Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

이 실험 과정의 전반적인 목표는 살아있는 세포 형광 현미경을 사용하여 배양된 뉴런 내의 미토콘드리아 수송을 장기간 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 배양된 뉴런의 미토콘드리아를 오르가넬 타겟 형광 단백질로 라벨링함으로써 수행됩니다. 실험 과정의 두 번째 단계는 대조군 조건에서 미토콘드리아 수송 이미지를 획득하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 세로토닌과 같은 신경조절물질을 급성 투여한 후 미토콘드리아 수송의 타임랩스 이미지 시리즈를 획득하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 획득한 타임랩스 이미지 시리즈를 분석하는 것입니다. 결과적으로 신경전달물질이 미토콘드리아 수송을 조절한다는 결과를 얻을 수 있습니다.

이러한 결과는 뉴런 내 형광 표지된 미토콘드리아를 장시간 이미징함으로써만 얻을 수 있습니다. 생존 염색(vital dye labeling)이나 GFP의 일시적 형질전환(transient transfection)과 같은 기존 기술과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은, 건강한 배양 뉴런에서 미토콘드리아 수송을 장기적으로 관찰하는 것이 가능하다는 점입니다. 안정적인 가열 및 가습 환경을 제공하기 위해, 본 실험실의 부연구원인 Chen이 이 절차를 시연할 것입니다.

스테이지 탑 인큐베이터는 표준 조직 배양 인큐베이터와 폐쇄 회로로 연결되어 있으며, 35 millimeter 글라스 바텀 배양 접시용 A-P-F-T-E 막 덮개는 신경세포 배양물과 인큐베이터 내부 환경 사이의 가스 교환을 가능하게 합니다. 이러한 기능들과 다른 특징들이 결합되어 다양한 실험 조건 하에서 배양된 신경세포의 장기 관찰이 가능합니다. mito turbo red 단백질을 발현하는 배양된 해마 신경세포가 담긴 배양 접시를 조직 배양 후드로 옮깁니다.

플라스틱 뚜껑을 PTFE 막 뚜껑으로 교체한 후 배양 접시를 현미경으로 옮깁니다. 인큐베이터 베이스를 현미경 스테이지에 고정한 다음, 막이 덮인 배양 접시를 조심스럽게 안착시킵니다. 움푹 들어간 개구부에서 인큐베이터 인클로저를 인큐베이터 베이스의 스틸 포스트에 맞춘 후, 인클로저를 베이스 위로 내립니다.

인클로저와 베이스 사이에 밀폐가 잘 될 때까지 손나사를 조입니다. 이미징 소프트웨어를 열기 전에 현미경 필터 휠 컨트롤러, 광원 및 CCD 카메라의 전원을 켭니다. 본 프로토콜에서는 이미지 획득을 위해 슬라이드 북 5를 사용합니다.

63 x 오일 침전 대물렌즈로 전환하고 대물렌즈 터렛을 내립니다. 대물렌즈 표면에 침전유를 조심스럽게 도포합니다. 툴바에서 초점 창 아이콘을 클릭하고 램프 슬라이더를 움직여 명시야 램프를 켭니다.

빛의 세기를 조절하려면 접안렌즈를 사용하여 세포 영역의 초점을 맞추고 관찰하고자 하는 세포를 찾습니다. 현미경 탭에서 XI 3 필터를 선택하고, 접안렌즈를 통해 mito turbo red 단백질로 표지된 세포 내 미토콘드리아의 초점 평면을 찾은 다음 CCD 카메라로 전환합니다. 툴바의 이미지 캡처 아이콘을 클릭하며, 초기 노출 시간은 100 milliseconds로 설정하여 시작합니다.

캡처 창의 test 및 find best 버튼을 사용하여 최적의 노출값을 찾으십시오. capture type 상자 아래에서 time-lapse 옵션을 체크하고, time-lapse 캡처 옵션 아래에서 원하는 이미지 촬영 간격과 촬영 세션 시간을 선택하십시오.

캡처 창의 오른쪽 하단에 있는 시작 버튼을 클릭하여 타임랩스 이미지 획득을 시작하십시오. 대조군 이미징 세션을 캡처한 후, 스테이지 상단 인큐베이터 상단의 주입구를 통해 신경전달물질 또는 기타 시약을 투여하십시오. 세로토닌 수용체 작용제인 8-OH-DPAT를 첨가하면, 이전에 화살표로 표시된 정지 상태의 미토콘드리아가 해마 뉴런의 축삭을 따라 이동합니다.

세로토닌 첨가 전 개별 미토콘드리아의 평균 속도와 방향성이 요약되어 있습니다. 대부분의 미토콘드리아는 정지 상태이지만, 세로토닌을 첨가하면 미토콘드리아의 42%가 방향성 이동을 나타내며 세로토닌이 없을 때 방향성 이동을 보인 것보다 더 먼 거리를 이동합니다. 반대로, 도파민을 첨가하면 이 절차에 따른 이미징 세션의 마지막 15분 동안 미토콘드리아의 92%가 정지 상태가 됩니다.

추가적인 질문에 답하기 위해 하나 이상의 신호를 모니터링하는 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 뉴런 내의 칼슘 활성과 미토콘드리아 운송이 어떻게 연관되어 있는지를 확인할 수 있습니다.