바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

이 절차는 팬 바이러스 마이크로어레이 분석법인 Viro 칩을 사용하여 알려진 바이러스와 알려지지 않은 바이러스 모두에 대한 임상 샘플을 분석합니다. 먼저 임상 샘플에서 핵산을 추출합니다. 다음으로, 추출된 RNA를 무작위 프라이머를 사용하여 역전사합니다.

두 번째 가닥 CD NA 합성을 수행하고 CD NA 라이브러리를 무작위 PCR로 증폭합니다. 그런 다음 증폭된 cd NA를 형광 염료로 표지하고 바이러스 칩 마이크로어레이로 혼성화합니다. 마지막 단계는 마이크로어레이를 스캔하고 분석하는 것입니다.

궁극적으로, 칩 마이크로어레이의 분석을 통해 바이러스 또는 여러 바이러스의 존재 또는 부재를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 폐렴과 같은 일반적인 임상 증후군은 개별 병원체에 특이적이지 않고 SARS 코로나 바이러스 및 2009 년 새로운 H one N one 인플루엔자 바이러스와 같은 새로운 바이러스 병원체의 지속적인 부상 위협으로 인해 바이러스 chipp 마이크로 어레이와 같은 광범위한 검출 방법이 진단 미생물학에 필요합니다.이 방법은 진단 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 임상 환경에서 진단되지 않은 감염의 비율이 아직 확인되지 않은 새로운 바이러스에 의해 발생할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 수백에서 수천 개의 잠재적 병원체를 동시에 테스트하고 있기 때문에 병원에서 급성 임상 질환을 더 잘 진단하는 방향으로 확장됩니다.

이 방법에 대한 아이디어는 2002년 UCSF의 Joseph DeRisi 박사 실험실에서 개척한 새로 개발된 마이크로어레이 기술을 바이러스 검출에 적용하기로 결정했을 때 처음 떠올랐습니다. 우리의 첫 번째 실제 테스트 사례는 2003년 사스(SARS)를 유발하는 신종 코로나바이러스를 확인하기 위해 바이러스 칩을 사용하는 것이었으며, 제 실험실의 기술자가 급성 호흡기 질환의 원인을 진단하기 위해 어린이의 비강 면봉 샘플에 바이러스 칩 분석을 사용하는 방법을 처음부터 끝까지 시연할 것입니다. 비인두 면봉 샘플은 바이러스 수송체, 액체 배지가 들어 있는 멸균 용기에 수집되어 섭씨 영하 80도의 냉동고에 냉동 보관됩니다.

생물 안전 후드에서 샘플이 들어있는 튜브를 해동시키고 면봉을 생물학적 위험 허리 쓰레기통에 버리기 전에 배지에서 면봉을 잠시 저어줍니다. 그런 다음 200마이크로리터의 샘플을 1.5ml 튜브에 분취합니다. 샘플을 0.22 미크론 스핀 필터에 통과시켜 바이러스 입자를 정제하고 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다.

다음으로, 제조업체의 지침에 따라 Ambien의 Turbo DNA 키트를 사용하여 숙주 게놈 DNA를 분해하고 보호된 캡슐화된 바이러스 핵산을 정제합니다. 제조업체의 지침에 따라 XMO ZR 바이러스 RNA 추출 키트 또는 Qiagen 초음파의 바이러스 키트를 사용하여 RNA 추출을 수행합니다. NanoDrop 핵산 분광 광도계를 사용하여 추출된 RNA의 농도를 측정합니다.

RNA 농도는 마이크로리터당 최소 10나노그램인 것이 바람직하지만, 얇은 벽 200마이크로리터 튜브를 사용하여 샘플마다 다를 수 있습니다. 추출된 RNA 4마이크로리터에 마이크로리터당 40 PICA 몰 농도의 프라이머 A 1마이크로리터를 첨가합니다. thermocycler에 있는 5분 동안 65°C에 표본을 가열하고, 그 후에 관을 5분 동안 실내 온도에 식히십시오.

다음으로, 2 마이크로 리터 5 배 RT 버퍼, 1 마이크로 리터 12.5 밀리 몰, DNTP 1 마이크로 리터 물 0.5 마이크로 리터, 0.1 몰 DTT 및 0.5 마이크로 리터 위 첨자 3, 열 사이클러에 역 전사 효소를 포함하는 마스터 믹스 5 마이크로 리터를 추가합니다. 튜브를 섭씨 42도에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 94도에서 2분 동안 가열합니다.

역전사효소 반응을 중단하려면 섭씨 10도에서 2분 동안 호출하고 펄스 원심분리기를 5초 동안 호출합니다. 다음으로, 1 마이크로 리터 5 배 퀴즈 완충액, 3.8 마이크로 리터 물 및 0.15 마이크로 리터의 두 번째 가닥 합성으로 구성된 5 마이크로 리터의 퀴즈 믹스를 첨가한다. 8분에 걸쳐 열순환기를 섭씨 10도에서 섭씨 37도로 올립니다.

섭씨 37도에서 8분 동안 유지합니다. 그런 다음 섭씨 94도까지 2분 동안 가열하여 퀘이즈를 비활성화하고 이 시점에서 섭씨 10도를 호출합니다. 원하는 경우 15마이크로리터 CDNA가 포함된 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

먼저, 5 마이크로 리터의 PCR 10 배 완충액, 1 마이크로 리터 12.5 밀리 몰, DNTP 1 마이크로 리터 1 마이크로 리터 100 pomo 마이크로 리터 프라이머, B 1 마이크로 리터 cleantech LA 및 37 마이크로 리터의 물로 구성된 마스터 믹스의 45 마이크로 리터에 5 마이크로 리터의 CD NA 샘플을 추가합니다. 그런 다음 2분 동안 섭씨 94도에서 PCR 프로토콜을 실행한 다음 30초 동안 섭씨 94도씩 25사이클을 실행합니다. 섭씨 50도에서 45초, 섭씨 72도에서 1분

그런 다음 5분 동안 섭씨 72도의 무릎을 꿇고 앉은 다음 PCR 후 섭씨 10도에서 유지합니다. PCR 산물과 1.5%AOSE 전기영동 겔을 확인합니다. 약 200 - 1000개의 염기쌍의 도말이 시각화되어야 합니다.

AAD DNTP를 통합하려면 5마이크로리터의 10배 PCR 완충액, 1마이크로리터 12.5밀리몰, A-A-D-N-T-P 1마이크로리터 100p의 멀티 마이크로리터 프라이머, B 1마이크로리터 ClinTech LA 및 37마이크로리터 물로 구성된 마스터 믹스 45마이크로리터에 5마이크로리터의 바이러스 PCR 제품을 추가합니다. PCR 프로토콜을 2분 동안 섭씨 94도, 30초 동안 섭씨 94도의 15사이클과 같이 실행합니다. 섭씨 50도에서 45초 동안 유지합니다.

섭씨 72도에서 1분간 무릎을 꿇고 5분간 72°C에서 10°C를 유지합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 DNA 세척 및 농축기 3 키트로 새 PCR 제품을 세척하고 10 마이크로 리터의 용리 완충액을 주입합니다. PCR 산물 10 마이크로 리터에 중탄산 몰 1 마이크로 리터와 1 마이크로 리터 si 3 1 마이크로 리터를 추가하고 어둠 속에서 1 시간 동안 배양합니다.

다음으로, 다시 DNA clean 및 concentrator five kit로 S 표지 샘플을 세척하고 12마이크로리터의 용리 완충액에서 용출합니다. 1.5마이크로리터의 샘플을 사용하여 PCR 스트립 튜브의 NanoDrop 분광 광도계에 통합된 염료의 양을 1마이크로리터, 25배 단편화 버퍼, 5마이크로리터, 5배 차단 버퍼, 9.5마이크로리터 또는 정규화된 최종 농도인 10 피크 또는 SI 3 표지된 샘플과 물의 마이크로리터당 몰에서 총 부피 25마이크로리터까지 확인합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 2배 GX 혼성화 버퍼를 추가하고 잠시 스핀다운하여 기포를 제거합니다.

하이브리드화 챔버에 새 개스킷 슬라이드를 놓습니다. 40마이크로리터의 샘플을 개스킷 슬라이드에 로드합니다. 다음으로, 애질런트가 인쇄한 바이러스 어레이를 Agilent라고 표시된 면이 아래로 향하게 하여 개스킷 슬라이드 위에 놓고 나사를 단단히 조입니다.

혼성화 챔버를 섭씨 65도의 오븐에 놓고 어레이를 세척하기 위해 분당 10회전의 느린 회전을 사용하여 밤새 혼성화합니다. 먼저 가열하는 동안 버퍼를 섭씨 2도까지 2°C로 예열합니다. 500ml 플라스틱 용기에 약 250ml의 버퍼를 채웁니다. 1.

혼성화 챔버에서 어레이를 제거하고 어레이를 침수시킨 다음 개스킷 슬라이드에서 분리합니다. 어레이를 깨끗한 용기로 옮기고 버퍼 1에서 1분 동안 세척합니다. 그런 다음 별도의 500ml 플라스틱 용기를 사용합니다.

예열된 버퍼 2에서 어레이를 1분 동안 세척합니다. 세척 후 버퍼에서 어레이를 천천히 제거합니다. 둘째, 거품을 피하도록 주의하십시오.

김 물티슈를 사용하여 여분의 수분을 흡수하고 어레이의 활성 면을 직접 만지지 않도록 주의하십시오. 마지막으로, 슬라이드를 애질런트 쪽이 위로 향하게 하여 슬라이드 홀더에 놓고 어레이 스캐너에 삽입합니다. 이 절차에서는 애질런트 2미크론 DNA 마이크로어레이 스캐너를 사용합니다.

기기 표준 스캐닝 프로토콜에 따라 5미크론 또는 2미크론에서 SI 3 레이블 어레이를 스캔합니다. 클러스터 분석 또는 자동화된 RO chipp 분석 프로그램 e unpredic으로 바이러스 chipp 마이크로어레이를 분석합니다. Viro Chipp 마이크로어레이 2009년 새로운 인플루엔자를 사용하여 인플루엔자와 유사한 질병을 앓고 있는 어린이로부터 얻은 비강 면봉 샘플에서 하나의 바이러스를 쉽게 검출할 수 있습니다.

또한 바이러스 칩이 호흡기 바이러스뿐만 아니라 다양한 조직과 체액에서 광범위한 바이러스를 식별할 수 있음을 보여주었습니다. 여기에 보여지는 바와 같이 vichi를 사용하여 전혈 및 혈청에서 바이러스 검출의 몇 가지 예. 이는 각 샘플에 대해 4명의 환자로부터 채취한 전혈 또는 혈청의 혈액 샘플에서 바이로 칩 마이크로레이에 해당하는 호출이며, 상위 2개의 바이러스 예측은 가장 낮은 P 값을 갖는 상위 바이러스 예측과 함께 표시됩니다.

예를 들어, 연한 파란색으로 강조 표시된 샘플에서 해당 샘플에 대한 상위 예측은 뎅기열 바이러스 1형입니다. 두 번째로 순위가 매겨진 예측은 뎅기열 바이러스 2형이지만, 해당 전혈 샘플의 실제 바이러스는 뎅기열 바이러스 1형으로 확인되어 dict 결과와 일치했습니다. 바이로 칩의 또 다른 응용 분야는 새로운 병원체 발견입니다.

몇 가지 예로는 SARS 코로나 바이러스 X-M-R-V-A, 인간의 전립선 암 및 만성 피로 증후군과 관련된 OME 레트로 바이러스, 어린이의 호흡기 및 설사 감염과 관련된 새로운 인간 심장 바이러스 HTCV의 발견이 있습니다. 이 기술은 제대로 수행되면 12시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 절차에 따라 필요한 모든 장비 및 시약의 가용성을 보장하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

특이적 바이러스 PCR 증폭 및 심층 염기서열분석(deep sequencing)과 같은 다른 방법을 수행하여 비정상적인 바이러스 칩 혼성화 패턴 또는 개발 후 새로운 바이러스의 존재를 시사하는 바이러스 칩 결과를 확인하고 후속 조치를 취할 수 있습니다. 이 기술은 종양학 분야의 연구자들이 신속한 병원체 진단을 위한 응축된 마이크로 기반 분석을 개발하기 위해 생물 방어 및 임상 미생물학 분야에서 새로운 바이러스와 암의 연관성을 탐구하고, 바이러스학 분야에서 새로운 바이러스의 특성 분석 및 질병과의 연관성을 규명할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 핵산 추출부터 임상 샘플에서 마이크로레이 혼성화 및 분석에 이르기까지 임상 샘플에서 바이러스 병원체를 검출하기 위한 광범위한 감시 테스트인 바이러스 칩 마이크로레이 분석의 모든 단계를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

임상 샘플로 작업하는 것은 생물학적 유해성으로 간주되며 핵산 추출은 생물 안전성 레벨 2 이상으로 평가된 실험실에서 수행해야 한다는 점을 잊지 마십시오.