Name: 개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 배우세요 전기천공과 공초점 현미경을 이용하여 Danio rerio 전뇌 신경전구세포의 실시간 발달을 관찰하는 방법을. 이 기술은 중추신경계 다른 영역에도 적용 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 theNIH grantNS042626에 의해 지원되었다. 우리는 커트 손 및 이미징과 함께 도움을 UCSF 니콘 이미징 센터를 주셔서 감사합니다.

1. Zebrafish 태아의 준비 <ol><li> 이틀 electroporation 전에, 여성에서 남성으로 별도의 디바이더를 사용하여 야생 유형 물고기의 교배 새장을 설정합니다. </li><li> electroporation 전 어느 날, 전날의 새장을 짝짓기에 디바이더를 가져옵니다. </li><li> 배아를 수집하고 28.5에서 0.003 %의 phenylthiourea (PTU)를 포함하는 30 ML 배아 중간 ° C. 50 수정된 배아를 품어 </li><li> electroporation의 날, dechorionate 수동으로 배아는 22hpf의 발달 단계에 도달 벌금 포셉 (Inox 5 더몬트 전자, 스위스)와 배아. 다음 PTU 0.003 %를 포함 10ml electroporation 대타의 3 (180 MM NaCl, 5mM KCl, 1.8 MM CaCl2, 5 MM Hepes의 산도 7.2)로 배아를 전송합니다. </li><li> 링어이 배아를 마취 위하여 10ml의 electroporation을 420 μl tricaine 주식 (4mg/ml)를 추가합니다. </li></ol> 2. Electroporation 준비 <ol><li> 유리 사출 니들은 플라밍 - 브라운 P897 풀러 (셔터 인 스트 루먼트, 노바토, CA, 미국)에서 모세 혈관 (필라멘트와 1.2 mm OD, 0.9 mm ID가)에서 가져온되었습니다. 바늘 끝이 그림 1D와 같이 날카로운 끝을 얻으려면 포셉와 부러했다. 팁의 직경 10 μm의 주위해야하며 테이퍼 각도는 30도 근처에있을 것입니다. </li><li> 0.8 %을 준비하고 electroporation 대​​타의 솔루션에 1퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스 (셸턴 과학 주식 회사 카탈로그 # IB70050). 2 ML의 microcentrifuge 튜브에서 나누어지는 아가로 오스 솔루션입니다. ~ 37 ° C.에서 열 블록에 aliquots 보관 </li><li> Gal4/UAS 시스템 electroporated 태아의 신경 전구 세포의 유전자 발현을 유발하는 데 사용됩니다. 두 plasmids이 사용됩니다 : Gal4FF는 유비 쿼터스 모터의 EF1α에 의해 구동되는 플라스미드 EF1α - GFF - PT2KXIG, 그리고 플라스미드 UAS - E1B - EGFP - PT2KXIG합니다. </li><li> EF1α - GFF - PT2KXIG 및 GenEluteTM HP 플라스미드 Midiprep 키트 (시그마)를 사용하여 UAS - E1B - EGFP - PT2KXIG 플라스미드 DNA를 준비합니다. </li><li> plasmids은 다음 10 MM 트리스 · Club 호텔에서 1-2 μg / μl의 최종 농도 (PH 8.5)에 아세트산 나트륨 / 에탄올 침전에 의해 집중되고있다. </li><li> 두 plasmids를 섞어 각 플라스미드 500 NG / μl의 최종 농도 nuclease 무료 H2O로 희석. 솔루션에 페놀 레드 (10분의 1 총 볼륨을 희석)의 추가는 전달의 시각화를 선호합니다. 얼음의 DNA 솔루션을 유지. </li><li> 오른쪽 2 μl DNA 솔루션과 electroporation, backload 주사 바늘 이전 2 선배님은 사출 볼륨을 조정합니다. </li></ol> 3. Electroporation <ol><li> stero의 해부 현미경 (50x 최대 배율로 자이스 혈구 Stemi 2000), 공기 압력 주입기 (Narishige IM 300 microinjector) 두 micromanipulators (WPI M3301R, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, 미국), 그리고 전기 자극기 (SD9 그림 1A와 같이 사각형 펄스 자극기, 그라스 Tlefactor, 웨스트 워릭,로드 아일랜드, 미국)이 설정됩니다. </li><li> 1퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스의 배아, 잠그다이 배아를 마운트하려면 다음과 같이하십시오. 그런 다음 즉시 유리 피펫으로 아가로 오스의 배아를 제거합니다. </li><li> 아가로 오스의 개별 방울에 거꾸로 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑에있는 배아를 놓습니다. 아가로 오스 너무 forebrain은 전극과 microinjection 니들 (그림 1B) 모두에 액세스할 수 굳은 전에 등의 접속 위치로 광섬유 프로브와 함께 부드럽게 배아를 동쪽을 향하게하다. 배아는 개인 아가로 오스 방울에 마운트해야합니다. </li><li> 왼쪽 micromanipulator로 전극을 조작. 그림 1B와 같이 아가로 오스에 전극을 삽입합니다. 사용자 플래티넘 이리듐 병렬 바이폴라 전극 직경 및 간격 500 μm의 125 μm의 간격은 electroporation (FHC, 카탈로그 # PBSA0575)에 사용됩니다. </li><li> 붉은 유체의 흐르는 및 뇌실의 팽창 관찰 될 수 있듯이, forebrain의 뇌실에 microinjection 바늘을 삽입하고 4nl DNA 믹스를 주입. </li><li> 바로 하나의 28.5 V 펄스 지속적인 1 밀리초는 수동으로 적용되었다. 다음 극성을 반대로 하나 이상 28.5 V 펄스 지속 1 밀리초를 적용합니다. 이것은 forebrain 신경 전구 세포의 양자 모자이크 라벨집니다. </li><li> 10 배아의 electroporation 후 배아를 공개 microsurgical 나이프로 배아를 커버하고 아가로 오스 껍질에 5ml 배아 매체를 추가하십시오. </li><li> 28.5에서 0.003 % PTU와 부화를 포함한 30 ML 배아 매체의 신선한 요리 ° C.에 electroporated 배아를 전송 </li></ol> 4. 장착 및 시간 경과 라이브 영상 <ol><li> epifluorescent 해부 현미경으로 볼 경우에는 electroporation 후 4시간 주변, EGFP 신호가 관찰됩니다. </li><li> 다섯 시간 electroporation 후 높은 모자이크하지만 forebrain 지역에서 강한 EGFP 표현으로 배아를 선택합니다. </li><li> 0.003 %의 PTU를 포함 10ml 배아 매체로 선택한 배아를 전송합니다. </li><li> 10ml 배아 매체 t에 420 μl tricaine 주식 (4mg/ml)를 추가O는 배아를 마취. </li><li> 배아를 탑재하기 위해 0.8 % 낮은 용융 점 아가로 오스 1 배아 젖어. 그런 다음 즉시 유리 피펫으로 아가로 오스의 배아를 제거하고 35mm 유리 바닥 문화 요리의 중심지 (MatTek 법인, 파트 # P35GC - 1.5-10 - C에 배아를 장소 <a href="http://www.glass-bottom-dishes.com/">www.glass - 하단 dishes.com</a> ) . </li><li> 아가로 오스는 굳은 전에 등의 접속 위치로 광섬유 프로브와 함께 부드럽게 배아를 동쪽을 향하게하다. </li><li> 그림 1C (우리가 오른쪽 목표와 니콘 C1 스펙트럼 공촛점 현미경을 사용하여)에 같이 공촛점 현미경의 온도 조절 무대에서 제대로 요리를 놓습니다. 28.5로 온도를 조절 ° C. </li><li> 3ml 28.5 추가 ° C 배아를 커버하는 PTU 0.003 %를 포함하는 preheated 배아 중간. 배아는 이제 이미지 준비가되었습니다. </li><li> 물이 마른 목표를 사용하여 고정 간격으로 시간이 경과 라이브 영상을 수행합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 그림 2에 표시된 22 HPF에서 EF1α - GFF + UAS - E1B - EGFP의 electroporated 배의 시간이 경과 공촛점 라이브 영상의 프레임을 선택하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 장치 셋업. (A) electroporation 설비의 조립 : 그라스 SD9 광장 펄스 자극기 (I), 왼쪽 micromanipulator (2), 전극 (3), 자이스 혈구가 현미경을 해부 (IV), 사출 바늘 (V)가, 오른쪽 micromanipulator (VI)과 Narishige IM 300 microinjector (VII). (B) 전극은 (i), forebrain 뇌실 (II) 및 사출 바늘 (3)의 상대 위치. 붉은 색의 DNA 솔루션 forebrain의 뇌실로 주입되어 있습니다. (C) 니콘 C1 공촛점 현미경에 살고 이미지의 조립 : 온도 컨트롤러 (I), 객관적인 렌 (2)와 유리 바닥 문화 요리 (3) (D에서 낮은 용해 지점 아가로 오스에 포함된 electroporated 배아 디핑 물 의 DNA microinjection에 뽑아 및 절단 바늘의) 이미지. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 22 HPF에서 EF1α - GFF + UAS - E1B - EGFP와 electroporated 배아의 18 시간 시간이 경과 공촛점 라이브 이미지의 선택된 프레임. 뇌실의 표면은 각각의 이미지 프레임의 하단 측면에 있습니다. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다.

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li>
<li>G#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish%3A+a+new+tool+to+study+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 비디오에서는, 우리는 개발 zebrafish의 forebrain에서 clonal 수준에서 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상에 대한 방법을 보여줍니다. 우리는 유전자와 찬란 라벨 개별 신경 전구 세포에 테스트 기존의 electroporation 프로토콜에게 4-6을 수정했습니다. 단 몇 세포가 띄엄띄엄 electroporation의 상대적인 낮은 전압으로 표시 이후 clonally 관련 자손 세포로 구성된 혈통의 나무가 설정할 수 있습니다. EGFP뿐만 아니라, 신경 전구 세포 subcellularly 단순히 다른 형광 마커와 EGFP를 대체하여 다양한 형광 단백질이 표시하실 수 있습니다. EF1α - GFF는 UAS - E1B - memberane - EGFP와 UAS - E1B - H2B - mRFP 공동 electroporated있다면 핵은 적색 형광 단백질이 표시됩니다 반면 예를 들어, 각각의 전구 세포의 세포막은 녹색 형광 단백질이 표시됩니다. 라이브 영상 중에 관찰 electroporat...

개발 zebrafish forebrain에 clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

분할, 마이 그 레이션 및 신경 전구 세포의 분화의 정확한 패턴을 적절한 두뇌 개발과 기능 1,2에 중요한 있습니다. 생체내 환경에서 복잡한에서 신경 전구 세포의 동작을 이해하기 위해서는 두뇌에 손상 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상이 매우 필요합니다. 이 비디오에서는, 우리는 생체내에 forebrain 신경 전구 세포의 발전을 시각화하는 zebrafish 배아의 고유한 기능을 이용. 우리는 유전자 및 띄엄띄엄 라벨 개별 신경 전구 세포에 electroporation을 사용합니다. 간단히, DNA가 형광 표식에 대한 코딩 구조 22 시간 게시물 수정 (HPF) zebrafish 배아의 전기 펄스가 즉시 배달되었고,의 forebrain의 뇌실로 주입했다. 여섯 시간 후, electroporated zebrafish의 배아는 유리 바닥 문화 요리 낮은 용융 점 아가로 오스와 함께 장착했다. 찬란 표시 신경 전구 세포는 다음 물 수영 객관적인 렌즈를 사용하여 공촛점 현미경 고정 간격 36시간 위해 몇 군데 있었다. 현재의 방법은 forebrain 신경 전구 세포의 생체내 개발에 대한 통찰력을 얻을 수있는 방법을 제공하고 zebrafish 배아의 중추 신경 시스템의 다른 부분에 적용할 수 있습니다.

현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다.<em&gt; 생체내에서</emclonal 수준 forebrain 신경 전구 세포의 개발&gt; 분석이 방법으로 얻을 수 있습니다.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

신경 전구 세포의 정밀한 분열, 이동 및 분화 패턴은 뇌의 적절한 발달과 기능에 결정적인 역할을 합니다1,2. ...

다음 실험의 목적은 제브라피쉬 배아의 타임랩스 라이브 이미징을 통해 개별 전뇌 신경 전구세포의 생체 내 발달 과정을 관찰하는 것입니다. 이는 드문드문 위치한 전뇌 신경 전구세포를 표지하는 형광 마커 코딩 DNA 컨스트럭트를 전기천공법으로 도입함으로써 수행됩니다. 전기천공된 배아는 저융점 아가로즈에 고정하여 마취시킨 후, 타임랩스 공초점 현미경으로 이미징합니다.결과는 특정 전뇌 신경 전구 세포의 in vivo 발달 과정을 보여줍니다. 이 방법은 전뇌 신경 전구 세포의 in vivo 발달에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 막, 뇌 및 척수와 같은 중추 신경계의 다른 영역에도 적용될 수 있습니다.이 방법의 주요 장점은 단일 세포 단계의 DNA 또는 RNA 주입과 같은 기존 방법과 달리, 특정 발달 시점에 맞추어 정밀하게 표적화할 수 있다는 것입니다. 본 프로토콜은 계획된 전기천공 전날부터 시작합니다. 아침에 교배된 제브라피쉬로부터 수정란 50개를 수집합니다. 수정란을 phenylthiourea(PTU)가 함유된 배아 배지에 담그고, 다음 날까지 28.5 °C에서 22시간 동안 배양합니다.수정 후 22시간이 지나면 배아를 전기천공할 준비가 됩니다. 먼저 미세 핀셋을 사용하여 배아를 수동으로 코팅합니다. 코팅된 배아를 PTU가 함유된 10 milliliters의 전기천공 링거 용액으로 옮겨 배아를 마취시킵니다.4 mg/mL 농도의 Trica 스톡 420 µL를 용액에 첨가합니다. 이제 배아를 전기천공할 준비가 되었으며, 전기천공에 필요한 주입 바늘을 준비합니다. 유리 모세관을 당겨 뽑은 후 핀셋으로 끝부분을 깨뜨려 날카로운 0.2 저융점 상태로 만듭니다.전기천공용 링거액(electroporation ringers)에 현탁한 1% 용액과 마운팅을 위한 배아 배지(embryonic medium) 내 0.8% 용액을 포함한 Agro 솔루션도 필요합니다. 두 가지 서로 다른 Agro 솔루션을 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주하고 약 37°C의 히팅 블록에서 준비해 둡니다. 본 프로토콜은 신경 전구 세포에서 유전자 발현을 유도하기 위해 GAL4 UAS 시스템을 사용합니다.GAL4-ff를 보편적으로 발현하는 플라스미드와 GAL4-ff에 반응하여 GFP를 발현하는 플라스미드, 이렇게 두 종류의 플라스미드가 사용됩니다. 두 플라스미드 모두 키트를 사용하여 준비하며, 10 mM Tris-HCl 용액 내에서 아세트산 나트륨-에탄올 침전법을 사용하여 1~2 µg/µL 농도로 농축합니다. 플라스미드 농도를 확인한 후, nuclease-free water를 사용하여 두 플라스미드를 500 ng/µL 농도의 단일 용액으로 희석합니다.이 농도에서 솔루션의 전달 과정을 시각화하기 위해 함께 정격 측정하며, 전체 솔루션 부피의 10% 농도로 phenol red를 사용하여 염색합니다. 이제 솔루션은 전기천공법(electroporation) 준비가 완료되었으며 얼음 위에 놓아야 합니다. 전기천공 장치는 최대 배율 50 x의 실체 해부 현미경으로 구성됩니다.해당 장치는 공기압 주입기, 2개의 마이크로 조작기 및 전기 자극기로 구성되어 있습니다. 왼쪽 마이크로 조작기에 부착된 전극은 맞춤형 백금-이리듐 병렬 양극 전극입니다. 전기천공법을 수행하기 직전에 주입 바늘에 2 µL의 DNA 용액을 역충전하고 주입량을 4 nL로 조정하십시오. 이 단계부터는 숙달을 위한 연습이 필요합니다. 고정 및 침지를 위해 1% 저융점 아가로스 용액에서 배아 2개를 즉시 꺼내십시오.유리 피펫을 사용하여 각각을 플랫폼이나 디쉬 위의 개별 agro 방울로 옮깁니다. agro가 응고되기 전에 파이버 프로브를 사용하여 배아를 등쪽이 위로 향하도록 조심스럽게 방향을 잡습니다. 이렇게 하면 전뇌에 전극과 미세주입 바늘이 모두 접근할 수 있게 됩니다.준비된 모든 배아를 10개의 액적에 모두 로드할 때까지 이 과정을 반복하십시오. 전극을 에어로(aeros)에 삽입하고 미세주입 바늘을 전뇌 뇌실에 삽입하십시오. 이제 4 nL의 DNA 혼합액을 주입하십시오.흐름을 관찰하고 심실의 팽창 여부를 확인하십시오. 팽창이 관찰되는 즉시, 각각 1ms 동안 지속되는 0.5V 펄스를 4회 가합니다. 이 4개의 펄스는 서로 반대 극성으로 인가되어야 합니다.그 결과 4개의 뇌 신경 전구세포가 양측성 모자이크 방식으로 표지됩니다. 이제 전뇌에서 주사 바늘을 제거하고 스테이지를 다음 배아로 이동시키십시오. 남은 각 배아에 대해 주사와 전기천공 과정을 반복하십시오.10개의 배아 모두에 대해 전기천공을 완료한 후, 배아를 옮기기 위해 배아 배지 5 mL를 배아 위에 붓습니다. 미세 수술 칼을 사용하여 아로스(aros)를 떼어내고 30 mL의 배아 배지가 담긴 새 디쉬로 옮깁니다. 이미징 전에 배아를 28.5 °C에서 약 4시간 동안 배양하며, 이는 전기천공 후 4시간이 지난 시점입니다.EGFP 신호를 관찰할 수 있습니다. 전기천공법 시행 후 1시간 또는 5시간 뒤에 에피 형광 해부현미경으로 관찰하여, 4개 brainin 영역에서 강한 EGFP 발현을 보이되 모자이크 양상이 뚜렷한 배아를 선택합니다. 선택한 배아를 10 mL의 배지로 옮기고, 4 mg/mL 농도의 trica 스톡 420 µL를 첨가하여 마취시킵니다.이미징은 정립 렌즈(upright objectives)가 장착된 공초점 현미경의 온도 조절 스테이지에서 수행합니다. 스테이지 온도를 28.5 °C로 설정하여 현미경을 준비합니다. 또한 배아 배지를 28.5 °C로 예열합니다.배아를 고정하려면 유리 피펫을 사용하여 배아를 agarose에 잠시 담근 후 35 millimeter 유리 바닥 배양 접시의 중앙에 배치하십시오. fiber probe를 사용하여 agarose가 굳기 전에 배아를 등쪽이 위로 향하도록 조심스럽게 방향을 잡고, 미리 가열된 배지 3 milliliters로 덮어줍니다. 이제 배아는 water dipping 대물렌즈를 이용한 고정 간격 타임랩스 라이브 이미징을 위한 준비가 되었습니다. 여기에 제시된 것은 하나의 신경 전구 세포를 촬영한 타임랩스 공초점 이미지입니다.이 방법을 사용하여, 우리는 수정 후 28.5시간에서 41.5시간 사이에 이 세포가 이동하고 두 번 분열하는 것을 관찰할 수 있습니다. 레이저 출력을 최소화하고 배아를 보충함으로써, 수정 후 최대 60시간까지 배양액 이미지를 계속 촬영할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 유전적으로 표지된 비디오 신경 전구 세포에 전기천공법을 수행하는 방법과 전기천공 처리된 배아를 다루는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.공초점 타임랩스(TimeLapse) 레벨 이미징을 위해, 숙련된다면 이 전기천공법은 적절히 수행될 경우 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.

time-lapse-live-imaging-clonally-related-neural-progenitor-cells

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

이 비디오에서는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 대한 기술이 제공됩니다. 시간 저속 영상은 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 데...

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

출처: Williams, A. L., et al. 실시간 발달을 시각화하기 위한 다광자 타임랩스 이미징: 제브라피시 배아에서 이동하는 신경 능선 세포의 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 제브라피시 배아의 신경능선 세포의 이동을 고해상도로 실시간으로 시각화하기 위한 다광자 타임 랩스 이미징 프로토콜을 보여줍니다.

다광자 타임랩스 이미징을 사용한 제브라피시 배아의 신경능선세포 이동 시각화

시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

여기에서는 성인 제브라피쉬의 등쪽 전뇌에서 이광자 칼슘 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

행동하는 성인 제브라피쉬의 전뇌 활동에 대한 Two-Photon Calcium Imaging

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

배우세요 전기천공과 공초점 현미경을 이용하여 Danio rerio 전뇌 신경전구세포의 실시간 발달을 관찰하는 방법을. 이 기술은 중추신경계 다른 영역에도 적용 가능합니다.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

더 많은 동영상 탐색