개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상
2011년 4월 6일
현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다. 생체내에서 분석이 방법으로 얻을 수 있습니다.
다음 실험의 목적은 제브라피시 배아의 타임 랩스 라이브 이미징을 통해 개별 전뇌, 신경 전구 세포의 생체 내 발달을 관찰하는 것입니다. 이는 드문드문 위치한 4개의 뇌 신경 전구 세포를 라벨링하는 형광 마커를 코딩하는 DNA 구조체의 전기천공법을 통해 달성됩니다. 전기천공된 배아는 마취되어 저융점 센서에 장착되고 타임랩스 컨포칼 현미경으로 이미지화됩니다.
결과는 특정 전뇌 신경 전구 세포의 생체 내 발달을 보여줍니다. 이 방법은 foin neuro progenic cell의 InVivo 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 막, 헤인 및 척수와 같은 중추 신경계의 다른 영역에도 적용할 수 있습니다.
이 방법 또는 단일 세포 단계 DNA 또는 RNA 주입과 같은 기존 방법의 주요 장점은 주어진 발달 시점에서 자기 이익을 정확하게 목표로 한다는 것입니다. 이 프로토콜은 계획된 전기천공법 전날부터 시작됩니다. 아침에 짝짓기를 한 얼룩말 물고기에서 50개의 수정 배아를 채취하여 페닐 트레아 또는 PTU를 함유한 배아 배지로 배아를 목욕시키고 다음 날 섭씨 28.5도에서 22시간 동안 침수된 배아를 배양합니다.
수정 후 22시간이 지나면 배아는 전기천공을 할 준비가 됩니다. 먼저 미세한 집게로 배아를 수동으로 코팅합니다. 코팅된 배아를 PTU가 포함된 10ml의 전기천공링 링거 용액으로 옮긴 다음 배아를 마취합니다.
420 마이크로 리터의 Trica 스톡에서 용액에 밀리리터 당 4 밀리그램의 농도로 저장하십시오. 배아는 이제 전기천공에 필요한 주삿바늘을 준비하기 위해 전기천공을 할 준비가 되었습니다. 유리 모세관을 당기고 집게로 끝을 부러뜨려 날카로운 0.2 낮은 융점을 만듭니다.
전기천공법 ringers에서 중단된 1% 해결책, 및 설치를 위한 배아 매체에 있는 0.8% 해결책을 포함하는 Agro 해결책은 또한 필요합니다. 두 개의 서로 다른 농업 용액을 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하고 약 섭씨 37도의 열 블록에 준비합니다. 이 프로토콜은 GAL four UAS 시스템을 사용하여 신경전구세포에서 유전자 발현을 촉진합니다.
2개의 플라스미드는 유비쿼터스로 GAL 4 ff를 발현할 때 사용되고, 다른 하나는 GAL 4 ff에 대한 반응으로 GFP를 발현할 때 사용됩니다. 두 플라스미드 모두 키트에 의해 제조된 것을 사용하기 위해 제조되며, 10 밀리몰 Tri cl의 용액에서 아세트산 나트륨 에탄올 침전을 사용하여 마이크로리터당 1 및 2 마이크로그램 사이로 농축합니다. 플라스미드 농도를 측정한 후, 두 플라스미드를 뉴클레아제가 없는 물이 있는 단일 용액으로 마이크로리터당 500나노그램으로 희석합니다.
이 농도에서, 그들은 용액의 전달을 시각화하기 위해 함께 평가되고 총 용액 부피의 10%에서 페놀 레드로 염색됩니다. 이제 용액을 전기천공할 준비가 되었으며 얼음 위에 올려 놓아야 합니다. electroporation rig는 최대 배율이 50배인 실체 해부 현미경으로 구성됩니다.
이 장비에는 공기 압력 주입기, 두 개의 미크론 매니퓰레이터 및 전기 자극기가 장착되어 있습니다. 왼쪽 마이크로 매니퓰레이터의 전극에는 전기천공법 직전에 맞춤형 백금 이리듐 병렬 바이폴라 전극이 있어 주사 바늘에 2마이크로리터의 DNA 용액을 다시 로드하고 주입량을 4나노리터로 조정합니다. 이 시점부터 프로토콜은 1%low melting point 농업 용액에서 두 개의 배아를 완벽하게 장착하고 담그고 즉시 제거하는 연습이 필요합니다.
유리 피펫을 사용하여 각각을 플랫폼의 자체 아그로스 방울 또는 물방울의 접시로 옮깁니다. 섬유 프로브를 사용하여 배아가 응고되기 전에 배아를 등쪽 위로 부드럽게 향하게 합니다. 이렇게 하면 전뇌가 전극과 미세주삿바늘 모두에 접근할 수 있습니다.
10개의 물방울이 모두 준비된 모든 배아와 함께 로드될 때까지 이 과정을 반복합니다. 전극을 에어로스에 삽입하고 미세주입 바늘을 전뇌실에 삽입합니다. 이제 4나노리터의 DNA 혼합물을 주입합니다.
흐름에 주목하고 심실이 부어오르는지 관찰합니다. 붓기가 관찰되자마자 각각 1밀리초씩 지속되는 4개의 27 0.5볼트 펄스 중 2개를 적용합니다. 이 4개의 펄스는 반대 극성으로 전달되어야 합니다.
그 결과 4개의 뇌 신경 전구 세포의 양측 모자이크 라벨링이 이루어집니다. 이제 전뇌에서 주삿바늘을 제거하고 단계를 다음 배아로 이동합니다. 남아 있는 각 배아에 대해 주입 및 전기천공 과정을 반복합니다.
10개의 배아가 모두 전기천공이 완료되면 배아에 5ml의 배아 배지를 붓고 배아를 이식합니다. 미세수술용 칼로 아로스를 껍질을 벗기고 30ml의 배아 배지가 들어 있는 신선한 접시로 옮깁니다. 이미징 전에 전기천공법 후 4시간인 약 4시간 동안 섭씨 28.5도에서 배아를 배양합니다.
EGFP 신호를 관찰할 수 있습니다. 전기천공법 후 1시간 또는 5시간 이내에 epi 형광 해부 현미경으로 관찰한 경우, 4개의 brainin 영역에서 모자이크가 높지만 EGFP 발현이 강한 배아를 선택합니다. 선택된 배아를 10ml의 배지로 옮기고 밀리리터당 4밀리그램의 농도로 420마이크로리터의 트리카 스톡을 첨가하여 마취합니다.
이미징은 직립 대물렌즈가 장착된 컨포칼 현미경의 온도 제어 스테이지에서 수행됩니다. 스테이지의 온도를 섭씨 28.5도로 설정하여 스코프를 준비했습니다. 또한 배아 배지를 섭씨 28.5도로 예열합니다.
배아를 장착하려면 유리 피펫을 사용하여 배아를 아로스에 잠시 담그고 35mm 유리 바닥 배양 접시의 중앙에 놓습니다. 섬유 프로브를 사용하여 배아가 응고되기 전에 배아를 등쪽 위쪽 위치로 부드럽게 향하게 하고 3ml의 예열된 배지로 덮습니다. 이제 배아는 하나의 신경 전구 세포의 타임 랩스 컨포칼 이미지인 물에 담그는 대물렌즈를 사용하여 고정 간격 타임 랩스 라이브 이미징을 수행할 준비가 되었습니다.
이 방법을 사용하면 이 세포가 수정 후 28.5시간에서 41.5시간 사이에 두 번 이동하고 분열하는 것을 관찰할 수 있습니다. 레이저 파워를 최소화하고 배아를 보충함으로써 수정 후 60시간 동안 배지 이미지를 계속 촬영할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유전적으로 표지된 비디오 신경 전구 세포에 대한 전기천공을 수행하는 방법과 전극 배아를 처리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
컨포칼 타임랩스 레벨 이미징의 경우, 마스터하면 이 전기천공법이 제대로 수행되면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.
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개요
이 동영상은 발달 중인 제브라피쉬 전뇌의 개별 신경 전구 세포의 생체 이미지를 얻기 위한 전기 세포융합법과 콘포컬 현미경을 결합한 방법을 보여줍니다. 이를 통해 클론 수준에서 전뇌 신경 전구 세포 발달의 생체 내 분석이 가능합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 신경과학
- 발달 생물학
- 영상 기술
배경
- 신경 전구 세포는 뇌 발달에 중요합니다.
- 생체 이미징 기술은 세포 과정에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 전기 세포융합법은 유전 물질의 표적 전달을 가능하게 합니다.
- 제브라피쉬는 척추동물 발달을 연구하기 위한 모델 유기체로 사용됩니다.
연구 목적
- 개별 전뇌 신경 전구 세포의 생체 내 발달을 관찰합니다.
- 동적 세포 관찰을 위해 타임랩스 이미징을 활용합니다.
- 이 방법의 다른 중추 신경계 영역에 대한 적용 가능성을 탐구합니다.
사용된 방법
- 형광 마커를 코딩하는 DNA 구조의 전기 세포융합법.
- 영상을 위한 타임랩스 콘포컬 현미경.
- 저 융점 아가로스에 장착된 마취된 배아의 사용.
- 특정 신경 전구 세포 발달의 분석.
주요 결과
- 생체 내 개별 신경 전구 세포의 성공적인 이미징.
- 시간에 따른 발달 과정의 시연.
- 신경 발달 메커니즘에 대한 잠재적 통찰력.
- 중추 신경계의 다른 영역에 이 방법을 적용할 수 있습니다.
결론
- 이 방법은 신경 전구 세포 발달에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 다른 신경 영역을 연구하기 위한 프레임워크를 제공합니다.
- 향후 응용은 신경 생물학의 다양한 측면으로 확장될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Time-lapse live imaging of clonally related neural progenitor cells enables mechanistic de-risking in early neuroscience target validation by providing quantitative, in vivo data on cellular dynamics. This approach supports predictive confidence in therapeutic hypothesis testing by linking genetic perturbations to observable developmental phenotypes in a disease-relevant system. The method enhances translational biomarker discovery and preclinical model fidelity through direct observation of division, migration, and differentiation events in intact tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct observation of neural progenitor cell behavior in vivo.
- Operational Value: Provides clonal resolution to de-risk target engagement and pathway modulation effects.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by correlating genetic manipulation with phenotypic outcomes in a vertebrate model.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible biological systems for compound screening in neurodevelopmental contexts.
- Quantitative Output: Delivers time-resolved metrics on migration, division, and differentiation for assay optimization.
- Scalability: Compatible with multi-embryo mounting and imaging for medium-throughput phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human forebrain development mechanisms in a vertebrate system with conserved neurogenic pathways.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by enabling longitudinal tracking of cellular phenotypes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical candidate selection through mechanistic insights into neurogenic processes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing dynamic, in vivo phenotypic readouts that inform early decision-making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via direct visualization of neural progenitor cell dynamics.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility through controlled electroporation and time-lapse imaging.
- Analytics: Generates quantitative measurements of cellular behavior that facilitate condition comparison and effect size determination.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling conserved mechanisms of forebrain development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across multiple central nervous system regions and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neurodevelopmental pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined electroporation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early biological de-risking and reducing late-stage failure in CNS programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, mechanism-linked phenotypic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, electroporation, and confocal microscopy.
- Dependent on specialized instrumentation including pressure injectors, micromanipulators, and temperature-controlled confocal systems.
- Necessitates cross-team standardization for embryo handling, DNA preparation, and imaging parameters.
- Involves adaptation considerations when extending to other CNS regions or disease models.
- Limited by embryo viability and phototoxicity constraints during extended time-lapse imaging.
