바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

이 절차에서는 알려진 바이러스와 알려지지 않은 바이러스 모두에 대해 임상 시료를 분석하는 범바이러스 마이크로어레이 분석법인 Viro chip을 사용합니다. 먼저, 임상 시료에서 핵산을 추출합니다. 그다음, 추출된 RNA를 랜덤 프라이머를 사용하여 역전사합니다.

두 번째 가닥의 cDNA 합성을 수행하고, random PCR을 통해 cDNA 라이브러리를 증폭합니다. 그다음 증폭된 cDNA를 형광 염료로 표지하여 바이러스 칩 마이크로어레이에 하이브리드화합니다. 마지막 단계는 마이크로어레이를 스캔하고 분석하는 것입니다.

최종적으로, 칩 마이크로어레이 분석을 통해 바이러스 하나 또는 여러 바이러스의 존재 여부를 확인하는 결과를 얻을 수 있습니다. 폐렴과 같은 일반적인 임상 증후군은 특정 병원균에 특이적이지 않으며, SARS 코로나바이러스 및 2009년 신종 H1N1 인플루엔자 바이러스와 같은 새로운 바이러스성 병원균의 위협이 지속적으로 나타나고 있기 때문에 진단 미생물학 분야에서는 바이러스 칩 마이크로어레이와 같은 광범위 검출법이 필요합니다. 이 방법은 임상 환경에서 진단되지 않은 감염의 몇 퍼센트가 아직 확인되지 않은 신종 바이러스에 의해 발생했는지와 같은 진단 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 수백에서 수천 가지의 잠재적 병원균을 동시에 테스트하므로, 병원 내 급성 임상 질환의 진단 능력을 향상시키는 데 기여할 수 있습니다.

우리는 2002년 UCSF의 Joseph DeRisi 박사 연구실에서 개척한 새로운 마이크로어레이 기술을 바이러스 검출에 적용하기로 결정하면서 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 우리의 첫 번째 실제 적용 사례는 2003년 SARS의 원인이 된 새로운 코로나바이러스를 식별하기 위해 바이러스 칩을 사용한 것이었습니다. 전체 과정을 처음부터 끝까지 시연할 저희 연구실의 기술자가 어린이의 비강 면봉 검체에 바이러스 칩 분석법을 사용하여 급성 호흡기 질환의 원인을 진단하는 과정을 보여줄 것입니다. 비인두 면봉 검체는 바이러스 수송 액체 배지가 담긴 멸균 용기에 수집되어 -80 °C 냉동고에 냉동 보관됩니다.

생물안전 작업대 내에서 샘플이 들어 있는 튜브를 해동하고, 면봉을 배지 속에서 짧게 저어준 후 면봉을 생물학적 위험 폐기물 함에 버립니다. 그런 다음 샘플 200 µL를 1.5 mL 튜브에 분주합니다. 샘플을 0.22 µm 스핀 필터에 통과시켜 바이러스 입자를 정제하고 이를 새로운 1.5 mL 튜브에 수집합니다.

다음으로, 제조사의 지침에 따라 Ambien의 Turbo DNA 키트를 사용하여 호스트 게놈 DNA를 분해하고 보호 캡슐화된 바이러스 핵산을 정제합니다. 이어서 제조사의 지침에 따라 XMO ZR 바이러스 RNA 추출 키트 또는 Qiagen ultrasound 바이러스 키트를 사용하여 RNA 추출을 수행합니다. NanoDrop 핵산 분광광도계를 사용하여 추출된 RNA의 농도를 측정합니다.

RNA 농도는 가급적 µL당 10 ng 이상이어야 하지만, 얇은 벽의 200 µL 튜브를 사용할 때 샘플마다 차이가 있을 수 있습니다. 추출된 RNA 4 µL에 40 pmol/µL 농도의 프라이머 A 1 µL를 첨가하십시오. 써모사이클러에서 샘플을 65 °C로 5분 동안 가열한 후, 튜브를 실온에서 5분 동안 식히십시오.

다음으로, 5× RT buffer 2 µL, 12.5 mM dNTP 1 µL, 물 1 µL, 0.1 M DTT 0.5 µL, 그리고 reverse transcriptase 0.5 µL가 포함된 마스터 믹스 5 µL를 써모사이클러 내의 튜브에 첨가합니다. 튜브를 42 °C에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 94 °C에서 2분 동안 가열합니다.

역전사 반응을 중단하려면 10 °C에서 2분 동안 유지한 후 5초간 짧게 원심분리하십시오. 다음으로 5× quease 버퍼 1 µL, 물 3.8 µL 및 quease 2차 가닥 합성 효소 0.15 µL로 구성된 quease 믹스 5 µL를 첨가하십시오. 서모사이클러의 온도를 8분에 걸쳐 10 °C에서 37 °C까지 올리십시오.

37 °C에서 8분 동안 유지합니다. 그 다음 94 °C에서 2분 동안 가열하여 효소를 불활성화시킨 후, 이 시점에서 10 °C까지 냉각합니다. 필요한 경우, 15 µL의 cDNA가 포함된 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오.

먼저, 10배 PCR buffer 5 µL, 12.5 mM dNTP 1 µL, 100 pmol/µL primer B 1 µL, Cleantech LA 1 µL 및 물 37 µL로 구성된 마스터 믹스 45 µL에 CD NA 샘플 5 µL를 추가합니다. 그 후, 다음과 같이 PCR 프로토콜을 수행합니다: 94 °C에서 2분간 반응시킨 후, 94 °C에서 30초, 50 °C에서 45초, 72 °C에서 1분 과정을 25회 반복합니다.

그 다음 72 °C에서 5분 동안 연장 단계를 거치고, PCR 종료 후 10 °C에서 보관합니다. PCR 산물을 1.5% agarose 전기영동 겔로 확인합니다. 약 200에서 1000 base pairs 사이의 스미어(smear)가 관찰되어야 합니다.

AAD DNTP를 결합하려면, 10배 PCR buffer 5 µL, 12.5 mM A-A-D-N-T-P 1 µL, 100 p의 multiple microliter primer B 1 µL, ClinTech LA 1 µL 및 물 37 µL로 구성된 마스터 믹스 45 µL에 바이러스 PCR 산물 5 µL를 추가합니다. PCR 프로토콜을 다음과 같이 수행합니다: 94 °C에서 2분, 94 °C에서 30초, 50 °C에서 45초로 총 15 사이클을 진행합니다.

72 °C에서 1분간 반응시키고, 72 °C에서 5분간 어닐링 단계를 거친 후 10 °C에서 유지합니다. 그 후, 제조사의 지침에 따라 DNA clean and concentrator three 키트로 새로운 PCR 산물을 정제하고 10 µL의 용출 버퍼(elution buffer)에 녹입니다. 10 µL의 PCR 산물에 1 M bicarbonate 1 µL와 si three 1 µL를 첨가하고 암소에서 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, DNA clean and concentrator 5 키트를 사용하여 S 라벨링된 샘플을 다시 정제하고 12 µL의 용출 버퍼(elution buffer)로 용출합니다. 1.5 µL의 샘플을 사용하여 NanoDrop 분광광도계로 cDNA 농도와 결합된 염료의 양을 확인합니다. PCR 스트립 튜브에 1 µL의 25x fragmentation buffer, 5 µL의 5x blocking buffer, 그리고 S I3 라벨링된 샘플의 최종 농도가 10 pM/µL로 표준화되는 데 필요한 양(또는 9.5 µL)과 전체 부피가 25 µL가 되도록 물을 넣습니다. 그 후 25 µL의 2x GX hybridization buffer를 추가하고, 잠시 원심 분리하여 기포를 제거합니다.

새 가스켓 슬라이드를 하이브리다이제이션 챔버에 넣습니다. 샘플 40 µL를 가스켓 슬라이드 위에 로딩합니다. 그다음, Agilent 표시가 된 면이 아래로 향하도록 Agilent 프린팅 바이러스 어레이를 가스켓 슬라이드 위에 올리고 나사를 단단히 조입니다.

하이브리다이제이션 챔버를 65 °C 오븐에 넣고, 분당 10회의 느린 회전으로 하룻밤 동안 하이브리다이제이션을 수행하여 어레이를 세척합니다. 먼저 가열하는 동안 buffer two를 37 °C로 예열합니다. 500 mL 플라스틱 용기에 약 250 mL의 buffer one을 채웁니다.

하이브리다이제이션 챔버에서 어레이를 꺼내어, 어레이를 담근 후 가스켓 슬라이드로부터 분리합니다. 어레이를 깨끗한 용기로 옮겨 버퍼 1에서 1분 동안 세척합니다. 그 다음, 별도의 500 milliliter 플라스틱 용기를 사용합니다.

예열된 버퍼 2로 어레이를 1분 동안 세척합니다. 세척 후, 기포가 생기지 않도록 주의하며 어레이를 버퍼 2에서 천천히 꺼냅니다.

킴와이프(kim wipe)를 사용하여 여분의 수분을 흡수시키되, 어레이의 활성 면에 직접 닿지 않도록 주의하십시오. 마지막으로, 슬라이드를 Agilent 면이 위로 향하게 하여 슬라이드 홀더에 놓고 어레이 스캐너에 삽입합니다. 본 과정에서는 Agilent 2 µm DNA 마이크로어레이 스캐너를 사용합니다.

기기 표준 스캔 프로토콜에 따라 SI 3개 표지 어레이를 5µm 또는 2µm에서 스캔하십시오. 바이러스 칩 마이크로어레이는 클러스터 분석 또는 자동 RO 칩 분석 프로그램인 e unpredic를 사용하여 분석하십시오. Viro Chipp 마이크로어레이 2009를 사용하면 인플루엔자 유사 증상이 있는 아동으로부터 얻은 비강 도말 검체에서 신종 인플루엔자 H1N1 바이러스를 쉽게 검출할 수 있습니다.

또한, 본 바이러스 칩이 호흡기 바이러스뿐만 아니라 다양한 조직 및 체액에서 유래한 광범위한 바이러스를 식별할 수 있음을 입증하였습니다. 여기에서는 vichi를 사용하여 전혈 및 혈청에서 바이러스를 검출한 몇 가지 사례를 보여줍니다. 이는 전혈 또는 혈청 혈액 샘플 4개 각각에 대한 viro chip 마이크로어레이의 결과이며, 상위 2개의 바이러스 예측 결과가 표시되어 있고, 그중 P 값이 가장 낮은 것이 최상위 바이러스 예측 결과입니다.

예를 들어, 연한 파란색으로 표시된 샘플의 경우, 해당 샘플에 대한 최상위 예측 결과는 뎅기 바이러스 1형입니다. 두 번째 순위의 예측 결과는 뎅기 바이러스 2형이었으나, 해당 전혈 샘플 내의 실제 바이러스는 dict 결과와 일치하게 뎅기 바이러스 1형으로 확인되었습니다. viro chip의 또 다른 응용 분야는 신종 병원체 발견입니다.

몇 가지 사례로는 sars coronavirus X-M-R-V-A의 발견, 인간의 전립선암 및 만성 피로 증후군과 연관된 OME retrovirus, 그리고 어린이의 호흡기 및 설사 감염과 관련된 새로운 인간 심장 바이러스인 HTCV 등이 있습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행될 경우 12시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 다음 절차에 따라 필요한 모든 장비와 시약의 가용성을 확보하는 것이 중요함을 기억하십시오.

특이적 바이러스 PCR 증폭 및 심층 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 통해, 개발 이후 나타난 특이한 바이러스 칩 하이브리드화 패턴이나 신종 바이러스의 존재를 시사하는 바이러스 칩 결과를 확인하고 추적 관찰할 수 있습니다. 이 기술은 종양학 분야의 연구자들이 신종 바이러스와 암의 연관성을 탐구하고, 생물방어 및 임상 미생물학 분야에서 신속한 병원체 진단을 위한 응축된 마이크로 기반 분석법을 개발하며, 바이러스학 분야에서 신종 바이러스의 특성 분석 및 질병과의 연관성을 규명하는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 임상 시료로부터의 핵산 추출부터 마이크로어레이 하이브리드화 및 분석에 이르기까지, 임상 시료 내 바이러스 병원체를 검출하기 위한 광범위 감시 테스트인 바이러스 칩 마이크로어레이 분석의 모든 단계를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

임상 시료를 다루는 작업은 생물학적 위험이 있는 것으로 간주되므로, 핵산 추출은 생물안전등급(biosafety level) 2 이상의 실험실에서 수행해야 함을 잊지 마십시오.