십시오. </li></ol> 3. 교양 상피 세포에 담배 연기의 응용 <ol><li> CS 셀 노출 시스템 (EMI 인 스트 루먼트, 피츠버그, PA)를 사용하는 주류 담배 연기에 트랜 스웰 문화의 혀끝의 측면을 폭로. 장치의 사진을 위해 그림 1을 참조하십시오. 기술 사양 특정 시약 및 장비의 표를 참조하십시오. 간단히 기기는 통풍 노출 챔버에 연결된 폴리 프로필렌 라인에 주류 연기 그리기 ~ 7-8 퍼프 각 담배를 피우는 연동 펌프로 구성되어 있습니다. 노출 챔버는 물을 순환하여 ° 37 C를 유지하고, 가스 라인 5 % CO 2 분위기에서 관리하고 있습니다. 세포는 켄터키 3R4F 연구 참조 필터 담배 (담배 연구소, 켄터키 대학, 렉싱턴, KY)를 사용하여 연기에 노출 될 수 있습니다. 일반적으로 세포는 총 미립 물질 (TPM)의 100-200 밀리그램 / m 3을 항복, 1-2 담배 연기에 노출되어 있습니다. 컨트롤 문화가 동등한 노출 기간 동안 실내 공기에 노출되어 있습니다. </li><li> TPM은 TE와 함께 제공된 제조 업체의 프로토콜에 따라 측정됩니다- 10C 흡연 기계 (티그 기업). 간단히, 필터 (Pallflex)은 지속적인 흐름 펌프 (샘플링 단위)로 연기 챔버의 샘플링 포트에서 선도적인 샘플링 튜브에 인라인 스테인레스 스틸 홀더에 배치됩니다. 유출 관은 가스 미터 (건식 가스 미터, ONM61, 67, AEM)로 샘플링 장치를 연결합니다. 필터는 가스 샘플링 전후 무게입니다. 전체 자료 MG의 필터에 예금이 샘플 공기의 총 볼륨의 정상화이다. </li><li> 세포는 다음 어느 시점 (즉, 0-24 시간) 게시물 표준 셀 분석 절차에 대한 노출 (즉, 서양 immunoblot 분석, mRNA 분석, 등) 또는 현미경 (즉, 공촛점 또는 전자 현미경)에서 수확한 수 있습니다. 문화 미디어는 또한 크린 시토킨 또는 세포 독성의 assays에 대한 LDH 릴리스에 대한 분석하실 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 ALI에서 성공 상피 분리, 증식, 그리고 차별화는 조약돌 형태로 그대로 monolayer를 얻을 것입니다. 건강 문화 Transepithelilal 세포 저항은 약 1000년부터 2000년까지 Ω / cm 2되어야합니다. 그림 2는 제어 조건과 담배 연기에 노출된 후 상피 세포와 솜털 표시에 대한 스테인드 마우스 호흡기 상피 세포 monolayer을 묘사. 그림 3은 ultrastructure와 속눈썹의 형태를 묘사, 건강 MTEC 문화의 대표적인 전자 micrographs를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 세 단계, 격리 단계, 전파 단계, 공기 - 액체 인터페이스 (구조)에서 차별화 무대를 통해 상피 세포의 진행의 준비. 상피 세포들은 가라 앉 문화 분아 따위에 의해 번식 transwells에 씨앗을 마우스 기관에서 고립, 그리고 그들이 완전히 차별화하는 공기 - 액체 인터페이스로 변환됩니다. 실험은 일반적으로 지속적인 문화의 24 일 당일에 실시하고 있습니다. 사진은 주류 담배 연기에 교양 세포의 노출을위한 모델 시스템을 묘사. 트랜 스웰 알리 문화 시스템은 온도, 습도 및 CO 2를위한 제어하는 사용자 정의 모듈 담배 연기 전달 시스템 내부에 배치됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 상피 세포 문화는 고정 및 스테인드 핵에 대한 (Hoechst 33258), F - 굴지 (녹색, 알렉사 - 플루어 488 - 복합 Phalloidin)되었습니다. 그리고 속눈썹 마커 acetylated α - tubulin (빨간색, Cy3 - 복합 이차 항체). 하단 패널 4 시간 담배 연기 (2 담배, 150 MG / m 3)에 노출 후 촬영 상피 세포의 동일한 이미지를 보여줍니다. (B) 락트 산 탈수소 효소 (LDH) 출시 24 시간으로 표시 담배 연기의 다양한 복용에 노출된 후 기저 매체 측정되었다. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 마우스 tracheal 상피로부터 분리된 상피 세포의 공기 - 액체 인터페이스 문화는 전송 전자 현미경에 의해 (TEM) 솜털이있는, 기초, 비 솜털이있는 세포 1의 특성을 몇 가지 subtypes의 구별. 이러한 세포는 pseudostratified 호흡 상피를 typify. 그림 레이블에 해당하는 : BB : 기초 신체, : axoneme, M : mitochondria, N : 핵, S : 기판 (폴리 카보 네이트 막), MV : microvili

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

마우스 tracheal 상피 세포의 격리를 나타내는 프로토콜 1. 당신이 외의 프로토콜에서 적응하고, 다른 수정 2-3. 것입니다 어떤 프로토콜 설명 셀 isolations와 마찬가지로 가장 중요한 부분은 엄격한 무균 기술을 사용하여 세균이나 곰팡이 병원균의 오염을 방지하는 것입니다. 두 번째 중요한 단계는 fibroblast의 tracheas주의 절개로 피할 수있는 문화의 오염, 그리고 1.19 단계에서 설명한대로 부정적인 선택을 방지하는 것입니다. 문화가, 모니터링 씻어과 문화 미디어가 초기 72시간 보육 다음 매일 보충함되어있는 문화가 완전히 ALI의 개시로부터 약 2 주 구별해야합니다. 대부분 만성 담배 연기 노출로 인한 만성 폐쇄 폐 질환 (COPD)는, 주요 글로벌 건강 문제가 4-7 대표하고 있습니다. COPD는 진보적인 기류 제한, 파괴 폐포 손실 (폐기종), 그리고 담배...

* 흡연 기계는 맞춤 설계 및 가공 14 &quot;x14&quot;x20 &quot;이중 chambered 물을 외피 가벼운 틴트 확실하게 증명 1 / 2&quot;온도 조절, 수위 센서와 함께 담배 연기 노출을위한 두꺼운 폴리 카보 네이트 Lexan 챔버 시스템을 차단 제어됩니다. 단위 퍼핑 / 금연 담배가 속도를 피고 변수 담배 설치됩니다. 장치가 사용되면, 그것은 온도, 습도 및 이산화탄소가 시스템으로 제어되는 의미에서 보육을 모방한 것이었 지요. 시스템이 포함되어 있습니다 (I) 조직 배양 실험을위한 통제된 환경을 유지 맞춤형 듀얼 챔버 / 물 외피 단위. (II) 디지털 헤비 듀티, 수위 센서 및 온도 제어 펌프를 피고로 (III) 흡연 단위로 고정밀 이중 펌프 물 온도 순환 장치 시스템입니다. 인라인 (IV) 펌프 사이클 센서 제어 속도 자전거 타는 사람 (IV) 스테인레스 스틸 고정밀 필터 홀더. (V) 분리 뚜껑은을 위해 괄호와 함께 2분의 11 &quot;크기의 축 균일의 담배 연기 혼합 팬. (VI) 물의 순환 장치 장착 브래킷과 중간 크기의 물 목욕. (VII) A 1 / 2 &#39;두께 플렉시 글라스 트레이 장착 담배 가루 수집기 낸 펌프 및 홀더. 설명한대로이 기계는 그러한 TSE 시스템 (에서 제공하는 종류와 유사한 상용 - 흡연 가능한 기계로 대체 수 있습니다 <a href="http://www.tse-systems.com">www.tse - systems.com</a> ).

에어 리퀴드 인터페이스에서 마우스 호흡기 상피 세포 및 실험 담배 연기에 노출의 분리

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface  

폐 상피 세포는 호흡 생쥐의 넓이와 차별 호흡기 상피의 모델로 공기 - 액체 인터페이스 (ALI)에서 양식에서 격리 수 있습니다. 프로토콜은 CS에 노출되는 상피 세포의 반응을 연구하기 위해 주류 담배 연기 (CS) 이러한 세포를 분리하고 노출에 대해 설명합니다. 마우스 기관, 공기 - 액체 인터페이스 (ALI)로 완벽하게 차별화된 상피 세포에서 이러한 세포의 culturing, 문화에서 이러한 세포 보정 주류 CS의 배달에서기도 상피 세포의 분리 : 프로토콜은 세 부분으로 구성되어 있습니다. 알리 문화 시스템은보다 밀접하게 일반 액체 문화 시스템보다 생리 설정을 닮은 그 조건 하에서 호흡기 상피 조직의 문화 수 있습니다. CS 노출하는 분자 및 폐 세포 반응의 연구는 인간의 건강에 대한 환경 대기 오염의 영향을 이해의 중요한 구성 요소입니다. 이 분야에서 연구 결과는 궁극적으로 만성 폐쇄 폐 질환 (COPD), 주요 글로벌 건강 문제를 나타내는 다른 담배 관련 질병의 병인을 이해하는 방향으로 기여할 수 있습니다.

폐 상피 세포는 생쥐의 호흡기로부터 격리하고 차별 호흡기 상피의 모델로 공기 - 액체 인터페이스에서 교양 수 있습니다. 프로토콜이 환경 독소에 분자 반응을 연구하기 위해, culturing를 분리하고 주류 담배 연기 이러한 세포를 노출에 대해 설명합니다.

폐 상피 세포는 마우스의 호흡기에서 분리하여 기-액 계면(air-liquid interface, ALI)에서 배양함으로써 분화된 ... 모델로 사용할 수 있습니다.

본 실험 절차의 전체적인 목적은 담배 연기 노출의 독성 영향을 연구하기 위해 기도 상피 세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 마우스의 기관을 절제한 후, pronase 용액으로 기관을 소화시켜 수행합니다. 절차의 두 번째 단계는 상피 세포를 수집하고 액체 배양을 증식시키는 것입니다.세 번째 단계는 공기-액체 계면(air liquid interface)에서 배양물을 분화시키는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 공기-액체 계면에서 상피 세포를 상단부의 담배 연기에 노출시키는 것입니다. 최종적으로 면역형광 현미경을 통해 완전히 분화된 상피 세포 단층을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 담배 연기 노출이 CLIA 형태에 미치는 영향과 담배 연기로 인해 유도된 세포 손상의 생화학적 마커와 같이 만성 폐쇄성 폐질환 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 박리 하루 전부터 hams를 준비하여 이 절차를 위한 준비를 시작하십시오. 항생제가 포함된 F 12 배지, 항생제와 20% F-B-S-M-T-E-C가 포함된 hams F 12 배지, 항생제가 포함된 기본 배지입니다.작성된 프로토콜의 지침에 따라 5% FBS가 포함된 MTEC 배지, DNA's one solution, 레티노산(retinoic acid) 스톡 용액 및 MTEC 증식 배지를 준비하십시오. 해부 당일에 해부에 사용할 모든 수술 도구를 멸균하십시오. 해부 구역이 청결한지 확인하고 모든 해부 도구가 손이 닿는 곳에 있는지 확인하십시오.조직 배양 후드를 멸균하십시오. 그 다음 조직 배양 후드 내에서 작업을 수행하십시오. 0.15% pronase 용액을 준비하십시오.50 mL 원심분리관(conical tube)에 항생제가 포함된 hams. F 12 배지 10 mL와 pronase 15 mg을 첨가합니다. 사용 전까지 얼음 위에 보관하십시오.표준 수술 절차를 사용하여 마우스에서 기관을 적출합니다. 기관이 들어 있는 튜브를 소독한 후 조직 배양 후드로 옮깁니다. 기관 조직을 항생제가 포함된 hams F 12 배지가 담긴 100 millimeter 페트리 접시로 옮깁니다. 멸균된 수술용 핀셋을 사용하여 기관에서 결합 조직을 제거합니다.그런 다음 세척된 기관을 항생제가 포함된 hams. F 12 배지가 들어 있는 두 번째 100 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 해부 가위를 사용하여 기관을 수직축을 따라 절개하고 내강을 노출시킵니다.기관을 10 mL의 Pronase 용액이 담긴 50 mL 원추형 튜브로 옮기고, 냉장고에 넣어 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 마지막으로, 사용을 위해 collagen one 처리된 transwell 플레이트를 준비합니다. 다음 날, 0.02 N acetic acid 1 mL당 50 mg의 collagen one을 첨가하고, 이 용액 1 mL를 12-well 플레이트의 각 웰에 피펫으로 분주합니다.웰 플레이트를 세척합니다. 플레이트를 파라필름으로 감싸 조직 배양 후드 내 실온에서 하룻밤 동안 방치합니다. 다음 날,마우스 기관이 들어 있는 튜브를 10~12회 부드럽게 반전 섞기 합니다. 그런 다음 튜브의 내용물을 4°C에서 30~60분 동안 추가로 배양합니다. 조직 배양 후드 내에서 항생제와 20% FBS가 포함된 hams F 12 배지 10mL를 소화된 기관 조직이 들어 있는 원심 분리 튜브에 피펫으로 넣고 12회 반전 섞기 합니다.그 다음, 항생제가 포함된 20% FBS 함유 hams F 12 배지 10 milliliters를 세 개의 15 milliliter 원추형 튜브에 각각 피펫으로 분주합니다. 멸균된 파스퇴르 피펫을 사용하여 pronase 용액에 있던 기관 조직을 보충된 hams F 12 배지가 들어 있는 첫 번째 튜브로 옮깁니다.Pronase 용액을 얼음에 두고, 기관 조직이 담긴 튜브의 캡을 닫은 후 12회 부드럽게 반전시켜 혼합합니다. 그 다음 파스퇴르 피펫을 사용하여 기관 조직을 두 번째 15 milliliter 원추형 튜브로 옮기고, 이 튜브를 12회 반전시킵니다. 마지막 15 milliliter 원추형 튜브를 사용하여 옮기기와 반전 과정을 반복합니다.마지막으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 기관 조직을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 얼음에서 pronase 용액을 꺼내고, 보충된 hams F 12 배지 15 milliliter 분량 3개를 pronase 용액과 혼합합니다. 냉장 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 1,400 rotations per minute로 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 폐기한 다음, 기관당 약 100 to 200 microliters의 DNA's, one 용액을 펠렛 위에 피펫으로 분주하고 재현탁합니다.가볍게 두드려 현탁합니다. 세포를 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 4°C에서 1,400 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.그런 다음 10% FBS가 포함된 MTEC 배지 8 mL를 펠릿 위에 피펫으로 분주하고 플레이트를 재현탁합니다. 파리아 플레이트(paria plate)에 담긴 세포 현탁액을 37°C, 95% 공기 및 5% 이산화탄소 분위기에서 5~6시간 동안 배양합니다. 이는 섬유아세포를 제거하기 위한 음성 선택 단계입니다.배양 후, 파라 플레이트(paria plate)에서 세포 현탁액을 수집하여 50 milliliter 원심분리관에 옮깁니다. 그 다음, 10% FBS가 포함된 MTEC 배지 4 milliliters로 플레이트를 두 번 헹굽니다. 세척액을 모두 세포 현탁액이 들어 있는 50 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다.세포 현탁액 1 mL를 에펜도르프 튜브에 피펫으로 분주합니다. 이 분주액은 사이토스핀 분석 및 세포 수 측정 원심분리를 위해 보관합니다. 나머지 15 mL의 세포 현탁액이 들어 있는 50 mL 원추형 튜브를 4 °C에서 1,400 rpm으로 10분 동안 원심분리합니다.원심분리하는 동안, 이전에 준비한 트랜스웰 플레이트에서 콜라겐 용액을 제거하여 폐기하십시오. 후드 내에서 플레이트를 5분 동안 건조시킨 후, 마지막 세척 단계에서 PBS로 두 번 세척하십시오. 모든 PBS를 흡입하여 제거하고, 원심분리가 끝난 후 트랜스웰의 하단 챔버에 증식 배지 1.5 milliliters를 피펫으로 분주하십시오.상청액을 제거하고 세포 펠릿을 적절한 부피의 증식 배지에 재부유하여, 웰당 500 µL의 현탁액에 7.5 × 10⁴ ~ 1 × 10⁵개의 세포가 분주될 수 있도록 합니다. 세포 현탁액 500 µL를 Transwell 폴리카보네이트 멤브레인 인서트의 상단 표면에 피펫으로 분주합니다. 침전된 MTEC 배양물을 95% 공기와 5% CO₂가 포함된 37 °C의 가습 배양기에서 7~10일 동안 배양하며, 배지는 이틀마다 교체합니다.인터벌로미터를 사용하여 상피세포 경내 저항을 측정하십시오. 상피 저항이 1000 ohms per centimeter squared에 도달하고 배양 세포가 합쳐진(confluent) 것으로 보일 때, 상단 배지를 제거하여 LI 배양으로 전환하십시오.또한 기초 배지를 2% 신선한 혈청과 레티노이산(retinoic acid)이 포함된 MTEC 기본 배지로 교체합니다. 배양물을 37 °C, 5% CO2 조건에서 10~14일 동안 배양하며, 이틀마다 배지를 교체하여 분화를 유도합니다. 먼저, 제조사의 지침에 따라 흡연 장치를 설치합니다.사용하지 않은 pole flex 필터의 무게를 기록합니다. 그 다음, 흡연 챔버의 샘플링 포트에서 일정 유량 펌프로 연결되는 샘플링 튜브의 인라인 스테인리스 스틸 홀더에 필터를 장착합니다. CS cell 노출 시스템을 사용하여 유출 튜브로 샘플링 유닛을 가스 미터에 연결합니다.Transwell 배양물의 정단면(apical side)을 3R4F 연구용 표준 필터 담배의 주류 연기에 노출시킵니다. 세포를 담배 1~2개 분량의 연기에 노출시킵니다. 대조군 배양물은 가스 샘플링 무게 측정 후 동일한 노출 시간 동안 실내 공기에 노출시킵니다.풀 플렉스 필터(pool flex filter)의 경우, 필터에 침착된 총 물질의 양을 밀리그램(mg) 단위로 정규화합니다. 샘플링된 총 공기 부피에 대해, 일반적으로 담배 1~2개비의 연기에서 100~200 mg/m³의 총 입자상 물질(TPM)이 생성됩니다. 담배 연기 노출 후, 추가 분석을 위해 세포와 기저 배지를 수집합니다.이것은 핵 상피 세포 및 C 마커로 염색된 건강한 마우스 호흡기 상피 세포 단층의 예시입니다. 성공적인 상피 분리, 증식 및 분화는 조약돌 모양(cobblestone morphology)의 온전한 단층을 통해 이루어집니다. 배양물에는 섬유아세포가 거의 포함되어 있지 않습니다.이 전자현미경 이미지들은 건강한 MTEC 배양의 대표적인 모습으로, 다양한 세포 유형의 미세 구조와 CELIA 형태를 보여줍니다. 이 살아있는 세포 이미징 영상은 MTEC 배양의 건강한 C 형태를 보여줍니다. 이 영상을 시청하고 나면 마우스 기관지 상피 세포를 분리하고, 기액 계면(air liquid interface)에서 분화시키며, 주류 담배 연기에 노출시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

이 프로토콜의 목표는 COPD의 쥐 모델에서 만성 폐 병리학을 정량화하는 자동화된 방법을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜에는 생쥐를 담배 연기(CS)에 노출시키고, 폐 기능을 측정하고, 폐를 팽창시키고, 형태 측정 방법을 사용하여 생쥐의 폐기종 및 소기도 재형성을 측정하는 것이 포함됩니다.

담배 연기에 노출 된 마우스의 폐 폐기종 및 작은기도 리모델링 자동 측정

이 프로토콜의 목적은 인체 유기형 3D 기관지 및 코 조직 모델을 공기-액체 계면에서 주류 담배 연기(CS)에 노출시키는 것입니다. 그런 다음 시토크롬 P450 활성 분석, 섬모 박동 측정 및 시스템 생물학 접근 방식을 사용하여 CS가 조직에 미치는 영향을 조사합니다.

전체 담배 연기에의 Organotypic 3D 기관지와 코 조직 문화 모델의 반복 노출의 영향 평가

여기에 설명된 담배 연기 추출물이 폐 상피 세포의 세균 성 식민지화에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 프로토콜이 있습니다.

폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 감염에 담배 연기의 효력 공부

이 프로토콜은 사내에서 지어진 전신 흡입(WBI) 노출 시스템(WBI)을 통해 담배 연기(CS)의 병리학적 효과에 대한 연구를 보여줍니다. 이 시스템은 폐 기종및 혈청증에 대한 CS 중재 효과의 연구를 위한 통제된 반복조건하에서 CS에 동물을 노출할 수 있습니다.

전신 흡입 시스템을 사용하여 쥐의 담배 연기 노출

이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

여기에서는 만성 담배 연기 추출물(CSE)에 대한 적응에 초점을 맞춘 쥐 기도 상피 세포를 분리하고 분화하기 위한 시험관 내 모델을 설명합니다. 이 모델은 CSE의 다중 오믹스 영향을 종합적으로 특성화하는 데 활용될 수 있으며, 이는 만성 연기 노출 시 세포 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

담배 연기 추출물로 자극된 쥐 기도 상피 세포에서 다중-오믹스의 분화 및 변화를 연구하기 위한 시험관 내 모델

이 프로토콜은 인플루엔자 감염 후 안정적인 상태에서 마우스 폐에서 살아있는 면역 및 비면역 집단을 격리하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 상피 및 골수성 세포 부분 집합을 식별하기 위한 게이팅 전략을 제공합니다.

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung(쥐 폐에서 살아있는 골수성 및 상피 세포 집단의 분리)

이 프로토콜은 신생아, 유아, 성인 쥐 폐(감염 여부 모두)에서 생존 가능한 폐포 유형 II 상피세포(AECII)를 분리하는 유동 세포분석 기반 방법을 제시합니다. 이 접근법은 AECII의 분자 및/또는 기능 연구를 통해 폐 염증 및 감염 시 AECII의 역할을 규명할 수 있게 합니다.

감염성 실험 환경에 적응하는 신생아, 유아, 성체 쥐 폐에서 폐포 유형 II 상피세포 분리

배우세요 마우스 기관지 상피 세포 분리 및 에어 리퀴드 인터페이스 배양법을 통한 담배 연기 독성 연구 방법. 이 기법은 면역형광 현미경으로 분화된 단층 세포를 관찰하여 폐 질환 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

에어 리퀴드 인터페이스에서 마우스 호흡기 상피 세포 및 실험 담배 연기에 노출의 분리

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