Name: 바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: 배우세요 Virochip 마이크로어레이 분석법으로 임상 샘플에서 알려진 바이러스와 새로운 바이러스를 동시에 검출하는 방법을 익히세요. 이 기술은 진단 미생물학에서 감염 원인 규명에 필수적입니다.

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우리는 Virochip 프로토콜의 초기 개발 및 최적화에 대한 데이비드 왕, 아나톨리 Urisman, 에이미 키슬러, 카엘 피셔, 패트릭 당나라, 그리고 알렉산더 Greninger 감사드립니다. 이 작품은 NIH K08 부여와 애보트 디스커버리 수상 (CC)을하고 하워드 휴스 의학 연구소 (JLD)를 지원합니다.

Virochip 분석의 단계는 임상 샘플에서 (1) 핵산 추출, 추출 RNA (2) 반대로 전사 및 2 차 - 가닥 cDNA 합성, 무작위로 준비하는 cDNA (3) PCR 증폭, (3) Cy3 형광 염료의 정관을 포함 , Virochip microarray로 표시된 자료 (4) 하이브 리다이 제이션, 그리고 (5) 검사 및 분석 (그림 1). 아래의 프로토콜은 독감과 같은 질병을 가진 아이에서 비강 면봉 샘플에 Virochip 분석의 사용을 보여줍니다. 프리머 시퀀스 프라이머 5' - GTTTCCCAGTCACGATA - (N 9) -3 ' 프라이머 B 5' - GTTTCCCAGTCACGATA - 3 ' 1. 핵산 추출 <ol><li> 이 샘플은 잠재적으로 전염성이 있으므로 임상 시료에서 핵산 추출은 Biosafety 레벨 2 (BSL - 2) 이상의 조건​​ 하에서 수행되어야합니다. </li><li> 비강 면봉 샘플 바이러스성 지주 매체 수송이다. 1.5 ML Eppendorf의 microcentrifuge 관에 샘플 나누어지는 200 μL. </li><li> 옵션 : 0.22 μm의 필터 (바이러스성 입자 정화)을 통과 샘플 </li><li> 선택 사항 : 제조 업체의 지침에 따라 터보 DNAse 키트 (앰비온)를 사용 DNAse (호스트 게놈 DNA를 저하하고 보호 encapsidated 바이러스 핵산에 대한 정화)와 pretreat 샘플 </li><li> Zymo ZR 바이러스성 RNA 추출 키트 또는 제조 업체의 지침에 따라 Qiagen Ultrasens 바이러스 키트를 사용하여 샘​​플을 추출합니다. </li></ol> 2. 역방향 전사 및 2 차 - 스트랜드 CDNA 합성 ( "라운드") <ol><li> RNA를 추출 4 UL 1 UL 40 μL / pmol 프리머을 추가합니다. 65 열 ° C thermocycler (예 : GeneAmp PCR 시스템 9700) 후 5 분 방 온도 X 5 분 식지. </li><li> 2 μL 배 RT 버퍼, 1 μL 12.5 MM dNTP 1 μL 물, 0.5 μL 0.1M DTT, 0.5 μL 및 SSIII RT (Invitrogen)로 구성된 마스터 믹스 5 μL를 추가합니다. 42 품어 ° C X 60분. </li><li> 프로그램 thermocycler에서 94에 열을 ° 10로 냉각 C X 2 분 (중지 리버스 transcriptase 반응), ° C, 펄스 원심 분리기, 다음 1 μL 배 Sequenase 버퍼, 3.8 μL 물로 구성된 5 μL Sequenase 믹스를 추가 그리고 0.15 μL Sequenase (USB 공사). 2 차 스트랜드 합성 들어, 10 ° 37 C ° C 8 분 이상, 94에 다음 8 분, 열을 보유 ° C X 2 분 (Sequenase를 inactivate)을 10 ° C (보유)에 냉각. 최대 램프 </li><li> 옵션 : 앳는 cDNA 샘플은 -20 ° C.에이 시점에서 저장할 수 있습니다 </li></ol> 3. 의 PCR 증폭이 임의로 준비하는 CDNA ( "라운드 B") <ol><li> 5 μL 10X PCR 버퍼, 1 μL 12.5 MM dNTP 1 μL 100 pmol / μL 뇌관의 B, 1 μL KlenTaq LA (시그마), 37 μL 물로 구성된 마스터 믹스 45 μL에 드르 5 UL 샘플을 추가합니다. </li><li> 다음과 같이 PCR 프로토콜을 실행 94 ° C, 2 분 → (94의 25주기 ° C, 30 S / 50 ° C, 45 S / 72 ° C, 1 분) → 72 ° C, 5 분 → 10 ° C ( 개최) </li><li> 1.5 % 아가로 오스 전기 영동 젤에 드르 B 샘플을 확인하십시오. 약 200의 얼룩 - 1000 BP는 시각되어야합니다 (그림 2A) </li></ol> 4. Cy3 형광 염료의 설립 <ol><li> 옵션 : 다른 샘플이 Cy5 형광 염색으로 표시하고 동일한 microarray에 hybridized 수 있습니다. </li><li> AA - dNTP를 통합하기 위해, 5 UL 10X PCR 버퍼, 1 UL 12.5 MM AA - dNTP (Invitrogen), 1 UL 100 pmol / UL 뇌관 B, 1로 구성된 마스터 믹스 45 UL에 드르 B 샘플 5 UL을 추가 1 UL KlenTaq LA (시그마), 37 UL 물. PCR 프로토콜 다음과 같이 프로그램을 실행 : 94 ° C, 2 분 → (94의 15주기 ° C, 30 S / 50 ° C, 45 S / 72 ° C, 1 분) → 72 ° C, 5 분 → 10 ° C ( 개최) </li><li> 제조 업체의 지침에 따라 DNA 청소 및 농축기 - 5 키트 (Zymo 연구)로 앳 C 예제를 청소합니다. 10 μL에 Elute. </li><li> 1M 중탄산염 1 UL (시그마)와 앳 C 예제 1 UL Cy5 (GE 헬스케어)를 추가합니다. </li><li> 어둠 속에 품어 X 1 시간. </li><li> 제조 업체의 지침에 따라 DNA 청소 및 농축기 - 5 키트 (Zymo 연구)와 Cy3 - 라벨 샘플을 청소하십시오. 12 μL에 Elute. </li></ol> 5. Virochip Microarray에 하이브 리다이 제이션 <ol><li> 옵션 : (샘플의 정상화를위한) Nanodrop 분광 광도계에 통합 cDNA 농도와 염료의 양을 확인 1.5 μL를 사용하여 </li><li> PCR 스트립 관에 25 μL의 총 볼륨 (애질런트) 1 μL 25X 조각 버퍼, 5 μL 배 차단 버퍼, Cy3 - 라벨 샘플의 9.5 μL (또는 정상화 금액) 및 물을 추가 </li><li> 2X GEx의 하이브리드화 버퍼 (애질런트) 25 μL를 추가합니다. 거품을 제거하기 위해 간략하게 스핀 다운. </li><li> 가스켓 슬라이드에있는 예제 40 μL를로드합니다. </li><li> 장소 애질런트 - 인쇄 Virochip 배열 (Californi 대학샌프란 시스코 / 애질런트) (아래 "애질런트"표시된 쪽) 개스킷 슬라이드 위에 단단히하고 나사를 고정. </li><li> 65 밤새 잡종 ° C 오븐, 10 RPM 속도 설정. </li><li> 37 ° C.에 배열, 앞서 열을 가하다 버퍼 2 (애질런트)를 씻어 버퍼 1 (애질런트)의 개스킷 슬라이드 / 배열 샌드위치 수중 갈라놓을. 버퍼 1 X 1 분 씻으십시오. preheated 버퍼 2 X 1 분에 씻으십시오. 천천히 (멀리 직접 배열의 적극적인 측면을 만지지 않도록주의하고 여분의 수분 윅에 kimwipe 사용) 거품을 피하기 위해주의하고, 버퍼 2 슬라이드를 제거 </li><li> 슬라이드 홀더에 슬라이드를 삽입하고 배열 ​​스캐너에 넣습니다. </li></ol> 6. Virochip 검색 및 분석 <ol><li> 스캔 Cy3 - 표시된 배열 악기의 표준 스캔 프로토콜 (그림 2B)에 따라 5 μm의 또는 2 μm의에서. </li><li> 육안 검사, 클러스터 분석, 또는 자동 Virochip 분석 프로그램에 의해 Virochip의 microarrays를 분석, 11 E - 예측했다. 이러한 세 가지 방법 중 각각으로 인플루엔자 바이러스가 쉽게 비강 면봉 샘플 (독감과 같은 질병을 가진 아이에서) (그림 2C)에 감지 </li></ol> 7. 대표 결과 : 프로토콜이 제대로되면 얼룩이 드르 B 단계 (그림 2A) 이후의 아가로 오스 겔 전기 영동에서 볼 수 있습니다. 애질런트 플랫폼에 Virochip microarray는 (그림 2B) 시각 분석하기 어려울 수 있지만, 바이러스가 존재한다면 그것은 쉽게 육안 검사, 클러스터 분석, 및 / 또는 E - 예측 (그림 1C)에 의해 식별되어야합니다. 검정에 대한 긍정적인 제어 역할을하는, 샘플은 알려진 바이러스 (박테리오 파지 MS2 예 : 담배 모자이크 바이러스)에서 핵산의 측정할 수량를 타서 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Virochip microarray 처리 및 분석의 개략도. 임상 시료에서 핵산을 추출은 무작위 증폭 형광 염료로 표시하고, Virochip microarray에 hybridized입니다. Microarrays 2 μm의 해상도에서 스캔 및 전자 예측을 포함하여, 전산 다양한 도구를 사용하여 분석하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Virochip 분석의 단계는 임의의 PCR, 200 얼룩에 의해 증폭 후 -. 1000 BP 겔 전기 영동에 의해 시각 수 (A) (B) 8 배열 / 유리 슬라이드의 세 Virochip의 microarrays 아웃은 작은 영역으로 표시됩니다. 고장 접속 오른쪽 하단 모서리에있는 삽입된 페이지에 한 microarray니다. (C) 자동 microarray 바이러스 분석을 사용하여 임상 샘플에서 독감 바이러스의 존재를 드러내 E를 예측했다. 높은 유사성 점수 (S = 0.55)은 이처럼 매우 중요한 예측하고, 제로에 가까운 P - 값에 해당합니다.

<ol><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+and+genotyping+of+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+a+critical+respiratory+illness+caused+by+human+metapneumovirus+by+use+of+a+pan-virus+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray.</a> J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+detection+of+human+parainfluenzavirus+4+infection+associated+with+respiratory+failure+in+an+immunocompetent+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult.</a> Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+DNA+microarrays+for+detection+of+viruses+in+acute+respiratory+tract+infections+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children.</a> J Pediatr. 153, 76-83 (2008).</li>
<li>Kistler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-viral+screening+of+respiratory+tract+infections+in+adults+with+and+without+asthma+reveals+unexpected+human+coronavirus+and+human+rhinovirus+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity.</a> J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).</li>
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<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardioviruses+related+to+Theiler%27s+murine+encephalomyelitis+virus+in+human+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Predict%3A+a+computational+strategy+for+species+identification+based+on+observed+DNA+microarray+hybridization+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns.</a> Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 설명한 Virochip 프로토콜은 복잡하고 세심한과 숙련된 연구 기술자가 필요합니다. 정확한 시약의 농도와 PCR, 라벨에 대한 조건과 하이브 리다이 제이션이 중요합니다. Virochip 프로토콜은 쉽게 같은 핵산 추출에 대한 TRIzol (Invitrogen)와 같은 조직 추출 방법의 사용에 의해 질병 조직의 분석을 수용하기 위해 수정할 수 있습니다. 프로브를 추가하거나 원하는 스펙트럼 및 범위의 광범를 얻을 필요 삭제할 수 있습니다, 예를 들어 &quot;- the - fly 방식에서&quot;같은 박테리아 및 곰팡이 등 nonviral 타겟의 검출을위한 프로브가 설계 될 수 있으며 추가됩니다. 현재 개발중인 Virochip 분석의 일부 응용 프로그램은 임상 실험실, 확산 조사, 약물 및 백신의 순도 검사, 그리고 새로운 바이러스성 병원체 발견에 광범위한 스펙트럼 바이러스 진단을 포함합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 재료의 이름 </th><th> 시약 / 재료의 이름 </th></tr><tr><td> 프리메라 </td><td> 5&#39; - GTTTCCCAGTCACGATA - (N9) -3 &#39; </td></tr><tr><td> 프리머 B </td><td> 5&#39; - GTTTCCCAGTCACGATA - 3 &#39; </td></tr><tr><td rowspan="5"> RT 마스터 믹스 (5 μL) </td><td> 2 μL 배 RT 버퍼 </td></tr><tr><td> 1 μL 12.5 MM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 μL 물 </td></tr><tr><td> 0.5 μL 0.1M DTT </td></tr><tr><td> 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sequenase 믹스 (5 μL) </td><td> 1 μL 배 Sequenase 버퍼 </td></tr><tr><td> 3.8 μL 물 </td></tr><tr><td> 0.15 μL Sequenase (USB 공사) </td></tr><tr><td rowspan="5"> 차 B PCR 마스터 믹스 (45 μL) </td><td> 5 μL 10X PCR 버퍼 </td></tr><tr><td> 1 μL 12.5 MM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 μL 100 μL / pmol 프리머 B </td></tr><tr><td> 1 μL KlenTaq LA (시그마) </td></tr><tr><td> 37 μL 물 </td></tr><tr><td rowspan="5"> 앳 C PCR 마스터 믹스 (45 μL) </td><td> 5 UL 10X PCR 버퍼 </td></tr><tr><td> 1 μL 12.5 MM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 μL 100 μL / pmol 프리머 B </td></tr><tr><td> 1 μL KlenTaq LA (시그마) </td></tr><tr><td> 37 μL 물 </td></tr><tr><td rowspan="4"> 하이브 리다이 제이션 버퍼 (25 μL) </td><td> 1 μL 25X 조각 버퍼 (애질런트) </td></tr><tr><td> 5 μL 5 배 차단 버퍼 (애질런트) </td></tr><tr><td> Cy3 - 라벨 샘플의 9.5 μL (또는 정상화 금액) </td></tr><tr><td> 25 μL의 총 볼륨 물을 추가 </td></tr><tr><td> 애질런트 Virochip microarray </td><td> 애기 실험실, UCSF에서 제공; 보류 라이센스 </td></tr></tbody></table>

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 microarray 분석 (virochip)를 사용

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

많은 전염성 질병의 바이러스 원인의 진단은 바이러스의 고유한 시퀀스 다양성뿐만 아니라 전통적인 방법에 의해 감지되지 SARS coronavirus 2009 유행성 H1N1 독감 바이러스로 소설 바이러스 병원균의 지속적인 출현으로 인해 어렵습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 이전에 개발하고 보존 순서 상동 1을 바탕으로 모든 알려진 바이러스뿐 아니라 소설 변종을 감지할 수있는 능력과 Virochip라는 판 - 바이러스 microarray 플랫폼을 확인했습니다. Virochip를 사용하여, 우리는 동등하거나 기존의 임상 테스트를 2-5로 뛰어난 감도로 입원한 환자에 설명할 수없는 중요한 질병의 경우를 포함한 호흡기 감염,과 관련된 바이러스의 전체 스펙트럼을 확인했습니다. Virochip 또한 SARS coronavirus 6,7, 소설 리노 바이러스의 clade 5, XMRV (전립선암에 연결된 레트로 바이러스) 8, 조류 bornavirus (앵무새의 낭비 질병의 원인) 9 포함한 새로운 바이러스를 식별하는 데 사용되었습니다 호흡기 질환과 diarrheal 10 어린이와 소설 cardiovirus. Virochip의 현재 버전은 애질런트 microarray 플랫폼에 포팅 2009 년 12 월 현재 GenBank에 ~ 이상 1500 바이러스로부터 파생된 ~ 36,000 프로브로 구성되어있다. 여기 샘플 핵산 추출, 임의 primers를 사용하여 PCR 증폭, 형광 염료 정관 및 microarray의 하이브리드화, 검사 및 분석을 포함하여 (~ 24 시간 처리 시간) 처음부터 끝까지 Virochip 분석 처리에 관련된 단계를 보여줍니다.

Virochip 동시에 보존 순서 상동에 기초하여 모든 알려진 바이러스뿐 아니라 소설의 바이러스를 검출하기위한 판 - 바이러스 microarray입니다. 여기 알려진 알려지지 않은 두 바이러스의 존재에 대한 임상 샘플을 분석 Virochip 분석을 실행하는 방법을 보여줍니다.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

많은 감염성 질환의 바이러스성 원인을 진단하는 것은 바이러스 고유의 서열 다양성뿐만 아니라 지속적으로 나타나는 새로운 변이로 인해 어렵습니다.

이 절차에서는 기지의 바이러스와 미지의 바이러스 모두를 분석하기 위해 임상 시료를 분석하는 범바이러스 마이크로어레이 분석법인 Viro 칩을 사용합니다. 먼저 임상 시료에서 핵산을 추출합니다. 다음으로, 추출된 RNA를 랜덤 프라이머를 사용하여 역전사합니다.두 번째 가닥 CD NA 합성을 수행하고, 무작위 PCR을 통해 CD NA 라이브러리를 증폭합니다. 그 다음, 증폭된 cd NA를 형광 염료로 표지하고 바이러스 칩 마이크로어레이에 하이브리드화합니다. 마지막 단계는 마이크로어레이를 스캔하고 분석하는 것입니다.최종적으로, 칩 마이크로어레이 분석을 통해 하나의 바이러스 또는 여러 바이러스의 존재 여부를 확인하는 결과를 얻을 수 있습니다. 폐렴과 같은 일반적인 임상 증후군은 특정 병원체에만 국한되지 않으며, SARS 코로나바이러스 및 2009년 신종 H1N1 인플루엔자 바이러스와 같은 새로운 바이러스성 병원체의 위협이 계속해서 나타나고 있기 때문에, 진단 미생물학 분야에서는 바이러스 칩 마이크로어레이와 같은 광범위 검출법이 필요합니다. 이 방법은 임상 현장에서 진단되지 않은 감염 중 어느 정도의 비율이 아직 확인되지 않은 신종 바이러스에 의해 발생했는지와 같은 진단 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 수백에서 수천 가지의 잠재적 병원체를 동시에 검사하므로, 이 기술의 활용 범위는 병원 내 급성 임상 질환의 더 나은 진단으로까지 확장됩니다.우리는 2002년 UCSF의 Joseph DeRisi 박사 연구실에서 개척한 최신 마이크로어레이 기술을 바이러스 검출에 적용하기로 결정하면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 우리의 첫 번째 실제 사례는 2003년 SARS의 원인이 되는 새로운 코로나바이러스를 식별하기 위해 바이러스 칩을 사용한 것이었습니다. 전체 절차의 시연은 제 연구실의 기술자가 담당하며, 어린이의 비강 면봉 검체에 바이러스 칩 분석법을 사용하여 급성 호흡기 질환의 원인을 진단하는 과정을 보여줄 것입니다. 비인두 면봉 검체는 바이러스 수송 액체 배지가 들어 있는 멸균 용기에 수집되어 -80 °C 냉동고에 냉동 보관됩니다.생물안전 작업대 내에서 샘플이 담긴 튜브를 해동하고, 배지 속의 면봉을 짧게 저어준 뒤 면봉을 생물학적 위험 폐기물 함에 버립니다. 그런 다음 샘플 200 µL를 1.5 mL 튜브에 분주합니다. 바이러스 입자를 정제하기 위해 샘플을 0.22 µm 스핀 필터에 통과시켜 새로운 1.5 mL 튜브에 수집합니다.다음으로, 제조사의 지침에 따라 Ambien의 Turbo DNA 키트를 사용하여 호스트 게놈 DNA를 분해하고 캡슐화되어 보호된 바이러스 핵산을 정제합니다. 이어서 XMO ZR 바이러스 RNA 추출 키트 또는 Qiagen 초음파 바이러스 키트를 사용하여 제조사의 지침대로 RNA를 추출합니다. 추출된 RNA의 농도는 NanoDrop 핵산 분광광도계를 사용하여 측정합니다.RNA 농도는 µL당 최소 10 ng인 것이 좋으나, 얇은 벽의 200 µL 튜브를 사용할 경우 샘플마다 다를 수 있습니다. 추출된 RNA 4 µL에 40 pmol/µL 농도의 프라이머 A 1 µL를 첨가하십시오. 서모사이클러에서 샘플을 65 °C로 5분 동안 가열한 후, 튜브를 실온에서 5분 동안 식히십시오.다음으로, 2 µL의 5× RT buffer, 1 µL의 12.5 mM dNTP, 1 µL의 물, 0.5 µL의 0.1 M DTT 및 0.5 µL의 superscript three 역전사효소가 포함된 마스터 믹스 5 µL를 써모사이클러(thermocycler)에 넣습니다. 튜브를 42 °C에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 94 °C로 2분 동안 가열합니다.역전사 반응을 중단시키기 위해, 10 °C에서 2분 동안 유지한 후 5초 동안 짧게 원심분리합니다. 다음으로, 1 $\mu\text{L}$의 5$\times$ quease 완충액, 3.8 $\mu\text{L}$의 물, 그리고 0.15 $\mu\text{L}$의 quease 제2 가닥 합성물로 구성된 5 $\mu\text{L}$의 quease 믹스를 첨가합니다. 써모사이클러의 온도를 8분에 걸쳐 10 °C에서 37 °C까지 올립니다.37 °C에서 8분 동안 유지합니다. 그런 다음 94 °C에서 2분 동안 가열하여 효소를 불활성화한 후, 이 시점에서 10 °C까지 냉각합니다. 필요한 경우, 15 µL의 cDNA가 포함된 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오.먼저, 5 µL의 CD NA 샘플을 5 µL의 10x PCR 버퍼, 1 µL의 12.5 mM dNTP, 1 µL의 100 pmol/µL 프라이머 B, 1 µL의 cleantech LA 및 37 µL의 증류수로 구성된 45 µL의 마스터 믹스에 첨가합니다. 그 후, 94 °C에서 2분간 반응시킨 뒤, 94 °C에서 30초, 50 °C에서 45초, 72 °C에서 1분간 진행하는 과정을 25회 반복하는 PCR 프로토콜을 수행합니다.그 후 72 °C에서 5분간 어닐링 단계를 거치고, PCR 종료 후 10 °C에서 유지합니다. 1.5% agarose 전기영동 겔을 사용하여 PCR 산물을 확인합니다. 약 200에서 1000 base pairs 사이의 스미어(smear)가 관찰되어야 합니다.AAD DNTP를 포함시키기 위해, 5 µL의 바이러스 PCR 생성물을 10배 농도의 PCR 버퍼 5 µL, 12.5 mM AAD NTP 1 µL, 다중 마이크로리터 프라이머 B 1 µL, ClinTech LA 1 µL 및 물 37 µL로 구성된 마스터 믹스 45 µL에 첨가합니다. PCR 프로토콜을 다음과 같이 수행합니다: 94 °C에서 2분, 94 °C에서 30초, 50 °C에서 45초를 15회 반복합니다.72°C에서 1분간 가열하고, 72°C에서 5분간 어닐링 단계를 거친 후 10°C에서 유지합니다. 그다지 제조사의 지침에 따라 DNA clean and concentrator three kit를 사용하여 새로운 PCR 생성물을 정제하고 10 µL의 elution buffer로 용해합니다. 10 µL의 PCR 생성물에 1 M bicarbonate 1 µL와 si three 1 µL를 첨가하고 암소에서 1시간 동안 배양합니다.다음으로, DNA clean and concentrator five 키트를 사용하여 S 라벨 샘플을 다시 정제하고 12 µL의 용출 버퍼(elution buffer)로 용출합니다. NanoDrop 분광광도계를 사용하여 cDNA 농도와 결합된 염료의 양을 확인하기 위해 샘플 1.5 µL를 사용합니다. PCR 스트립 튜브에 1 µL의 25배 농도 분절 버퍼(fragmentation buffer) 5 µL, 5배 농도 블로킹 버퍼(blocking buffer) 9.5 µL, 또는 SI3 라벨 샘플의 최종 농도가 10 pM/µL로 정규화되는 데 필요한 양과 물을 넣어 총 부피를 25 µL로 맞춥니다. 그 후 2x GX 하이브리다이제이션 버퍼(hybridization buffer) 25 µL를 첨가하고, 짧게 원심 분리하여 기포를 제거합니다.새 가스켓 슬라이드를 하이브리다이제이션 챔버에 넣습니다. 가스켓 슬라이드 위에 샘플 40 µL를 로딩합니다. 다음으로, Agilent라고 표시된 면이 아래로 향하도록 Agilent 프린티드 바이러스 어레이를 가스켓 슬라이드 위에 올리고 나사를 단단히 조입니다.하이브리다이제이션 챔버를 65 °C 오븐에 넣고, 분당 10회의 저속 회전을 사용하여 밤새 하이브리다이제이션을 진행하여 어레이를 세척합니다. 먼저 버퍼 2를 37 °C로 예열합니다. 500 mL 플라스틱 용기에 버퍼 1을 약 250 mL 채웁니다.하이브리다이제이션 챔버에서 어레이를 꺼내어, 어레이를 담근 후 가스켓 슬라이드에서 분리합니다. 어레이를 깨끗한 용기로 옮겨 버퍼 1로 1분 동안 세척합니다. 그다음 별도의 500 milliliter 플라스틱 용기를 사용합니다.미리 가열한 버퍼 2로 1분 동안 어레이를 세척합니다. 세척 후, 기포가 생기지 않도록 주의하며 버퍼 2에서 어레이를 천천히 꺼냅니다.킴와이프(kim wipe)를 사용하여 어레이의 활성 면에 직접 닿지 않도록 주의하면서 여분의 수분을 제거합니다. 마지막으로, 슬라이드를 Agilent 면이 위로 향하게 하여 슬라이드 홀더에 넣고 어레이 스캐너에 삽입합니다. 본 과정에서는 Agilent 2 micron DNA 마이크로어레이 스캐너를 사용합니다.기기 표준 스캔 프로토콜에 따라 SI 3개 표지 어레이를 5µm 또는 2µm에서 스캔합니다. 클러스터 분석 또는 자동화된 RO 칩 분석 프로그램인 e unpredic를 사용하여 바이러스 칩 마이크로어레이를 분석합니다. Viro Chipp 마이크로어레이 2009를 사용하면 인플루엔자 유사 증상을 보이는 아동으로부터 얻은 비강 면봉 검체에서 신종 인플루엔자 H1N1 바이러스를 쉽게 검출할 수 있습니다.또한, 본 바이러스 칩이 호흡기 바이러스뿐만 아니라 다양한 조직 및 체액에서 유래한 광범위한 바이러스를 식별할 수 있음을 확인하였습니다. 여기에서 보여주는 vichi를 이용한 전혈 및 혈청 내 바이러스 검출의 몇 가지 사례입니다. 이는 전혈 또는 혈청으로 채취한 4명의 환자 샘플 각각에 대한 viro chip 마이크로어레이 결과이며, P 값이 가장 낮은 상위 2개의 바이러스 예측 결과가 표시되어 있습니다.예를 들어, 연한 파란색으로 강조 표시된 샘플의 경우, 해당 샘플에 대한 최상위 예측 결과는 뎅기 바이러스 1형입니다. 두 번째 순위의 예측 결과는 뎅기 바이러스 2형이었으나, 해당 전혈 샘플 내의 실제 바이러스는 dict 결과와 일치하게 뎅기 바이러스 1형인 것으로 확인되었습니다. Viro chip의 또 다른 응용 분야는 신종 병원체 발견입니다.몇 가지 예로는 sars coronavirus X-M-R-V-A, 인간의 전립선암 및 만성 피로 증후군과 연관된 OME retrovirus, 그리고 어린이의 호흡기 및 설사 감염과 관련된 새로운 인간 심장 바이러스인 HTCV의 발견 등이 있습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행될 경우 12시간 내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 이 절차에 따라 필요한 모든 장비와 시약이 준비되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다.특이적 바이러스 PCR 증폭 및 심층 시퀀싱(deep sequencing)과 같은 다른 방법들을 통해, 개발 이후에 나타난 비정상적인 바이러스 칩 하이브리드화 패턴이나 새로운 바이러스의 존재를 암시하는 바이러스 칩 결과를 확인하고 추적 관찰할 수 있습니다. 이 기술은 종양학 분야의 연구자들이 신종 바이러스와 암의 연관성을 탐구하고, 생물방어 및 임상 미생물학 분야에서 신속한 병원체 진단을 위한 응축 마이크로 기반 분석법을 개발하며, 바이러스학 분야에서 신종 바이러스의 특성화 및 질병과의 연관성을 규명하는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 임상 시료에서의 핵산 추출부터 마이크로어레이 하이브리드화 및 분석에 이르기까지, 임상 시료 내 바이러스 병원체를 검출하기 위한 광범위 감시 검사인 바이러스 칩 마이크로어레이 분석의 모든 단계를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.임상 시료를 다루는 작업은 생물학적 위험이 있는 것으로 간주되므로, 핵산 추출은 생물안전등급 2단계(biosafety level two) 이상의 실험실에서 수행해야 함을 잊지 마십시오.

using-pan-viral-microarray-assay-virochip-to-screen-clinical-samples

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

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이 비디오는 항바이러스 화합물을 스크리닝하기 위한 바이러스 부착 분석을 보여줍니다. 유전자 변형 C형 간염 바이러스와 루시페라아제를 사용하여 바이러스만 처리한 웰에 비해 공동 처리된 웰에서 낮은 광 강도로 알 수 있듯이 바이러스 부착에 대한 억제 효과를 평가합니다.

항바이러스 화합물 스크리닝을 위한 바이러스 부착 분석

통합 마이크로 열가소성 칩은 분자 진단으로 사용하기 위해 개발되었습니다. 이 칩은 핵산 추출, 역 transcriptase 및 PCR을 수행합니다. 제조 및 칩을 실행하기위한 방법은 설명되어 있습니다.

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인간 게놈의 8 %를 차지 인간 내인성 레트로 바이러스 (HERV)는, 부족한 코딩 능력 만 십만 긴 터미널 반복 (LTR에 의해 둘러싸) 유지. 사용자 지정 Affymetrix의 마이크로 어레이는 개별 HERV의 궤적 표현을 식별하도록 설계되었으며, 향후 임상 연구에 대한 개념의 증거로 전립선 암 조직에 사용되었다.

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

세포 변성 효과 (CPE) 기반의 분석, 용량 - 반응 분석 및 시간 - 중 - 추가 TOA () 분석 등의 세 가지 분석은 물론, 개발, 최적화, 검증 및 Bluetongue 바이러스에 대한 새로운 항 바이러스제 (BTV)를 식별하기 위해 사용 된 새로 확인 된 항 바이러스제에 사용할 수있는 기계 장치의 액션 (대학교 미술관)을 결정하기로.

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

바이러스 복제를 측정하는 시험 관내 분석에서 크게 루시페라아제 또는 생물 발광 가능한 다른 효소를 발현하는 재조합 RNA 바이러스의 개발에 의해 개선되었다. 여기 세부 홍역 및 화학 도서관에서 폭 넓은 스펙트럼 항 바이러스를 분리하기 Chikungunya의 바이러스와 같은 재조합 균주를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

나노 크기의 PCR에 의한 DNA 및 RNA 기반 병원균 높은 처리량 테스트는 syndromic 개와 말 호흡기 PCR 패널을 사용하여 설명한다.

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

여기 우리는 프로토콜 설명 높은 처리량 RNAi 심사 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 폭로를 위한, 특히 rhabodvirus 및 vaccinia 바이러스 치료, 하지만 그것은 다른 oncolytic 쉽게 적용할 수 있습니다 바이러스 플랫폼 또는 변조 바이러스 복제를 일반적으로 호스트 유전자 발견.

RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

배우세요 Virochip 마이크로어레이 분석법으로 임상 샘플에서 알려진 바이러스와 새로운 바이러스를 동시에 검출하는 방법을 익히세요. 이 기술은 진단 미생물학에서 감염 원인 규명에 필수적입니다.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

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