에어 리퀴드 인터페이스에서 마우스 호흡기 상피 세포 및 실험 담배 연기에 노출의 분리

본 실험 절차의 전체적인 목적은 담배 연기 노출의 독성 영향을 연구하기 위해 기도 상피 세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 마우스의 기관을 절제한 후, pronase 용액으로 기관을 소화시켜 수행합니다. 절차의 두 번째 단계는 상피 세포를 수집하고 액체 배양을 증식시키는 것입니다.

세 번째 단계는 공기-액체 계면(air liquid interface)에서 배양물을 분화시키는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 공기-액체 계면에서 상피 세포를 상단부의 담배 연기에 노출시키는 것입니다. 최종적으로 면역형광 현미경을 통해 완전히 분화된 상피 세포 단층을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 담배 연기 노출이 CLIA 형태에 미치는 영향과 담배 연기로 인해 유도된 세포 손상의 생화학적 마커와 같이 만성 폐쇄성 폐질환 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 박리 하루 전부터 hams를 준비하여 이 절차를 위한 준비를 시작하십시오. 항생제가 포함된 F 12 배지, 항생제와 20% F-B-S-M-T-E-C가 포함된 hams F 12 배지, 항생제가 포함된 기본 배지입니다.

작성된 프로토콜의 지침에 따라 5% FBS가 포함된 MTEC 배지, DNA's one solution, 레티노산(retinoic acid) 스톡 용액 및 MTEC 증식 배지를 준비하십시오. 해부 당일에 해부에 사용할 모든 수술 도구를 멸균하십시오. 해부 구역이 청결한지 확인하고 모든 해부 도구가 손이 닿는 곳에 있는지 확인하십시오.

조직 배양 후드를 멸균하십시오. 그 다음 조직 배양 후드 내에서 작업을 수행하십시오. 0.15% pronase 용액을 준비하십시오.

50 mL 원심분리관(conical tube)에 항생제가 포함된 hams. F 12 배지 10 mL와 pronase 15 mg을 첨가합니다. 사용 전까지 얼음 위에 보관하십시오.

표준 수술 절차를 사용하여 마우스에서 기관을 적출합니다. 기관이 들어 있는 튜브를 소독한 후 조직 배양 후드로 옮깁니다. 기관 조직을 항생제가 포함된 hams F 12 배지가 담긴 100 millimeter 페트리 접시로 옮깁니다. 멸균된 수술용 핀셋을 사용하여 기관에서 결합 조직을 제거합니다.

그런 다음 세척된 기관을 항생제가 포함된 hams. F 12 배지가 들어 있는 두 번째 100 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 해부 가위를 사용하여 기관을 수직축을 따라 절개하고 내강을 노출시킵니다.

기관을 10 mL의 Pronase 용액이 담긴 50 mL 원추형 튜브로 옮기고, 냉장고에 넣어 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 마지막으로, 사용을 위해 collagen one 처리된 transwell 플레이트를 준비합니다. 다음 날, 0.02 N acetic acid 1 mL당 50 mg의 collagen one을 첨가하고, 이 용액 1 mL를 12-well 플레이트의 각 웰에 피펫으로 분주합니다.

웰 플레이트를 세척합니다. 플레이트를 파라필름으로 감싸 조직 배양 후드 내 실온에서 하룻밤 동안 방치합니다. 다음 날,

마우스 기관이 들어 있는 튜브를 10~12회 부드럽게 반전 섞기 합니다. 그런 다음 튜브의 내용물을 4°C에서 30~60분 동안 추가로 배양합니다. 조직 배양 후드 내에서 항생제와 20% FBS가 포함된 hams F 12 배지 10mL를 소화된 기관 조직이 들어 있는 원심 분리 튜브에 피펫으로 넣고 12회 반전 섞기 합니다.

그 다음, 항생제가 포함된 20% FBS 함유 hams F 12 배지 10 milliliters를 세 개의 15 milliliter 원추형 튜브에 각각 피펫으로 분주합니다. 멸균된 파스퇴르 피펫을 사용하여 pronase 용액에 있던 기관 조직을 보충된 hams F 12 배지가 들어 있는 첫 번째 튜브로 옮깁니다.

Pronase 용액을 얼음에 두고, 기관 조직이 담긴 튜브의 캡을 닫은 후 12회 부드럽게 반전시켜 혼합합니다. 그 다음 파스퇴르 피펫을 사용하여 기관 조직을 두 번째 15 milliliter 원추형 튜브로 옮기고, 이 튜브를 12회 반전시킵니다. 마지막 15 milliliter 원추형 튜브를 사용하여 옮기기와 반전 과정을 반복합니다.

마지막으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 기관 조직을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 얼음에서 pronase 용액을 꺼내고, 보충된 hams F 12 배지 15 milliliter 분량 3개를 pronase 용액과 혼합합니다. 냉장 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 1,400 rotations per minute로 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 폐기한 다음, 기관당 약 100 to 200 microliters의 DNA's, one 용액을 펠렛 위에 피펫으로 분주하고 재현탁합니다.

가볍게 두드려 현탁합니다. 세포를 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 4°C에서 1,400 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.

그런 다음 10% FBS가 포함된 MTEC 배지 8 mL를 펠릿 위에 피펫으로 분주하고 플레이트를 재현탁합니다. 파리아 플레이트(paria plate)에 담긴 세포 현탁액을 37°C, 95% 공기 및 5% 이산화탄소 분위기에서 5~6시간 동안 배양합니다. 이는 섬유아세포를 제거하기 위한 음성 선택 단계입니다.

배양 후, 파라 플레이트(paria plate)에서 세포 현탁액을 수집하여 50 milliliter 원심분리관에 옮깁니다. 그 다음, 10% FBS가 포함된 MTEC 배지 4 milliliters로 플레이트를 두 번 헹굽니다. 세척액을 모두 세포 현탁액이 들어 있는 50 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다.

세포 현탁액 1 mL를 에펜도르프 튜브에 피펫으로 분주합니다. 이 분주액은 사이토스핀 분석 및 세포 수 측정 원심분리를 위해 보관합니다. 나머지 15 mL의 세포 현탁액이 들어 있는 50 mL 원추형 튜브를 4 °C에서 1,400 rpm으로 10분 동안 원심분리합니다.

원심분리하는 동안, 이전에 준비한 트랜스웰 플레이트에서 콜라겐 용액을 제거하여 폐기하십시오. 후드 내에서 플레이트를 5분 동안 건조시킨 후, 마지막 세척 단계에서 PBS로 두 번 세척하십시오. 모든 PBS를 흡입하여 제거하고, 원심분리가 끝난 후 트랜스웰의 하단 챔버에 증식 배지 1.5 milliliters를 피펫으로 분주하십시오.

상청액을 제거하고 세포 펠릿을 적절한 부피의 증식 배지에 재부유하여, 웰당 500 µL의 현탁액에 7.5 × 10⁴ ~ 1 × 10⁵개의 세포가 분주될 수 있도록 합니다. 세포 현탁액 500 µL를 Transwell 폴리카보네이트 멤브레인 인서트의 상단 표면에 피펫으로 분주합니다. 침전된 MTEC 배양물을 95% 공기와 5% CO₂가 포함된 37 °C의 가습 배양기에서 7~10일 동안 배양하며, 배지는 이틀마다 교체합니다.

인터벌로미터를 사용하여 상피세포 경내 저항을 측정하십시오. 상피 저항이 1000 ohms per centimeter squared에 도달하고 배양 세포가 합쳐진(confluent) 것으로 보일 때, 상단 배지를 제거하여 LI 배양으로 전환하십시오.

또한 기초 배지를 2% 신선한 혈청과 레티노이산(retinoic acid)이 포함된 MTEC 기본 배지로 교체합니다. 배양물을 37 °C, 5% CO2 조건에서 10~14일 동안 배양하며, 이틀마다 배지를 교체하여 분화를 유도합니다. 먼저, 제조사의 지침에 따라 흡연 장치를 설치합니다.

사용하지 않은 pole flex 필터의 무게를 기록합니다. 그 다음, 흡연 챔버의 샘플링 포트에서 일정 유량 펌프로 연결되는 샘플링 튜브의 인라인 스테인리스 스틸 홀더에 필터를 장착합니다. CS cell 노출 시스템을 사용하여 유출 튜브로 샘플링 유닛을 가스 미터에 연결합니다.

Transwell 배양물의 정단면(apical side)을 3R4F 연구용 표준 필터 담배의 주류 연기에 노출시킵니다. 세포를 담배 1~2개 분량의 연기에 노출시킵니다. 대조군 배양물은 가스 샘플링 무게 측정 후 동일한 노출 시간 동안 실내 공기에 노출시킵니다.

풀 플렉스 필터(pool flex filter)의 경우, 필터에 침착된 총 물질의 양을 밀리그램(mg) 단위로 정규화합니다. 샘플링된 총 공기 부피에 대해, 일반적으로 담배 1~2개비의 연기에서 100~200 mg/m³의 총 입자상 물질(TPM)이 생성됩니다. 담배 연기 노출 후, 추가 분석을 위해 세포와 기저 배지를 수집합니다.

이것은 핵 상피 세포 및 C 마커로 염색된 건강한 마우스 호흡기 상피 세포 단층의 예시입니다. 성공적인 상피 분리, 증식 및 분화는 조약돌 모양(cobblestone morphology)의 온전한 단층을 통해 이루어집니다. 배양물에는 섬유아세포가 거의 포함되어 있지 않습니다.

이 전자현미경 이미지들은 건강한 MTEC 배양의 대표적인 모습으로, 다양한 세포 유형의 미세 구조와 CELIA 형태를 보여줍니다. 이 살아있는 세포 이미징 영상은 MTEC 배양의 건강한 C 형태를 보여줍니다. 이 영상을 시청하고 나면 마우스 기관지 상피 세포를 분리하고, 기액 계면(air liquid interface)에서 분화시키며, 주류 담배 연기에 노출시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.