교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

이 절차의 전반적인 목표는 관심 영역에서 단백질의 frap을 측정하여 향상된 녹색 형광 단백질의 이동성을 결정하는 것입니다. 이것은 배양된 쥐 해마 뉴런에서 EGFP 벡터를 먼저 transection하여 수행됩니다. Next Fre 기록은 Zeiss seven 10 컨포칼 현미경을 사용하여 관심 척추에서 수행됩니다.

그런 다음 Image J와 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 광퇴색 속도를 계산할 수 있습니다. 궁극적으로, 공초점 현미경을 통해 배양된 해마 뉴런에서 척추 내 EGFP의 이동성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 Chazen이 저와 Ronald Pet, Ya, Wang Bahar Kisha, 그리고 2009년 10월에 사망한 원본 논문의 선임 저자인 Robert Ol과 공동으로 개발했습니다.

우리는 이 비디오를 그의 추모에 바칩니다. 이 방법은 관심 영역에서 관심 단백질의 회전율과 같은 단백질 역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. transfection을 시작하기 전에 clone tech Cal Foss 포유류 transfection kit를 사용하여 16-18일 동안 체외 transfection neuron을 poly de lysine coated mattec 35mm 유리 바닥 접시에 배양하여 배아 18일 쥐 해마 뉴런을 배양하여 이 절차를 시작합니다.

나중에 사용할 수 있도록 원래 배양 배지를 멸균 15ml 튜브에 보관하십시오. transfection 30분 전에 각 35mm 접시에 1.5ml의 DOL eco's modified eagle medium을 채웁니다. 다음으로, 10 마이크로 그램의 P-E-G-F-P-N 1 플라즈마 DNA를 12.4 마이크로 리터의 2 몰 칼슘 용액과 결합하고 멸균수로 총 부피를 최대 100 마이크로 리터까지 가져옵니다.

DNA 혼합물 DROPWISE를 100마이크로리터의 2 x 힙 완충 식염수에 추가합니다. 각 방울 후에 버퍼를 볼텍싱하는 것이 추가됩니다. 최종 혼합물을 실온에서 20분 동안 방치한 후 완충 DNA 용액을 DMEM 배양된 뉴런에 추가합니다.

섭씨 37도에서 1시간에서 1시간 30분 동안 뉴런을 배양합니다. 배양 후 배양 접시에서 인산칼슘 함유 배지를 제거하고 DMEM으로 세포를 세척합니다. DMEM 세척을 총 3회 반복합니다.

DMEM 배지를 incubator로 반환하기 전에 원래 배양 배지와 교환합니다. 뉴런은 형질주입 후 2-4일 후에 프랙 실험에 사용됩니다. 시작하려면 35mm 유리 바닥 접시의 배양 배지를 즉시 Prewarm Tyro 용액으로 교체하십시오.

프랙 실험에는 Zeiss LSM seven 10 컨포칼 현미경이 사용됩니다. Zeiss 온도 모듈 시스템은 작업 시스템의 온도, 습도 및 이산화탄소 비율을 유지합니다. 이산화탄소 탱크가 연결되어 있고 습도 균형을 맞추는 데 사용되는 물병에 물이 채워져 있는지 확인하십시오.

현미경이 설정되면 100 x 대물렌즈로 형질 주입된 성숙한 수상돌기를 찾습니다. 접시에 형질주입된 세포가 희박한 경우 40 x 대물렌즈로 원하는 세포를 검색합니다. 그런 다음 100 x 목표로 전환합니다.

이미지를 캡처하려면 5배 광학 줌과 2 56 x 2 56 픽셀 해상도를 사용합니다. 여러 개의 가시가 있는 짧은 수상돌기 조각을 이미지화합니다. 이미지를 캡처하려면 0.5초가 걸리는 공칭 속도 9를 사용합니다.

스캔을 완료하려면 핀홀을 2마이크로미터로 설정하여 강한 형광을 얻습니다. 이미지를 촬영할 때 전체 이미지가 광표백되는 것을 방지하기 위해 예를 들어 1에서 5%와 같이 낮은 레이저 투과율을 사용하십시오. 다음으로, 이 실험에 대한 관심 척추를 선택합니다.

척추 머리 직경이 약 1마이크로미터인 버섯 가시를 선택하여 랩 실험을 수행합니다. 표백 전에 5개의 제어 이미지를 촬영한 다음 공칭 100% 레이저 전송으로 관심 척추를 10회 표백하고 표백 직후 일련의 이미지를 캡처합니다. 시간 간격은 다른 표적 단백질과 다른 실험 설계에 따라 조정되어야 합니다.

이 실험에서는 표백 후 15초 동안 1초마다 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 데이터를 분석하기 위해 이미지를 저장합니다. Image J 소프트웨어를 사용하여 이미지를 열고 정렬 도구를 사용하여 이미지 스택을 정렬하여 관심 있는 척추가 뜨지 않고 동일한 위치에 유지되도록 합니다.

이미지에서 관심 척추의 상대적 형광 강도를 측정하는데, 이는 형질 주입되었지만 표백되지 않은 영역입니다. 이미지 J의 강도 대 시간 모니터 도구를 사용하여 타임랩스 이미지의 배경 영역을 측정합니다.GraphPad Prism 소프트웨어 또는 기타 유사한 소프트웨어에서 단상 지수 방정식을 사용하여 형광 강도에 맞는 배경 영역 곡선으로 비형광 영역을 사용합니다. 마지막으로, 형광의 이동성 및 부동성 비율(percent mobile and immotion fraction)을 계산합니다. 표시.

다음은 배양된 해마 뉴런의 척추에서 EGFP 형광의 프랙 측정입니다. 척추 컨트롤과 배경의 영역이 표시되고 빨간색 화살표는 사진 표백 시간을 나타냅니다. 동일한 영역의 사진은 사진 표백 전과 0 1, 5, 10 및 15초 후에 촬영되었습니다.

EGFP 형광의 FRA 곡선은 15초 동안 표시되며, 곡선의 점은 매초마다 FRA를 나타냅니다. 곡선은 단상 지수 방정식에 의해 피팅되었습니다. 광표백 전 평균 형광은 100%로 계산되었습니다.이 실험에서 모바일 분획은 87%이고 부동적인 분획은 13%A입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 FRAPPE 기술을 사용하여 GFP 태그가 지정된 단백질의 이동성을 측정하는 방법에 대해 잘 이해하게 되었습니다.