Name: 운동 유발성 Apoptosis 림프구의 결정을위한 손가락 - 스틱 혈액 샘플링 방법론 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: 배우세요 운동 유발성 림프구 apoptosis 측정을 위한 손가락 채혈법. 유세포 분석을 활용한 신속한 혈액 처리 기법으로 면역세포 사멸 연구의 정확성을 향상시킵니다.

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이 연구는 웨스턴 켄터키 대학에서 학부 장학금위원회에서 새로운 교수 부여에 의해 지원되었다.

1. 손가락 - 스틱 혈액 샘플링 <ol><li> 전체 혈액의 컬렉션은 일반적으로의 정지 다음 (일반적으로 1~3시간에서 동안 기준 측정 (보통 10-15 분 앉아 휴식을 다음) 또는 즉시 운동 시합에 따라, 그리고 사후 운동 기간 동안 휴식을 취해 운동). </li><li> 유니버설주의를 사용하면, 먼저 70% 이소 프로필 알코올로 손가락을 소독. </li><li> 다음 찔린 자동 첨두 또는 유사한 장치를 사용하여 사이트입니다. 우리가 주제 편안함을 제공하는 30 게이지 랜싯를 사용하지만, 더 큰 게이지 주사 바늘을 이용 할 수 있습니다. </li><li> 혈액의 첫 번째 드롭을 닦아 후 응고 방지하기 위해 리튬 헤파린 취급 모세관 튜브 또는 microvettes에 혈액을 수집합니다. </li></ol> 2. 세포 Phenotyping 및 Apoptosis의 스테 이닝 <ol><li> 250 μL 바인딩 버퍼에 titred 항체 패널 (표 1 배선도 참조) 10 μL heparinized 전체 혈액을 추가합니다. 우리는 성공을 1시 20분 희석 계수를 사용해야하지만, 각각의 실험실이 최고의 작업 솔루션을 결정하기 위해 시약을 titre해야합니다. 백혈구 집합에서 운동 유발성 apoptosis의 결정에 대해 표 1. 항체 패널. 늦은 apoptosis가 Annexin V 7 - AAD 더블 긍정적인 상표에 의해 정의된 동안 조기 apoptosis는 Annexin V의 표현에 의해 정의되었다. 괴사 세포가 V - 7 - AAD + 세포에만 Annexin했다. <table border="1"><tbody><tr><td> 튜브 1 </td><td> 튜브 2 </td><td> 관 세 </td><td> 튜브 사 </td></tr><tr><td> 세포는 관 </td><td> Annexin V - FITC </td><td> Annexin V - FITC </td><td> Annexin V - FITC </td></tr><tr><td></td><td> 안티 인간 CD4 - PE </td><td> 안티 인간 CD8 - PE </td><td> 안티 인간 CD19 - PE </td></tr><tr><td></td><td> 7 - AAD </td><td> 7 - AAD </td><td> 7 - AAD </td></tr><tr><td></td><td> 안티 인간 CD45RA - APC </td><td> 안티 인간 CD45RA - APC </td><td></td></tr></tbody></table> 7 - AAD = 7 - 아미노 actinomycin D, APC = Allophycocyanin, CD4 = 도우미 T의 lymphocytes, CD8 = 세포 독성 / 억제 T의 lymphocytes, CD19 = B lymphocytes, CD45RA = 순진한 세포 하위 집합, FITC = 플루오레신 isothiocyanate, PE = Phycoerythrin. </li><li> 30 분 어두운 실온에서 알을 품다. </li><li> 50~10분 위해 1075 XG에 원심 분리기. </li><li> 가만히 따르다가 300 μL 적혈구 세포 용해 완충액을 추가하고, 철저히 소용돌이. </li><li> 15 분 동안 상온에서 알을 품다. </li><li> RBC의 용해 반응을 중지 300 μL PBS를 추가합니다. </li><li> 50~10분 위해 1075 XG에 원심 분리기. </li><li> 가만히 따르다, 랙, 50 μL 구속력 버퍼를 추가합니다. </li><li> 유동세포계측법으로 분석합니다. </li></ol> 전용 튜브 배경 autofluorescence를 감지에 부정적인 제어 역할을하는 세포를, 그리고 각 개별가 포함된 튜브의 흐름 cytometer의 설정 초기 때 보상을 설정 fluorochrome : 이것은 최소한 다음과 같은 컨트롤을 활용하는 것이 좋습니다. 또한, 우리는 실험을 설정 성공적으로 보상 기준 비즈를 사용합니다.

<ol><li>Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+does+not+contribute+to+the+blood+lymphocytopenia+observed+after+intensive+and+downhill+treadmill+running+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Res.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans.</a> Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).</li>
<li>Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise%2C+lymphocyte+apoptosis+and+F2-isoprostanes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).</li>
<li>Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+apoptosis+after+exhaustive+and+moderate+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise.</a> J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).</li>
<li>Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise+does+not+cause+lymphocyte+DNA+damage+or+increased+apoptosis+in+well-trained+endurance+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).</li>
<li>Wang, J. -S., Huang, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+intensity+on+lymphocyte+apoptosis+induced+by+oxidative+stress+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+apoptosis+of+lymphocytes+depends+on+training+status%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).</li>
<li>Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+treatment+influences+the+yield+of+apoptotic+lymphocytes+after+maximal+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

법으로서 샘플 수집 과정 및 후속 분석 운동 유발성 apoptosis 림프구의 조기 늦게 두 단계의 분석에 대한 증명입니다. 그것은 명확하게 괴사 및 apoptotic되지 않은 그 세포를 제외하는 것도 가능합니다. 이 절차 동안, 이전에 여러 시간 지점에서 antecubital 지역에서 침략 venipuncture와 관련된 단점과 불편을 극복하고, 즉시 운동 후 또는 운동 시합 기간 동안 카테터를 확보. 조사의 측면에서, 이러한 절차는 일반적으로 모든 개인이 가지고 정맥 절개, 전문 교육을 필요로합니다. 하나가 존재하는 경우뿐만 아니라, 주제 모집 및 유지이 절차를 사용하여 향상된 것으로 예상된다는, 따라서 큰 영향을 찾을 가능성 통계 능력을 증가. venipuncture 혈액 샘플링을 채용 이전 조사는 전체 lymphocytes을위한 휴식 및 사후 운동 가치를보고있다. annexin V, 심슨 외 있습니다. 활용하면 휴식을 약 1.2 % apoptotic l...

<table><tbody><tr><td>유세포 분석 결합 완충액</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>채혈기</td><td>Accu Check Soft Touch</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>모세관</td><td>헤파린 처리 모세관</td><td>Chase Scientific Glass, Inc.</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>GmC Lab</td><td>Gilson, Inc.</td><td>PMS-880</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC 접합체</td><td></td><td>Biovision Inc.</td><td>K201-400-1</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PE 접합체</td><td>Anti-human, clone RPA-T4</td><td>eBioscience</td><td>12-0049-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8-PE 접합체</td><td>Anti-human, clone OKT8</td><td>eBioscience</td><td>12-0086-73</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE 접합체</td><td>Anti-human, clone HIB19</td><td>eBioscience</td><td>12-0199-42</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD 생존능 염색 용액</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-6993-50</td><td></td></tr><tr><td>CD45RA-APC 접합체</td><td>Anti-human, clone HI100</td><td>eBioscience</td><td>17-0458-42</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>C6</td><td>Accuri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

운동 유발성 apoptosis 림프구의 결정을위한 손가락 - 스틱 혈액 샘플링 방법론

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

운동은 면역 세포의 apoptosis를 유도하는 수있는 생리적 자극이다. 지금까지 다양한 제한은 특히 이전에 세포 죽음의 평가에 혈액 샘플을 분리하고 치료하는 데 필요한 시간의 양을에 관한,이 현상의 측정과 확인되었습니다. 이 때문에 면역 세포 apoptosis에보고 증가가 시스템에 대한 운동의 실질적인 효과에 기여하거나, 결국이 측정을 얻기 위해 필요한 시간과 처리를 반영 아르 될 수 있는지 여부를 확인하기가 어렵습니다. 이 문서에서 우리는 운동 유발성 apoptosis 림프구의 분석을위한 신속하고 법으로서 절차를 보여줍니다. 다른 기법과는 달리, 전체 혈액 샘플을 취득 즉시 항체 패널에 추가됩니다. 잠복기에 따라, 적혈구는 lysed 및 샘플 분석 준비입니다. 손가락 - 스틱 샘플링 절차의 사용은 필요한 혈액의 볼륨을 감소하고, 주제에 대한 불편을 최소화합니다.

운동은 면역 세포의 apoptosis를 유도 할 수있다. 다양한 측정 한계는 특히 사전 심사에 혈액 샘플을 분리하고 치료하는 데 필요한 시간의 양을 관련된있다. 보여주는 운동 유발성 림프구의 apoptosis의 분석을위한 신속하고 법으로서 절차입니다.

운동 유발성 Apoptosis 림프구의 결정을위한 손가락 - 스틱 혈액 샘플링 방법론

운동은 면역 세포에서 세포 사멸(apoptosis)을 유도할 수 있는 생리적 자극입니다. 현재까지 ...의 측정과 관련하여 다양한 한계점이 확인되었습니다.

안녕하세요, Western Kentucky University Kinesiology Recreation and Sport 학과 운동 과학 프로그램의 James Volta입니다. 이번 영상에서는 저희가 개발하여 사용하고 있는 운동 유도 림프구 세포 사멸(lymphocyte apoptosis) 측정 절차를 보여드리겠습니다. 그럼 함께 살펴보시죠.표준 주의 지침에 따라 손가락 끝에서 혈액 샘플을 채취합니다. 손가락 끝을 멸균한 후 천자합니다. 첫 번째 혈액 방울은 닦아내고, 이후 혈액을 모세관 또는 마이크로 베드로 흡입하여 채취합니다.유세포 분석용 항체 패널(Annexin V, 7-AAD, CD4, CD8 또는 CD19, 그리고 CD45 RA를 포함한 적절한 형광체 및 스탠딩 버퍼 포함)에 전혈 10 µL를 피펫으로 분주하며, 세포만 포함된 튜브를 추가로 준비합니다. 실험 설정을 돕기 위해 컨트롤로서 보정 비드(compensation beads)를 사용하였습니다. 샘플을 볼텍스(vortex)로 충분히 혼합한 후, 실온의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 샘플을 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 한 번의 매끄러운 동작으로 제거합니다.300 µL의 적혈구 용해 버퍼를 첨가하고 샘플을 충분히 볼텍싱합니다. 샘플과 용해 버퍼가 완전히 혼합되는 것이 매우 중요합니다. 적혈구를 최대한 제거하기 위해, 샘플이 탁해지기 시작하는 것을 확인할 수 있습니다.실온에서 최소 15분 동안 배양하면 적혈구가 용해되어 투명해집니다. 그러면 용해 반응을 중단시키기 위해 정지 용액으로 작용하는 300 microliters의 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)를 첨가합니다. 그 후 샘플을 다시 10분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 과정이 끝나면 튜브 바닥에 세포 펠렛(pelle)이 형성되는데, 이를 한 번의 매끄러운 동작으로 따라내고, 볼텍스(vortex)를 충분히 가해 세포와 용액을 재현탁하십시오.이제 샘플을 유세포 분석기로 분석할 준비가 되었습니다. 여기 림프구 하위 분획으로 게이팅된 대표적인 전방 및 측방 산란도를 보여주며, 해당 하위 집단 내의 annexin V 양성 세포를 식별합니다. 지금까지 운동 유발 림프구 세포사멸을 측정하기 위해 사용한 방법론을 설명드렸으며, 이 방법론을 통해 활용할 수 있는 추가적인 응용 분야가 많을 것으로 생각합니다.이 방법은 림프구 및 림프구 하위 분획 외의 모든 유형의 백혈구를 관찰하는 데 실제로 사용할 수 있습니다. 또한 세포 외부에 존재하는 모든 마커를 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 따라서 우리는 이것이 더 광범위하게 응용될 수 있다고 생각합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

셀 - 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

이 동영상은 항체를 분비하는 B 세포(ASC)의 기능을 평가하기 위해 ELISpot 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다. ASC에 의해 분비된 항체는 효소 접합 IgG 또는 IgM 항체에 의해 검출되는 막 결합 다클론 항체 단편과 상호 작용합니다. 각 웰에서 생성된 착색된 반점은 특정 항체의 동형이 존재함을 나타내며, 이는 B 세포의 분비 활동과 관련이 있습니다.

ELISpot Assay를 사용한 항체 분비 B 세포의 기능 평가

이 비디오는 유형이 불가능한 헤모필루스 인플루엔자(NTHi)를 통해 림프구를 자극하고 면역 반응을 평가하는 체외 기술을 보여줍니다. NTHi와 함께 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 배양하면 박테리아 세포가 T 림프구를 자극하여 사이토카인 생성을 유도합니다. 사이토카인의 분비를 억제하면 면역형광 염색을 수행하여 자극된 T 림프구에 축적된 세포 내 사이토카인을 검출합니다.

병원성 박테리아를 통해 림프구를 자극하는 체외 기술

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최적화 된 프로토콜은 림프구에 해당 작용과 미토콘드리아 호흡을 분석하는

여기 우리는 높은 강도 간격 훈련 기간 동안 antecubital 정 맥에서 혈액 샘플을 몇 가지를 얻기 위해 프로토콜을 제시. 이 프로토콜 혈액 대사 산물의 측정에 유용 수 있습니다 하 고 동안 endocrinal 마커 운동.

Antecubital 정 맥 도관 법에 의해 높은 강도 운동 중 혈액 젖 산 염과 플라스마 인슐린의 평가

생리 및 생물 학적 반응에 운동 강도의 영향을 평가 하기 위해 두 개의 서로 다른 운동 테스트 프로토콜 활용 했다. 방법 운동 주기 측에 증분 극대 산소 소비 테스트 및 지구력 테스트 개요, 정상 상태 submaximal 지구력 테스트 설명 합니다.

최대한 하 고 Submaximal 지구력 운동 인간에서 급성 운동 생리 및 생물학 응답을 측정 하기 위해 테스트를 실시

배우세요 운동 유발성 림프구 apoptosis 측정을 위한 손가락 채혈법. 유세포 분석을 활용한 신속한 혈액 처리 기법으로 면역세포 사멸 연구의 정확성을 향상시킵니다.

운동 유발성 Apoptosis 림프구의 결정을위한 손가락 - 스틱 혈액 샘플링 방법론

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