Name: 높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 학습하세요 다중 qRT-PCR과 마이크로플루이딕 플랫폼을 결합한 고효율 microRNA 발현 프로파일링 방법을. 이 기술은 소량 시료에서도 384개 microRNA를 정확하게 분석하여 신경과학 및 분자생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 텍스트를 코멘트에 대한 Blelloch 실험실을 감사드립니다. 이 작품은에서 NIH (K08 NS48118 및 R01 NS057221), 재생 의학의 캘리포니아 공과 대학 (CIRM) (시드 부여 RS1 - 00161, 뉴 학부 수상 RN2 - 00906)와 퓨 자선 트러스트에서 RB하는 자금에 의해 및 FM을 지원했습니다 Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft EV.

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앨런 미러는 플루 회사의 직원입니다. 그렇지 않으면, 우리는 공개하지 재정적 이해 관계가 없습니다.

miRNAs가 짧고 (18-24 세포핵), 비 코딩 모두 약화 메신저 RNAS (mRNA)와 억제 자신의 번역에 의해 게시 - transcriptionally 유전자 발현을 조절 RNAS을 6. 인간 유전자 중 최소한 한 세 번째 보존 포함 사실 miRNA 자신의 3&#39;UTR에 바인딩 - 사이트 및 pluripotency, 증식 및 apoptosis에 대한 유전자 miRNAs의 뚜렷하지 상호 작용은 세포의 운명 결정, 조직 항상성 및 암 같은 질병에 중요한 기여를 제안합니다. 6,7 따라서 정확한 microRNA 표현 프로파일은 확장의 아르 관심. qRT - PCR의 miRNA 발현 프로 파일링 프로토콜 2 출판 멀티 플렉스를 테스트하려면 우리는 부정적인 컨트롤로 작은 RNA 결함 mESC를 사용합니다. / - - DGCR8 - / - 주사위 놀이를하는 사람 중에 세포는 모든 정식 microRNAs의 결함입니다. 세포는 정식이 아닌 canoncial 모두 micoRNAs 부족 8,9 / - - DGCR8 MES 대 야생 유형의 수준을 비교 세포를, 우리는 몇 가지 10 microRNAs는 야생 형 세포 11 발견되지 않은 표현으로 정확성 부족을 밝혀. 일부는 심지어 녹아웃 세포 (그림 3A)에 비해 낮은 표현 수준을 보여주었다. 우리는 정확성의 부족은 singleplex RT - 부량 전에 연속 2 멀티 플렉스 단계의 대규모 뇌관 이월 (RT 및 Pre - PCR)에 의한지도 모른다고 가상. 그러나, 멀티 플렉스 사전 증폭은 RNA의 시작 농도가 제한 특히, 신호의 강도를 향상시키기 위해 필요합니다. / - - 원시 polyacrylamide의 젤 (그림 2)에서 크기를 선택하여 primers에서 사전 PCR 제품을 멀리 정화함으로써, 우리는 Dgcr8 모두에서 더 많은 microRNAs과 거짓 긍정적인 신호의 손실을 감지하여 정확성에 상당한 개선을 보여주는 수 있으며, 주사위 놀이를하는 사람 - / - 또한 배경 (인물 3A 및 3B) 희귀 Dgcr8 독립 / 주사위 놀이를하는 사람 종속 작은 RNAS (그림 3B) 11의 적절한 분류에 허용되는 변경 qRT - PCR 방식. 따라서 멀리 사전 PCR 제품의 과도한 primers를 정화하기 위해 추가 단계는 대형 멀티 플렉스 프라이머를 사용하면 예제마다 집합 특히, 명확하게 유리한 것입니다. 사전 증폭 사이클의 최적의 번호는 입력 RNA의 농도에 의해 결정됩니다. 하지 미만 또는 균형 overamplify는 특정 실험의 세부 사항으로 안내한다. 이상 천 알려진 microRNAs를 통해 표준의 사용 384 잘 복수의 샘플을 비교 특히 접시가 광범위한 microRNA 프로 파일링 최적되지 않을 수 있습니다. 플루 동적 배열 IFC는 nanoliter 규모 (6.7 NL)에서 하나의 실험 (9,216 반응)에서 96 가지 microRNAs에 대해 96 개인 샘플까지 테스트, pipetting 단계와 필요한 화학 상당한 감소와 수 있습니다. 각 실행에 대한 분석 소프트웨어는 증폭 곡선, 색상 코드 열지도 및 사이클 임계값 값 (CT)를 제공합니다. 동시 대규모 프로 파일링은 실험 차이를 줄여 작은 RNA 컨트롤을 사용하게 다른 정상화 전략을 밖 수행 의미 표현 값 정상화에 대한 수 있습니다. 12 미리 할당된 TaqMan 프로브와 함께 상용 384 잘 플랫폼에 비해, 사용자 정의 만든 프라이머 세트와 높은 처리량 프로 파일링 플랫폼의 조합은 높은 실험 유연성을 제공합니다. 동적 배열 플랫폼과 함께 최적화된 멀티 플렉스 qRT - PCR 방법은 성공적으로 우리는 동시에 384 miRNA (그림 4)의 수준에서 변경 48 전립선 암 환자 세라를 화면과 컨트롤의 증가 (즉, 합성 microRNAs)없이 데이터를 정상화 수있었습니다. 11 샘플 준비의 프로 파일링 결과 단계의 증가에도 불구하고, 설명하는 방식도 제한 시작 소재, 시간 및 miRNA 발현 수준에 대한 큰 샘플 세트를 프로필에 비용 효율 높은 처리량 방법입니다.

높은 처리량 microrna의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 arraytm의 ifcs에 nanoliter의 규모 qrt - pcr

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

개발, 조직 homoeostasis과 질병을 기본 핵심 프로세스에서 miRNAs의 광범위한 참여가 연구와 제약 공동체 간의 급증 관심되었다. miRNAs을 연구하기 위해서는 microRNA 수준의 부량가 정확하고 안정적​​인 것을 중요합니다. 작은 RNA 부족한 마우스 배아 줄기 세포 (mESC)에 야생 형 비교하여, 우리는 이전의 출판 멀티 플렉스 qRT - PCR 기술의 정확성과 견고의 부족을 공개했다. 여기, 우리는 극적으로 기술의 정확성과 견고을 증가 singleplex 실시간 감지, 이전 이전 다중화 단계에서 과도한 primers 멀리 정화를 포함하여 최적의 방법을 설명합니다. nanoliter 볼륨에서 microfluidic 칩 기술을 수행하는 방법에 또한, 우리가 설명 크게 시약 비용 절감 및 시간 효율적인 높은 처리량 miRNA 발현 프로 파일링을 수 있습니다.

여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

발달, 조직 항상성 및 질병의 기저가 되는 핵심 과정에 miRNA가 광범위하게 관여함에 따라, ... 사이에서 관심이 급증하고 있습니다.

이 절차의 전반적인 목적은 다중 정량적 R-T-P-C-R을 미세유체 플랫폼과 결합하여 최소한의 시작 물질로 효율적이고 저렴하게 마이크로 RNA 발현을 분석하는 것입니다. 먼저 추출된 RNA를 농축한 후, 다중 역전사와 다중 사전 증폭을 진행합니다. 다음 단계로 과잉 프라이머를 제거하기 위한 정제 과정을 거칩니다.마지막으로, 마이크로유체 플랫폼을 사용하여 단일플렉스 micro RNA 발현을 분석합니다. 그 결과, 관심 샘플 전반에 걸쳐 정확하고 재현성이 높은 micro RNA 발현 수준을 얻을 수 있습니다. 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 pre-EMP 증폭 후 추가 정제 단계를 통해 멀티플렉스 Q-R-T-P-C-R 방법의 정확도와 재현성을 향상시킨다는 점입니다.혈청에서 추출한 RNA로 시작합니다. TRIzol과 같이 균질화된 조직을 이용한 페놀 클로로포름 기반의 RNA 방법이나 RNA 정제 키트를 사용하여 추출하며, 모든 추출 후에는 세척 단계를 거쳐야 하고 모든 보관은 -80 °C에서 수행합니다. RNA 용액을 농축합니다.혈청과 같이 샘플 양이 제한적인 경우, 먼저 MicroCon 샘플 저장조를 바이알에 삽입한 다음, 파이펫 팁이 멤브레인에 닿지 않도록 매우 주의하며 RNA 용액을 저장조에 파이펫팅합니다. 이제 바이알과 필터를 크랙 밴드가 로터를 향하도록 원심분리기에 배치하고 약 3시간 동안 원심분리를 수행합니다. 3시간 후, RNA가 멤브레인에 완전히 농축되어 RNA를 용출할 수 있게 됩니다.원하는 양의 RNA-free water를 막(membrane)에 첨가하고, 저장조를 뒤집어 새로운 바이알에 넣습니다. 그 다음 4 °C에서 최대 3000 ×g로 3분 동안 원심분리합니다. 농축된 RNA는 필요할 때까지 -80 °C에서 보관합니다. xpl 역방향 stem-loop 프라이머를 사용하여 RNA로 RT 반응을 수행한 후, 12~18회의 PCR 사이클을 진행합니다. microRNA는 cDNA 가닥으로 나타납니다.이를 pre PCR 산물이라고 합니다. 이어지는 QPCR을 위해, pre PCR 산물을 10% poly acrylamide gel 상에서 10 base paired DNA ladder와 함께 정제해야 합니다. 각 레인에 6x orange G 5.5 microliters와 pre PCR 산물 27.5 microliters의 혼합액을 로딩하십시오.젤을 150 V에서 55~60분 동안 전기영동합니다. Romo phenol blue는 이 젤의 20 bp 영역에서 이동합니다. 전기영동이 끝나면, 빛에 노출되지 않도록 주의하며 셰이커 위에서 25분 동안 cyber gold로 염색합니다.60에서 80 base pair 사이의 PCR 생성물 밴드를 절단하여 라벨이 부착된 튜브로 겔 블록을 옮깁니다. 생성물 농도가 낮으면 밴드가 보이지 않을 수 있으나, 생성물은 여전히 겔 내에 존재합니다. 이제 튜브-인-튜브(tube-in-tube) 원심분리를 사용하여 겔 밴드를 분쇄하고 300 microliters의 TEN buffer를 첨가합니다.버퍼 겔 혼합물을 37 °C에서 4시간 동안 교반하며 배양하십시오. 4시간 후, 액체를 새 튜브로 옮기고 TEN 버퍼 300 µL를 추가로 첨가하십시오. 이 혼합물을 4 °C에서 교반하며 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, 튜브의 내용물을 다시 옮기고 pre PCR 생성물의 에탄올 침전 과정을 진행합니다. 칩을 패키지에서 꺼낸 후에는 24시간 이내에 프라이밍을 해야 하며, 프라이밍 후 60분 이내에 로딩해야 합니다. 칩의 각 어큐뮬레이터에 150 µL의 컨트롤 라인 액체를 주입하여 어레이 프라이밍을 시작합니다.칩이나 입구에 액체가 묻지 않도록 주의하십시오. 액체가 묻으면 칩을 사용할 수 없게 됩니다. 그 다음 칩을 통합 유체 회로 또는 IFC 컨트롤러에 장착하고 컨트롤러의 프라이밍 스크립트를 실행하십시오. 프로그램이 시작되는 즉시 샘플 준비를 시작하십시오.먼저 pres 샘플을 준비합니다. TaqMan, universal master mix 및 loading 시약을 혼합합니다. 그다음 96-well loading 포맷을 사용하여, 각 샘플 2.25 µL와 pres 샘플 믹스 2.75 µL를 혼합하여 로딩액을 수집합니다. 플레이트를 짧게 볼텍싱한 후 4 °C에서 빠르게 원심 분리합니다.이제 샘플 플레이트 준비가 완료되었습니다. 새로운 96웰 플레이트를 사용하여 분석 혼합물을 13배 농도로 준비하십시오. 이는 각 웰에 유니버설 프라이머 1종, 정방향 프라이머 및 유전자 특이적 tac man 프로브를 혼합하여 수행합니다.1X 농도는 공통 및 정방향 프라이머의 경우 1 µM이며, TacMan 프로브의 경우 0.2 µM입니다. 그다음, 최종 웰 부피 5 µL에서 Tween의 최종 농도가 0.25%가 되도록 충분한 양의 Tween을 추가합니다. 기포가 생기지 않도록 잘 섞어준 후, 플레이트를 짧게 원심분리하여 액체를 모읍니다.이것은 분석 플레이트입니다. 칩을 로딩하여 96.96 Q-R-T-P-C-R을 시작하십시오. 먼저 샘플을 로딩한 다음, IFC의 각 입구당 최종 부피 5 µL가 되도록 분석 시약을 로딩하십시오.둘째, load mix 스크립트를 실행하여 샘플과 어세이를 칩에 로드합니다. 스크립트가 종료되면 로드된 칩에서 보호 필름을 벗겨내고, 접착 테이프를 사용하여 칩 표면의 먼지 입자나 이물질을 제거합니다. 이제 바이오 시스템 증폭 프로그램을 설정합니다.칩을 시스템에 장착하고 프로그램을 실행합니다. 결과는 fluid dime 소프트웨어로 분석하여 증폭 곡선, 전체 칩 히트맵 및 각 웰의 CT 값을 확인할 수 있습니다. native poly acrylamide 겔 상의 크기 분리로 정제된 pre PCR 산물인 야생형 DG CR eight 및 ER null 돌연변이를 사용합니다.RNA는 이전 프로토콜과 비교하여 준비되었습니다. 정제 단계 덕분에 DGCR8 결핍 및 ER 결핍 배경 모두에서 더 많은 microRNA를 얻었으며 위양성 신호의 손실이 발생했습니다. 또한, 수정된 QR TPCR R 접근 방식을 통해 희귀한 D gcr eight 독립적 dicer 의존적 small RNA를 적절하게 분류할 수 있습니다.본 연구에서는 환자 및 대조군으로부터 얻은 48개의 cera를 대상으로 384가지 서로 다른 microRNA의 발현 변화를 스크리닝하였습니다. 데이터는 대조군에서 spike-in을 사용하지 않고, 각 샘플에서 해당 중앙값을 빼는 방식으로 정규화하였습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 극소량의 RNA 입력물로 시작하더라도 flu line 플랫폼 기반의 multiplex Q-R-T-P-C-R을 사용하여 수많은 샘플에 걸쳐 수백 개의 micronase를 동시에 프로파일링하는 방법을 충분히 이해하실 수 있을 것입니다.

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우리는 사전 microRNA의 설정 및 분석 서비스를 선보일 예정 써모 과학 매트릭스 멀티채널 피펫과 수작업으로뿐만 아니라 로봇을 사용하여 QPCR위한 96 잘 배열.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

exosomes에서 안정 마이크로 RNA (miRNA에)의 존재는 생체로 및 치료 개입에 대한 경로로 자신의 잠재력 유틸리티, 간 커뮤니케이션의 새로운 형태로 엄청난 관심을 생성했습니다. 여기에 우리가 전송되는 miRNA에를 식별하는 정량 PCR에 의해 다음 혈액과 문화 미디어에서 exosome 정화를 보여줍니다.

혈액과 문화 매체에서 파생 Exosomes의 정화 및 마이크로 RNA 프로파일

우리는 뇌척수액 (CSF)에서 마이크로 RNA 프로필 실시간 PCR의 프로토콜을 설명합니다. RNA 추출 프로토콜을 제외하고, 절차는 다른 체액, 배양 된 세포 또는 조직 표본에서 추출한 RNA로 확장 될 수있다.

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

에스트로겐과 마이크로 RNA 모두를 통해 신호 분자는 유방암의 발전과 성장에 중요하다. 에스트로겐은 전사 인자이다 에스트로겐 수용체를 활성화합니다. 많은 전사 인자는 마이크로 RNA의 발현을 조절할 수 있으며, 에스트로겐 조절 마이크로 RNA는 다른 대규모 기법을 사용하여 프로파일 링 할 수있다.

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

순환 마이크로 RNA는 최근 각종 암 및 기타 질환에 대한 유망한 새로운 바이오 마커로 등장했다. 이 문서의 목적은 세 가지 다른 프로브 기반의 실시간 PCR 플랫폼 및 정량화 및 마이크로 RNA 순환의 풍요 로움을 결정하는 데 사용할 수있는 방법을 논의하는 것입니다.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

우리는 증폭 없이 생물학적 기질에서 분자를 바코딩하고 계수하여 유전자 발현을 정량화하는 multiplexed high-throughput 유전자 발현 플랫폼의 사용을 설명합니다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 과민성 대장 증후군이 있거나 없는 피험자의 전혈에서 microRNA(miRNA) 발현을 정량화했습니다.

과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지

나노 크기의 PCR에 의한 DNA 및 RNA 기반 병원균 높은 처리량 테스트는 syndromic 개와 말 호흡기 PCR 패널을 사용하여 설명한다.

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

이 프로토콜은 클론 수준에서 유전자의 큰 어레이의 식을 평가하는 방법을 설명한다. 단일 셀 RT-qPCR에 샘플과 유전자의 수백에 대한 강한 감도와 신뢰성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

우리는 단일 포유류 세포를 분류하고 각 세포에서 최대 96개의 관심 대상 유전자의 발현을 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 방법에는 절대 전사체 수를 추정할 수 있도록 내부 qPCR 표준을 사용하는 것이 포함됩니다.

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

여기서, 정량적 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 기반 프로토콜은 지 단백질 입자의 천연 마이크로 RNA 함량 (절대/상대)의 결정을 위해 제시 된다. 또한, 마이크로 RNA 레벨을 증가 시키는 방법 뿐만 아니라, 지 단백질 입자의 세포 흡수 율을 결정 하는 방법이 입증 되어 있다.

마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

이 문서에서는 단일 또는 벌크 C. elegans 샘플에서 유전자 발현 수준의 빠르고 신뢰할 수 있는 측정을 위한 고처리량 프로토콜이 설명되어 있다. 이 프로토콜은 RNA 절연을 필요로하지 않으며 샘플에서 직접 cDNA를 생성합니다. 고처리량 멀티플렉션 나노유체 실시간 qPCR 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다.

단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

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