Name: 네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 배우세요 신피질 오가노타입 슬라이스에서 피라미드 뉴런의 전기생리학적 기록 방법을. 생후 8-10일 래트 뇌 절편을 배양하고 전체세포 전압고정 기법으로 이온 채널 특성을 분석합니다.

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저자는 뛰어난 기술 지원을 마유미 Sakuraba과 레베카 Foehring 감사하고 싶습니다. 또한, 우리는 DRS 감사하고 싶습니다. transfection에 대한 cDNA 구성으로 우리를 제공할 organotypic 슬라이스 문화와 biolistic transfection 프로토콜 및 박사 진 Nerbonne 구현에 도움을 로드리고 안드레 이드. NINDS (RCF)를에서 NS044163 :이 작품은 NIH 교부금에 의해 지원되었다.

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 쥐를 네크로 텍스 (4, 9-11)에서 피라미드 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널의 표현과 기능적 역할을 공부했습니다. 때문에이 채널에 대한 특정 약리 대리인의 부족, 우리는 채널 표현 (1,14,15,17-19)를 조작을위한 유전자 접근 방법을 사용합니다. 세포 형태학 및 피질의 판상 패턴을 유지하기 위해 Stoppini 외 (16)의 접근에서 수정. 우리는 organotypic 문화 준비 (12,13,15-22,, 5-8 2,3) 활용. 우리는 6-17 출생 후의 일에서 급성 neocortical 조각을 분리하고 2~7일에 대한 문화의 슬라이스를 유지합니다. 이것은 우리가 급성 조각과 함께 작품에 비슷한 세 뉴런을 연구 수 있으며 통에 풍부한 흥분성의 연결의 개발을 최소화합니다. 우리는 적외선 조명 (IR -)과 전류 또는 전압 클램프의 전체 세포 패치 클램프 차등 간섭 대비 현미경 (DIC)를 사용하여 레이어 II / III 또는 V에서 시각 식별 피라미드 뉴런에서 기록합니다. 야생 ...

외과 / transfection / 문화 : <ol><li> 브레인 슬라 이서 : 캠덴 Vibroslice # MA572 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, 미국 </li><li> 진 건 시스템 : 바이오 래드는 # 165-2431을 (바이오 - 래드 연구소, 1000 알프레드 노벨 드라이브, 헤라클레스, CA 94547) 편 <ul><li> 진 총, 레귤레이터, 튜브 준비 스테이션 (# 165-2418), 주사기 키트, Tefzel 관, 튜브 커터, 최적화 키트 (# 165-2424), 튜브 커터와 헬륨 호스 어셈블리를 : ​​포함 </li><li> 바이오 래드 헬륨 조정기 (# 165-2413) </li><li> 에 대한 일회용 용품 바이오 래드에서 헬리 우스 : <ul><li> 1.6 μm의 골드 Microcarriers : # 165-2264 </li><li> Tefzel 관 : # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> 인큐베이터 : 견적 과학적 모델 # 3110 (온습 과학 (866) 984-3766). </li></ol> 미디어 : <ol><li> 호스 세럼 : Hyclone 기증자 에콰인 # SH 30074. (HyClone, 925 웨스트 1800 사우스, 로건, UT 84321) </li><li> HMEM (최소 필수 미디어 플러스 HBSS와 HEPES, 아니 글루타민 : Lonza BioWhittaker 카탈로그 # 12 - 137F) : GIBCO / INVITROGEN (800) 955-6288, 옵션 1. </li><li> HBSS (GIBCO 행크스가 # 24020-117를 호수 버퍼) : GIBCO / INVITROGEN (800) 955-6288, 옵션 1. </li><li> 멤 (GIBCO 최소한의 필수적인 매체, # 12360-038), GIBCO / INVITROGEN (800) 955-6288, 옵션 1. </li><li> 250 ML Millipore 0.2 μm의 필터 : # SC6PU02RE </li><li> 플라스틱 전송 pipettes : 피셔 # 13-711-20. </li><li> 50 ML Millipore steriflip 0.22 μm의 필터 (# SCGP00525) </li></ol> 피셔 과학, 1,241 대사 블러 바드, PO 상자 14989, 세인트 루이스, MO 63132 : 얻은 항목 6-8. 녹음 : <ol><li> Pipet 유리 : 하버드 GC150TF - 10 : 하버드 장치, 84 옥토버 힐로드, 홀리스튼, 매사 추세츠 01,746 </li><li> 서터 P - 87 수평 전극 풀러 : 서터 악기 회사, 하나 디지털 드라이브, 노바토, CA 94949 </li><li> 액슨 인스 트루먼 트의 Multiclamp 700B 앰프 : 분자 디바이스 주식 회사 1311 뉴올리언스 드라이브, 서니 베일, CA 94089-1136 </li><li> 분자 디바이스, 주식 회사, 1311 올리언즈 드라이브, 서니 베일, CA 94089-1136 : 10 데이터 수집 소프트웨어를 PClamp </li><li> 서터 악기 회사, 하나 디지털 드라이브, 노바토, CA 94949 : lectrode 위치는 셔터 교전 - 200 manipulators와 PC - 200 컨트롤러와 제어됩니다. </li><li> 현미경 : IR - DIC 광학과 올림푸스 BX - 50WI 똑바로 현미경 </li><li> IR - 민감한 카메라 OLY - 150 (올림푸스) 또는 DAGE - MTI (DAGE - MTI, 46360 IN 01 노스 Roeske 애비뉴, 미시건 시티). </li></ol>

네크로 텍스의 organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

우리는 쥐 네크로 텍스의 피라미드 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널의 표현과 기능적 역할을 공부했습니다. 때문에이 채널에 대한 특정 약리 대리인의 부족, 우리는 채널 표현을 조작하는 유전자 접근 방식을 촬영했습니다. 우리는 세포 형태학 및 피질의 판상 패턴을 유지하기 위해 organotypic 문화 준비 (16)를 사용합니다. 우리는 일반적으로 출생 후의 일 8-10에서 급성 neocortical 조각을 분리하고 3~7일에 대한 문화의 슬라이스를 유지합니다. 이것은 우리가 급성 슬라이스와 함께 우리의 일을 사람들에게 비슷한 나이에 신경을 공부 수 있으며 통에 풍부한 흥분성의 연결의 개발을 최소화합니다. 우리는 전류 또는 전압 클램프의 전체 세포 패치 클램프와 함께 적외선 조명 (IR -)와 차동 간섭 대비 현미경 (DIC)를 사용하여 레이어 II / III 또는 V에서 시각 식별 피라미드 뉴런에서 기록합니다. 우리는 그들의 기능을 연구하기 위해 채널의 표현을 조작하는 야생 형식이나 돌연변이 칼륨 채널의 DNA biolistic (진 총) transfection을 사용합니다. transfected 세포는 쉽게 녹색 형광 단백질 (GFP)의 cDNA와 함께 공동 transfection 후 epifluorescence 현미경으로 식별됩니다. 우리는 동일한 슬라이스에서 동일한 레이어에 인접해 untransfected 뉴런에 transfected 세포의 음반을 비교합니다.

이것은 피라미드 뉴런에서 전기 레코딩을 만드는 목적 organotypic 문화 neocortical 슬라이스 준비를 준비하고 유지하는 프로토콜입니다.

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

우리는 쥐의 신피질 피라미드 뉴런에서 전압 개폐성 칼륨 채널의 발현과 기능적 역할을 연구해 왔습니다. ...으로 인해

이 절차의 전체적인 목표는 신피질의 기관형 절편 내 parametal 뉴런으로부터 전기 생리학적 기록을 얻는 것입니다. 이는 먼저 생후 P 8에서 P 10 사이의 쥐로부터 급성 절편을 제작함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 cDNA의 Bic 형질전환을 유도하는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 해당 절편을 3일에서 7일 동안 배양하는 것입니다.절차의 마지막 단계는 전류 또는 전압 클램프를 사용하여 형질전환된 세포로부터 전기적 기록을 얻는 것입니다. 최종적으로, 기관유사 슬라이스의 parametal 세포가 동일한 연령의 급성 슬라이스 유래 세포와 유사한 특성을 가짐을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. GFP 형질전환은 이러한 특성을 변화시키지 않으므로, 전체 세포 전류 또는 전압 클램프 기록을 통해 이온 채널의 유전적 조작 후 뉴런을 연구할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 급성 절편(acute slices)과 달리, 이온 채널을 유전적으로 조작할 수 있을 만큼 충분히 긴 시간 동안 세포를 정상적인 환경에서 유지할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 특정 이온 채널 유형의 기능적 역할과 같은 이온 채널 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 동반된 원고에 명시된 대로 층류 후드(laminar flow hood), 진공 흐름 후드, 수술용 소모품 및 용액을 준비하십시오. 준비된 250 milliliters 절단 용액을 여과한 후, 이후의 모든 단계에서는 장갑을 착용하고 해당 용액 중 40 milliliters를 50 milliliter 비커에 분취하십시오.절단 챔버, 40 milliliter 분주액, 그리고 나머지 210 milliliters의 절단 용액을 층류 후드(laminar flow hood) 내 -20 °C 냉동고에 보관하십시오. 6-well 플레이트의 대각선 방향으로 위치한 3개의 웰에 배양액 1.1 milliliters씩을 넣으십시오. 이 과정을 한 번 더 반복하십시오.6-웰 플레이트. 6-웰 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣어 최소 1시간 동안 보관하십시오. 다음으로, 멸균 가위를 사용하여 절편 전이에 사용할 전이 피펫 4개의 길이를 짧게 자릅니다.용액이 걸쭉한 혼합물이 되었을 때 다른 3개의 피펫은 그대로 둡니다. 냉동고에서 40 milliliter의 절단 용액 분량을 꺼내 진공 후드 아래에 둡니다. 여기에 95%oxygen, 5%carbon dioxide를 버블링합니다.그런 다음 냉동고에서 210 milliliters의 절단 용액을 꺼내 라미나 플로우 후드 내에서 버블링합니다. 이때 95%oxygen, 5%carbon dioxide를 사용합니다. 다음으로 냉장고에서 세척액을 꺼내 라미나 플로우 후드 내에서 100%oxygen으로 버블링합니다.페트리 접시에 2 mL의 배양액을 넣습니다. 뇌 절편 제작을 위한 주간 배지 교체용으로 남은 배양액은 냉장고에 보관하십시오. 진공 후드 아래에서 50 mL 비커에 담긴 차가운 절단 용액 약 10 mL를 25 mL 비커에 붓습니다.마취 및 안락사 후, 생후 8~10일 된 쥐의 뇌를 적출합니다. 30 mL의 차가운 절편 제작 용액이 담긴 비커에서 약 30초 동안 뇌를 세척합니다. 그런 다음 뇌를 25 mL 비커로 조심스럽게 옮깁니다.장갑을 교체하고 에탄올로 장갑을 적십니다. 그 다음, 뇌를 냉각 절편 용액(cold cutting solution)에 담아 층류 후드(laminar flow hood)로 옮깁니다. 다음 단계는 소뇌와 전두극(frontal pole)을 제거하고 정중 시상면을 부분적으로 절개하여 뇌의 방향을 잡고 블로킹(blocking)하는 것입니다. 블로킹된 뇌의 전두엽 피질이 위로 향하게 하여 스테이지 위에 고정합니다.필요에 따라 메스로 추가 절개하여 슬라이스의 크기를 제한합니다. 그런 다음 뇌가 놓인 스테이지를 멸균된 금속 슬라이싱 챔버에 넣습니다. 이를 진동 조직 절편기(vibrating tissue slicer)에 장착합니다.조직 절단용 용액을 얼음처럼 차갑게 하여 기포를 발생시킨 후 수조를 채웁니다. 남은 절단용 용액 30 milliliters를 50 milliliter 비커에 붓고 95% oxygen, 5% carbon dioxide 혼합 가스로 기포를 발생시킵니다. 이 비커는 절편을 수집하는 용도로 사용됩니다.전두-두정 피질을 250 micron 두께의 관상면 조각으로 절단합니다. 절단액이 담긴 50 milliliter 비커에 최소 6개의 조각을 넣습니다. 다음으로 35 millimeter 페트리 접시에 세척액 약 2 milliliter를 넣습니다.절단된 피펫을 사용하여 절편을 절단 용액에서 세척액이 담긴 페트리 접시로 옮깁니다. 새 피펫을 사용하여 배지를 추가하고 세척 후 폐액을 흡입하는 방식으로 절편을 세 번 세척한 후, 절편을 배양액이 담긴 35 millimeter 페트리 접시로 옮깁니다. 다음으로, 메쉬 인서트 포장재의 덮개를 제거하되 인서트는 포장 상태 그대로 둡니다.그런 다음 핀셋을 사용하여 절단된 트랜스퍼 피펫으로 패키지에서 메쉬 인서트를 하나 들어 올립니다. 배양액에서 슬라이스 하나를 메쉬로 옮깁니다. 손상되지 않은 트랜스퍼 피펫을 사용하여 슬라이스를 멤브레인의 중앙에 삽입하고 배치합니다.남은 배양액을 모두 제거합니다. 이제 조직 슬라이스가 담긴 메쉬 인서트를 액체가 채워진 6-웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 각 웰에 슬라이스를 하나씩 넣은 후, 메쉬 아래에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.두 개의 6-웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 37 °C에서 약 1시간 동안 배양합니다. 그동안 형질전환 준비를 위해 층류 후드(laminar flow hood) 아래의 작업 구역을 청결히 합니다. 다음 단계는 BioRad Helios 유전자 총(gene gun)을 장전하는 것이며, 이때 첫 번째 위치는 비워 둡니다.CD NA가 코팅된 불렛이 들어있는 카트리지를 진 건(gene gun)의 카트리지 홀더 내 격간 위치에 장착합니다. 그런 다음 카트리지 홀더를 진 건에 넣습니다. 먼저, 불렛이 없는 배럴을 발사하여 건 내부를 비웁니다.그 다음 배럴을 cDNA.Bullets가 포함된 카트리지로 전진시킵니다. 인큐베이터에서 6-well 플레이트를 꺼내 라미나 플로우 후드 아래에 두고, 건을 6-well 플레이트 상단 바로 위에 수직으로 유지한 채 100 PSI로 한 슬라이스를 쏩니다. 그 후 배럴을 전진시키고 공발사를 하여 다시 비웁니다. 남은 슬라이스들을 슬라이스당 한 번씩 쏩니다.촬영 후, 6-웰 플레이트를 배양기에 다시 넣고 배양 기간 동안 37 °C, 5% CO2 조건에서 슬라이스를 2~7일 동안 배양합니다. 다음과 같이 격일로 배지를 교체합니다. 층류 후드 내에서 비어 있는 3개의 웰에 새 배지를 추가합니다. 그다음 6-웰 플레이트를 배양기에 넣고 최소 1시간 동안 둡니다. 1시간 후 6-웰 플레이트를 다시 층류 후드로 옮기고, 에탄올로 소독한 곡선 핀셋을 사용하여 각 메시 삽입물과 슬라이스를 새 웰로 옮깁니다. 기존 배지를 흡입하여 제거한 후 플레이트를 배양기에 다시 넣습니다.수일간의 배양 후, 슬라이스는 이제 전세포 기록(whole cell recording)을 위한 준비가 되었습니다. 라미나 플로우 후드 내에서 인큐베이터로부터 6-웰 플레이트를 꺼냅니다. 에탄올로 세척한 곡선 핀셋을 사용하여 메쉬 인서트 하나와 그 안의 슬라이스를 꺼냅니다.그 다음 6-웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이어서 메쉬 삽입물과 슬라이스가 포함된 페트리 접시를 기록 영역으로 옮기고, 포셉이나 유연한 금속 조각을 사용하여 장력을 가합니다. 필요한 경우 11번 메스로 슬라이스 주변의 메쉬를 잘라내고, 가위로 최종 절단을 마무리합니다.그런 다음 핀셋을 사용하여 슬라이스와 부착된 메쉬를 기록 챔버로 옮깁니다. 정립 현미경의 스테이지 위에서 IR DIC 광학 장치 하에 카보젠이 포함된 인공 뇌척수액으로 슬라이스를 적십니다. 에피 형광 및 fitz 필터 하에서 2층, 3층 또는 5층의 parametal 뉴런을 시각화합니다.IR DIC 현미경 하에서 녹색으로 형질전환된 세포를 찾습니다. 세포 내부에서 작은 검은 점으로 나타나는 CDNA 불렛을 확인하십시오. 전체 세포 기록(whole cell recording)을 위해 형질전환된 세포 하나를 선택합니다.다음으로, 선택한 세포로 미세 전극을 전진시키고 부드럽게 흡입하여 기가옴 씰(giga ohm seal)을 형성합니다. 그 후 추가로 흡입하여 세포막을 파괴함으로써 전세포 기록(whole cell recording) 상태로 만듭니다. 이제 해당 세포에서 전류 클램프 또는 전압 클램프 기록을 수행할 준비가 되었습니다.이 그림은 GFP cDNA가 형질전환된 세포의 형광 이미지입니다. 다음 기록들은 GFP cDNA가 형질전환된 세포에서 얻은 것입니다. 여기에는 임계값 이상의 10 millisecond 전류 주입에 반응하여 3층 파라메탈 세포(parametal cell)에서 나타나는 활동 전위가 표시되어 있습니다.이 그림은 2초 동안 400 pA의 전류를 주입했을 때 5층 파라메탈 뉴런(parametal neuron)에서 나타나는 반복적 발화를 보여줍니다. 이 그림은 5층 파라메탈 뉴런의 전압 클램프 기록을 보여줍니다. 전압 개폐성 나트륨 전류를 차단하기 위해 테트로도톡신(Tetrodotoxin)이 사용되었습니다.-70 mV의 유지 전위에서 500 ms의 전압 단계로 유도된 외향 칼륨 전류의 기록입니다. 숙련되면 준비 시간을 포함하여 간단한 전처리와 형질전환을 약 2시간 만에 완료할 수 있습니다. 본 실험 절차를 수행할 때.멸균 상태를 유지하는 것과 건조를 방지하기 위해 절편의 두께와 크기를 제한하는 것이 중요합니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과 있으시길 바랍니다.감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

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