높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

이 절차의 전반적인 목적은 다중 정량적 R-T-P-C-R을 미세유체 플랫폼과 결합하여 최소한의 시작 물질로 효율적이고 저렴하게 마이크로 RNA 발현을 분석하는 것입니다. 먼저 추출된 RNA를 농축한 후, 다중 역전사와 다중 사전 증폭을 진행합니다. 다음 단계로 과잉 프라이머를 제거하기 위한 정제 과정을 거칩니다.

마지막으로, 마이크로유체 플랫폼을 사용하여 단일플렉스 micro RNA 발현을 분석합니다. 그 결과, 관심 샘플 전반에 걸쳐 정확하고 재현성이 높은 micro RNA 발현 수준을 얻을 수 있습니다. 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 pre-EMP 증폭 후 추가 정제 단계를 통해 멀티플렉스 Q-R-T-P-C-R 방법의 정확도와 재현성을 향상시킨다는 점입니다.

혈청에서 추출한 RNA로 시작합니다. TRIzol과 같이 균질화된 조직을 이용한 페놀 클로로포름 기반의 RNA 방법이나 RNA 정제 키트를 사용하여 추출하며, 모든 추출 후에는 세척 단계를 거쳐야 하고 모든 보관은 -80 °C에서 수행합니다. RNA 용액을 농축합니다.

혈청과 같이 샘플 양이 제한적인 경우, 먼저 MicroCon 샘플 저장조를 바이알에 삽입한 다음, 파이펫 팁이 멤브레인에 닿지 않도록 매우 주의하며 RNA 용액을 저장조에 파이펫팅합니다. 이제 바이알과 필터를 크랙 밴드가 로터를 향하도록 원심분리기에 배치하고 약 3시간 동안 원심분리를 수행합니다. 3시간 후, RNA가 멤브레인에 완전히 농축되어 RNA를 용출할 수 있게 됩니다.

원하는 양의 RNA-free water를 막(membrane)에 첨가하고, 저장조를 뒤집어 새로운 바이알에 넣습니다. 그 다음 4 °C에서 최대 3000 ×g로 3분 동안 원심분리합니다. 농축된 RNA는 필요할 때까지 -80 °C에서 보관합니다. xpl 역방향 stem-loop 프라이머를 사용하여 RNA로 RT 반응을 수행한 후, 12~18회의 PCR 사이클을 진행합니다. microRNA는 cDNA 가닥으로 나타납니다.

이를 pre PCR 산물이라고 합니다. 이어지는 QPCR을 위해, pre PCR 산물을 10% poly acrylamide gel 상에서 10 base paired DNA ladder와 함께 정제해야 합니다. 각 레인에 6x orange G 5.5 microliters와 pre PCR 산물 27.5 microliters의 혼합액을 로딩하십시오.

젤을 150 V에서 55~60분 동안 전기영동합니다. Romo phenol blue는 이 젤의 20 bp 영역에서 이동합니다. 전기영동이 끝나면, 빛에 노출되지 않도록 주의하며 셰이커 위에서 25분 동안 cyber gold로 염색합니다.

60에서 80 base pair 사이의 PCR 생성물 밴드를 절단하여 라벨이 부착된 튜브로 겔 블록을 옮깁니다. 생성물 농도가 낮으면 밴드가 보이지 않을 수 있으나, 생성물은 여전히 겔 내에 존재합니다. 이제 튜브-인-튜브(tube-in-tube) 원심분리를 사용하여 겔 밴드를 분쇄하고 300 microliters의 TEN buffer를 첨가합니다.

버퍼 겔 혼합물을 37 °C에서 4시간 동안 교반하며 배양하십시오. 4시간 후, 액체를 새 튜브로 옮기고 TEN 버퍼 300 µL를 추가로 첨가하십시오. 이 혼합물을 4 °C에서 교반하며 하룻밤 동안 배양하십시오.

다음 날, 튜브의 내용물을 다시 옮기고 pre PCR 생성물의 에탄올 침전 과정을 진행합니다. 칩을 패키지에서 꺼낸 후에는 24시간 이내에 프라이밍을 해야 하며, 프라이밍 후 60분 이내에 로딩해야 합니다. 칩의 각 어큐뮬레이터에 150 µL의 컨트롤 라인 액체를 주입하여 어레이 프라이밍을 시작합니다.

칩이나 입구에 액체가 묻지 않도록 주의하십시오. 액체가 묻으면 칩을 사용할 수 없게 됩니다. 그 다음 칩을 통합 유체 회로 또는 IFC 컨트롤러에 장착하고 컨트롤러의 프라이밍 스크립트를 실행하십시오. 프로그램이 시작되는 즉시 샘플 준비를 시작하십시오.

먼저 pres 샘플을 준비합니다. TaqMan, universal master mix 및 loading 시약을 혼합합니다. 그다음 96-well loading 포맷을 사용하여, 각 샘플 2.25 µL와 pres 샘플 믹스 2.75 µL를 혼합하여 로딩액을 수집합니다. 플레이트를 짧게 볼텍싱한 후 4 °C에서 빠르게 원심 분리합니다.

이제 샘플 플레이트 준비가 완료되었습니다. 새로운 96웰 플레이트를 사용하여 분석 혼합물을 13배 농도로 준비하십시오. 이는 각 웰에 유니버설 프라이머 1종, 정방향 프라이머 및 유전자 특이적 tac man 프로브를 혼합하여 수행합니다.

1X 농도는 공통 및 정방향 프라이머의 경우 1 µM이며, TacMan 프로브의 경우 0.2 µM입니다. 그다음, 최종 웰 부피 5 µL에서 Tween의 최종 농도가 0.25%가 되도록 충분한 양의 Tween을 추가합니다. 기포가 생기지 않도록 잘 섞어준 후, 플레이트를 짧게 원심분리하여 액체를 모읍니다.

이것은 분석 플레이트입니다. 칩을 로딩하여 96.96 Q-R-T-P-C-R을 시작하십시오. 먼저 샘플을 로딩한 다음, IFC의 각 입구당 최종 부피 5 µL가 되도록 분석 시약을 로딩하십시오.

둘째, load mix 스크립트를 실행하여 샘플과 어세이를 칩에 로드합니다. 스크립트가 종료되면 로드된 칩에서 보호 필름을 벗겨내고, 접착 테이프를 사용하여 칩 표면의 먼지 입자나 이물질을 제거합니다. 이제 바이오 시스템 증폭 프로그램을 설정합니다.

칩을 시스템에 장착하고 프로그램을 실행합니다. 결과는 fluid dime 소프트웨어로 분석하여 증폭 곡선, 전체 칩 히트맵 및 각 웰의 CT 값을 확인할 수 있습니다. native poly acrylamide 겔 상의 크기 분리로 정제된 pre PCR 산물인 야생형 DG CR eight 및 ER null 돌연변이를 사용합니다.

RNA는 이전 프로토콜과 비교하여 준비되었습니다. 정제 단계 덕분에 DGCR8 결핍 및 ER 결핍 배경 모두에서 더 많은 microRNA를 얻었으며 위양성 신호의 손실이 발생했습니다. 또한, 수정된 QR TPCR R 접근 방식을 통해 희귀한 D gcr eight 독립적 dicer 의존적 small RNA를 적절하게 분류할 수 있습니다.

본 연구에서는 환자 및 대조군으로부터 얻은 48개의 cera를 대상으로 384가지 서로 다른 microRNA의 발현 변화를 스크리닝하였습니다. 데이터는 대조군에서 spike-in을 사용하지 않고, 각 샘플에서 해당 중앙값을 빼는 방식으로 정규화하였습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 극소량의 RNA 입력물로 시작하더라도 flu line 플랫폼 기반의 multiplex Q-R-T-P-C-R을 사용하여 수많은 샘플에 걸쳐 수백 개의 micronase를 동시에 프로파일링하는 방법을 충분히 이해하실 수 있을 것입니다.