마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

다음 실험의 전반적인 목표는 이 독특한 세포 주기 동안 발생하는 동적 과정을 연구하기 위해 마우스 성체 고환에서 광범위한 진드기 세포를 즉시 고순도로 정제하는 것입니다. 이는 DNA가 존재하는 상태에서 콜라겐분해효소효소(collagenase)와 트립신(trypsin)을 이용한 일련의 효소 소화를 통해 고환 세포를 효율적으로 해리시킴으로써 달성됩니다. 하나는 두 번째 단계로 단일 세포 고환 현탁액을 얻는 것입니다.

고환 현탁액은 헐크의 3 33 42 형광 살아있는 DNA 염료로 염색되어 DNA 함량과 밀도에 따라 다양한 근 세포 유형을 구별할 수 있습니다. 다음으로, 세포 유전학 또는 유전자 발현 분석과 같은 추가 분석에 필요한 모든 분획을 식별하고 정제하기 위해 형광 활성화 세포 분류를 통해 miotic cell을 분석합니다. 포괄적인 세포유전학 및 발현 배열 연구를 기반으로 얻기 어려운 miotic 세포 집단의 효율적인 정제를 보여주는 결과가 얻어졌습니다.

원심, 침상 또는 중력 침전과 같은 기존 방법에 비해 이 사실 기반 프로토콜의 주요 장점은 매우 높은 순도에서 최대 miotic 분획을 수집할 수 있다는 것입니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 효율적인 검사 해리 및 스탠딩을 수행하기 위해 매우 다양한 기술을 결합해야 하며, 최적의 세포 분류, 세포를 준비하는 사람과 유세포 분석 운영자 간의 좋은 상호 작용, 성공에 필수적인 이 프로토콜의 기본 사항에 대한 충분한 이해를 수행해야 합니다. 세포 해리 프로토콜을 시연하는 것은 이 프로토콜을 상당히 개선한 우리 실험실의 선임 박사후 연구원인 Dr.I Gatun이 될 것입니다.

BVN 토레스. 당사의 유세포 분석 작업자가 효율적인 세포 분류를 위한 최적의 설정을 안내해 드립니다. 이 프로토콜에서는 두 개의 성체 마우스 고환의 해리가 시연되지만 청소년 또는 추가 고환에 따라 볼륨을 조정할 수 있습니다.

밀리리터의 시선 균형 잡힌 소금 용액에서 시작하려면 튜브에 콜라겐 분해 효소 유형 1 밀리리터당 120 단위를 함유하고 효율적이고 맛있는 디스 결합은 세포의 올바른 염색과 문제 의지에 매우 중요합니다. 교반 중에 튜브를 수평 위치에 배치하는 것뿐만 아니라 충분한 G nase one을 추가하는 것은 효율적인 테스트 해리를 위해 매우 중요합니다. 캡슐화된 고환 하나를 15ml 튜브에 넣습니다.

고환에 하나씩 10 마이크로 리터의 DNA를 추가하고 고환 세뇨관이 해리되기 시작할 때까지 손으로 튜브를 세게 흔듭니다.다음 회전 셰이커에 튜브를 수평으로 고정하고 15 분 후 섭씨 33도에서 15 분 동안 최대 120RPM으로 튜브를 교반합니다. 실온에서 수직으로 1분 동안 디캔트합니다. 그런 다음 일회용 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다. 콜라겐분해효소 1형을 함유한 시선 균형 소금 용액 3ml와 D nase 1 10마이크로리터를 샘플에 추가합니다.

다시 한 번 손으로 튜브를 몇 번 흔듭니다. 튜브를 최대 120RPM으로 섭씨 33도에서 15분 동안 수평으로 교반하고 실온에서 수직으로 1분 동안 디캔팅한 후 상등액을 버립니다. 다음으로, 콜라겐 분해 효소가 함유된 GBSS 2.5ml를 추가합니다.

유형 1 : 50 마이크로 리터의 트립신과 10 마이크로 리터의 다제. 하나는 튜브를 여러 번 뒤집고 섭씨 33도에서 15분 동안 최대 120RPM으로 수평으로 교반합니다. 15분 동안 교반한 후 넓은 구멍이 있는 일회용 플라스틱 과거 피펫을 사용하여 3분 동안 샘플을 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.

이 시점에서 덩어리가 보이지 않아야 합니다. 그런 다음 30 마이크로 리터의 트립신, 10 마이크로 리터의 DNA 1 및 40 마이크로 리터의 헐크 3 33 42를 DMSO에 재현 탁엽시킵니다. 튜브를 여러 번 뒤집습니다.

섭씨 33도에서 15분 동안 최대 120RPM으로 수평으로 교반합니다. 샘플의 교반이 완료되면 400마이크로리터의 태아 송아지 혈청을 첨가하고 튜브를 뒤집어 트립신을 비활성화하여 혼합합니다. 최종 염색을 수행하려면 50마이크로리터의 hoax 3, 33, 42 및 10마이크로리터의 DNA를 추가합니다.

다시 한 번, 섭씨 33도에서 15분 동안 최대 120RPM으로 튜브를 수평으로 교반합니다. 그런 다음 해리된 고환 샘플은 50밀리리터 원추형 튜브를 통해 GBSS가 사전 결합된 두 개의 40미크론 일회용 필터를 통과합니다. 샘플에 5마이크로리터의 프로피듐 요오드화물 용액을 추가하고 일회용 페이스트 피펫으로 여러 번 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.

다음으로, 18 게이지 바늘을 통해 샘플을 5 밀리리터 플라스틱 주사기로 옮깁니다. 그런 다음 샘플 전달을 위해 18 게이지 바늘을 22 게이지 바늘로 교체합니다. 마지막으로, 주사기를 얼음 위에 보관하고 샘플이 팩스 처리를 위해 준비될 때까지 빛으로부터 보호합니다.

이 실험에서는 Backin Dixon 영역에서 세포 분류를 수행합니다. 둘째, 360 나노미터 자외선 아르곤 레이저와 488 나노미터 아르곤 레이저가 장착된 유세포 분석기에 이전에 사용되던 조건을 변형한 세포 분류기 조건을 사용했습니다. 궁극적으로 유세포 분석기 설정은 세포 분류기 작업자에 의해 최적화되어야 합니다.

Becton Dixon Aria two U에는 UV 레이저가 없기 때문에 매 염색 검출 프로토콜은 405 나노미터 바이올렛 레이저를 사용하여 조정됩니다. Hooks는 405 나노미터 바이올렛 레이저에 의해 여기되고 488 나노미터 블루 레이저는 PI 여기와 전방 및 측면 산란 검출 모두에 사용됩니다. 또한 일부 적색 레이저 누출을 제한하기 위해 hos 감지를 위한 필터를 수정하여 산점도 선명도를 개선합니다.

보라색 레이저는 거짓 청색 방출을 감지하기 위한 4 50 40 나노미터 대역 통과와 거짓 적색 방출을 감지하기 위한 5 85 42 나노미터 대역 통과로 구성됩니다. 5 0 2 나노미터 길이의 패스는 적색 형광에서 청색을 분리하는 데 사용됩니다. 두 개의 서로 다른 필터 세트를 사용할 때의 차이점은 다음과 같습니다.

5 85 42 나노미터 필터는 6 30 30 나노미터 필터보다 더 조밀한 세포 집단을 제공합니다. 따라서 작업자는 최상의 절충안을 얻기 위해 자신의 기기에서 다양한 조합을 시도할 준비가 되어 있어야 합니다. 100 미크론 분사구는 28의 하락 드라이브 빈도로, 초당 000의 하락 이용된다.

샘플 임계값 속도는 초당 약 4, 000개의 이벤트이며 더 높은 해상도를 유지하기 위해 1에서 3 사이의 유속을 유지합니다. 주사기에서 분주된 약 750마이크로리터의 부분 표본으로 샘플을 분류합니다.이러한 일시 중지 기간 동안 주사기에 남아 있는 샘플을 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호합니다. 분류된 샘플을 10% FCS가 보충된 250마이크로리터 DMEM이 들어 있는 12 x 75mm 유리 보리시 위치 수집 튜브에 수집합니다.

채취 튜브의 시료를 섭씨 4도로 유지하려면 전체 분류 기간 동안 온도 제어 옵션을 사용하십시오. 또한 200RPM에서 시료 교반 기능을 사용하여 시료가 분류 전반에 걸쳐 침전되는 것을 방지할 수 있습니다. 주 샘플의 부분 표본을 추가할 때마다 수집된 세포의 무결성을 유지하기 위해 수집 튜브를 가볍게 두드리는 것도 중요합니다.

대표적인 사실 프로필이 여기에 나와 있으며, 야생형 감수분열의 모든 주요 단계가 확인되는 곳이며, 게이트 세포가 표시된 이 산점도에서 성인 고환에 존재하는 대부분 빈 막과 정자 꼬리를 포함하는 많은 양의 파편이 있습니다. 대표적인 Propidium iodide 플롯은 샘플에 존재하는 매우 제한된 양의 propidium iodide 양성 세포를 보여줍니다. 일반적인 걸음걸이는 이 대표적인 야생형 사기 3 33 42 팩스 프로필에 표시되어 있습니다.

추가 연구를 위해 이 방법을 사용하여 정제할 수 있는 다양한 근세포 집단은 정자형성증(spermatogonia), 프리렙틴(pre leptin), 렙틴(leptin), 접합자(zygotes), 파쿠(pacu), 디플로텐(diplotene) 및 라운드 스페레이트(round sperate)로 표시됩니다. 이 마지막 두 가지 사실 프로필은 SPO 11 N 고환과 13일 된 생쥐의 야생형 고환에서 가져온 것입니다. SPO 11은 이중선 가닥 파단을 지시하는 miotic endonuclease이며, 여기에서 관찰된 바와 같이 SPO O 11의 부재는 leptin zygote early PACU를 지나는 단계를 감지할 수 없기 때문에 명백한 miotic 실패를 초래합니다.

대조적으로, 13일 야생형 수컷 마우스의 프로필은 렙틴 접합자 세포의 고농도를 보여줍니다. 이 근긴장의 첫 번째 물결은 명확하게 시각화된 것처럼 다소 비동시적입니다. 이 방법론을 사용하여 이 실험을 수행하는 동안 충분한 양의 DNA를 사용하는 것이 중요합니다.

문제 없는 분류를 위한 도시의 중심지입니다. 연구자들은 처음에는 사용을 꺼렸지만 DNA를 추가하면 샘플 점도가 감소하고 세포 분리 및 염색이 향상되며 손상되지 않은 세포가 손상되지 않습니다. matic cell의 ation을 위한 FOX 방법은 예를 들어 유전자 발현 역학을 연구하기 위한 D-N-A-R-N-A 추출 또는 다양한 후성유전학적 프로파일링을 확립하기 위한 염색질 면역침전 기술과 같은 광범위한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.