해부 그리고 스테 이닝 Drosophila 애벌레 난소

이 절차의 전반적인 목표는 컨포칼 현미경으로 후기 제3 instar 초파리 유충에서 분리된 난소를 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 동기화된 개체군에서 암컷 유충을 선택하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 온전한 지방체를 해부하여 창자와 표피에서 분리한 다음 얼음 위에 놓는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 얼룩을 수정하고 난소가 박힌 뚱뚱한 몸을 씻는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 장착하는 동안 지방체에서 난소를 분리하는 것입니다. 궁극적으로 면역형광 현미경 검사를 통해 세포 특이적 염색을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 미세한 해부 및 장착에 많은 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 해부 5일 전에 신선한 25mm 플라이 푸드 바이알에 효모를 추가합니다. 7-16마리의 짝짓기 암컷 초파리를 바이알에 넣습니다.

암컷이 2-4시간 동안 또는 바이알 당 약 30개의 알이 될 때까지 알을 낳도록 합니다. 바이알이 들어있는 알을 섭씨 25도에서 최소 70%의 습도로 부화시킵니다. 5일이 지나면 유충은 세 번째 인스타 후반에 도달합니다.

9개의 우물 유리 해부 접시를 링거의 매체로 채웁니다. 다음으로, 링거가 들어있는 페트리 접시에 나일론 메쉬가 장착 된 특수 제작 된 금형을 준비합니다. 보통. 고운 집게를 사용하여 접시를 얼음 위에 놓습니다.

유리병 벽에서 10-15마리의 유충을 골라 해부 접시에 넣는다. 암컷 선택 및 해부를 위해 해부 접시를 현미경 아래에 놓습니다. 암컷 유충은 덩어리로 수컷과 구별할 수 있습니다.

남성의 고환은 지방체의 뒤쪽 3분의 1에 박혀 있는 크고 투명한 타원형으로 쉽게 식별됩니다. 지방체의 같은 부분에 위치한 여성의 난소는 훨씬 더 작고 투명한 둥근 구체로 식별될 수 있습니다. 난소가 보이지 않으면 암컷 유충은 고환이 없는 것으로 식별됩니다.

암컷 유충을 깨끗한 우물로 옮기십시오 해부를 시작하려면 집게를 사용하여 유충을 뇌 바로 뒤쪽에 고정하십시오. 두 번째 집게로 머리를 제거합니다. 유충의 나머지 뒤쪽 부분을 기관이 아래를 향하도록 등 쪽에 놓습니다.

한 쌍의 집게로 뒤쪽 구형으로 유충을 잡습니다. 그런 다음 겸자를 동시에 천천히 안쪽으로 밀고 다른 쌍의 집게를 사용하여 유충 지방체의 약 절반이 단단히 나올 때까지 큐티클을 후방으로 밉니다. 한 쌍의 집게로 큐티클의 뒤쪽 끝을 잡고 다른 한 쌍으로 큐티클의 나머지 부분을 느슨하게 잡고 뒤쪽 끝을 천천히 당겨 큐티클과 연결된 장이 틈을 통해 미끄러지도록 합니다.

이 과정이 끝나면 지방체의 앞쪽 부분에서 장과 큐티클을 분리하십시오. 해부된 유충이 들어 있는 우물에서 추출한 링거 배지로 목초지 피펫을 완전히 적십니다. 목초지 피펫을 사용하여 지방체를 세포 여과기의 얼음처럼 차가운 링거 배지로 옮깁니다.

다음 단계는 링거 배지에서 5% 포름알데히드로 제제를 고정하고 염색하고 안와 쉐이커에서 부드럽게 교반하면서 20분 동안 지방체를 배양하는 것입니다. 지정하지 않는 한 모든 단계는 실온에서 수행됩니다. 뚱뚱한 몸을 1%PBT로 세 번 씻어내면 첫 번째는 5분, 두 번째는 10분, 세 번째는 45분입니다.

부드러운 교반으로 1시간 동안 0.3%PBTB로 차단합니다. 동요에 이어. 뚱뚱한 몸을 0.2 밀리리터 튜브로 옮깁니다.

여분의 액체를 제거하고 0.3%PBTB로 희석된 원하는 첫 번째 항체를 첨가하고 롤러에서 부드럽게 교반하면서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 뚱뚱한 몸을 곰팡이로 다시 옮깁니다. 다음으로, 부드러운 교반으로 0.3% PBTB로 각각 30분씩 3회 3회 세척합니다.

그런 다음 0.3% PBTB에 5% 일반 당나귀 세럼을 1시간 동안 첨가하여 차단합니다. 부드럽게 교반하여 지방체를 0.2ml 튜브로 옮기고 차단 용액에 희석된 적절한 2차 형광 항체를 첨가합니다. 튜브를 랙에 놓고 랙을 롤러 인큐베이팅에 놓고 부드럽게 교반하면서 2시간 동안 배양합니다.

항체가 형광성인 경우 이 시점부터 어둠 속에서 배양하십시오. 2시간 후 지방체를 다시 금형으로 옮기고 부드러운 교반으로 0.3% PBT로 30분씩 3회 세척하여 난소를 해부하고 장착합니다. 뚱뚱한 몸을 깨끗한 아이노르 튜브에 매우 조심스럽게 옮기십시오.

방목 피펫으로 모든 액체를 제거하고 즉시 벡터 쉴드 장착 매체로 덮습니다. 피펫 팁의 끝을 자르고 최소한의 장착 매체로 뚱뚱한 몸체를 조심스럽게 흡입합니다. 뚱뚱한 몸을 현미경 슬라이드로 옮깁니다.

다음 단계는 0.1mm 직경의 핀을 고정하는 두 개의 니켈 도금 핀 홀더를 사용하여 실체 현미경으로 지방체를 펼치고 지방체의 뒤쪽 3분의 1을 보고 난소를 국소화하는 것입니다. 뚱뚱한 몸체는 난소를 둘러싸고 있는 꽃 모양을 가지고 있습니다. 뚱뚱한 몸체의 나머지 부분에서 꽃을 해부하고 사다리를 버립니다.

생식선 주위의 두 개의 핀을 조심스럽게 교차시키고 난소에서 멀리 놀림으로써 생식선을 둘러싼 지방체를 제거합니다. 분리된 생식선을 뚱뚱한 몸 잔여물에서 멀리 떨어진 슬라이드에 놓고 뚱뚱한 몸 잔여물을 버립니다. 덮개로 슬라이드를 덮습니다.

매니큐어로 미끄러지고 밀봉하십시오. 컨포칼 현미경을 사용하여 난소를 직접 시각화합니다. 이 수치는 서로 다른 항체 조합으로 염색된 2개에서 3개의 난소에서 가져온 것입니다.

첫 번째 이미지에서 하나의 항체는 체세포와 염색의 윤곽을 보여줍니다. 화살표로 표시된 fuso fuso는 세포 내 소기관입니다. 녹색으로 표시된 원시 생식 세포 내에는 말단 필라멘트와 캡 세포가 있으며, 이들은 함께 틈새의 체세포를 형성하고 화살촉은 캡 세포를 가리킵니다.

이 그림은 파란색으로 표시된 생식 세포와 직접 접촉하는 자홍색의 혼합된 세포를 보여줍니다. 난소의 체세포는 발달 후 녹색으로 윤곽이 그려져 있습니다. 이 기술은 줄기세포 생물학 분야의 연구자들이 테조 난소에서 틈새 형성 및 줄기세포 설립을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.