Name: 마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 학습하세요 마우스 고환에서 감수분열 세포를 고순도로 정제하는 FACS 기반 방법을 통해 세포주기 역학과 유전자 발현을 연구하는 기술입니다.

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이 프로젝트는 플로리다 주에서 스크립스 및 보너스 번호는 각각 종합 의료 과학 국립 연구소와 아동 건강 및 인간 발달의 국립 연구소에서 R01GM085079 및 R21HD061304에 돈도에 의해 부분적으로 지원되었다. 이것은 스크립스 연구소의 논문 번호는 20917입니다.

이 프로토콜은 두 가지 주요 단계로 분리 수 있습니다 : 필요한 경우 (1) 마우스 testis 세포의 분리와 Hoechst 33342 얼룩이에 의해 배아 세포부터, 감수 분열의 모든 단계를 포함하여 관련 meiotic 분수의 정렬 (2) 외과를 따라 라운드 spermatids. 일단 수집이 매우 풍부한 meiotic 인구는 분석의 광범위한 사용하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 하나의 성인 testis의 분리를 설명, 볼륨 아동 또는 추가 testes에 대해 적절하게 적용할 수 있습니다. 1. Testis 분리 <ol><li> 15 - ML 튜브에 놓으 decapsulated testis합니다. </li><li> Collagenase 유형 I. 120 U / ML을 포함 Gey의 밸런스 소금 솔루션 3 - ML (GBSS)를 추가 </li><li> DNAse I (50 % 글리세롤의 1mg/ml 주식 솔루션) 10 μl를 추가하고 교제를 끊다 시작 고환 tubules가 나타날 때까지 손으로 적극적으로 그것을 흔들어. </li><li> 33 ° C.에 15 분 120 RPM의 최대 가로 선동 </li><li> 실온에서 수직으로 1 분 가만히 따르다 및 뜨는 폐기. </li><li> 1.5 단계 1.2를 반복합니다. </li><li> Collagenase 유형 I, 1mM HCL 솔루션, 그리고 DNAse I (1mg/ml) 10 μl에 resuspended 50mg/ml 트립신 주식 솔루션 50 μl를 포함 GBSS 2.5 ML를 추가하고 튜브를 여러 번 반전. </li><li> 33 ° C.에 15 분 120 RPM의 최대 가로 선동 </li><li> 넓은 구멍과 플라스틱 일회용 파스퇴르 pipet을 사용하여, 피펫 부드럽게 위아래로 3 min.No의 대단히 짧은 시간을 위해이 시점에서 볼 수 있습니다. </li><li> 트립신 30 μl, DNAse I, DMSO (10 MG / ML)에 resuspended Hoechst 33342 40 μl, 10 μl를 추가하고 튜브를 여러 번 반전. </li><li> 33 ° C.에 15 분 120 RPM의 최대 가로 선동 </li><li> 소태아 혈청 (FCS)의 400 μl를 추가하고 트립신을 inactivate로 반전하여 섞는다. </li><li> 최종 얼룩은 Hoechst 33342 50 μl DMSO (10 MG / ML)에 resuspended, 그리고 DNAse I (1 MG / ML) 10 μl를 추가하여 수행됩니다. </li><li> 33 ° C.에 15 분 120 RPM의 최대 가로 선동 </li><li> dissociated testis 샘플 후 두 40 μm의 GBSS 통과하는 50 ML 원뿔 관을 통해 사전에 침수 일회용 필터, 일회용 파스퇴르와 함께 여러 번 pipetting하여 솔루션에 추가되고 예제가 부드럽게 혼합합니다 propidium의 요오드화물의 다음 5 μl (PI) 피펫. </li><li> 샘플은 18 게이지 바늘을 통해 5 ML 플라스틱 주사기로 전송됩니다. 후자는 샘플 제공을위한 22 게이지 바늘로 대체됩니다. 주사기는 얼음에 저장하고 빛으로부터 외과 처리를위한 준비까지 보호됩니다. </li></ol> 2. 외과의 설치 및 정제 <ol><li> 정렬은 백톤 디킨슨 - 아리아 IIu 세포 분류기에서 수행되었다. 다른 장비를 사용하여 특히 설명한 조건에 따라서 시작점으로 사용해야합니다. 우리는 이전에 조건을 사용 7,8 설명했다. </li><li> 아리아 IIu은 UV 레이저를하지 않기 때문에, 우리는 앞으로 측면 산란 감지 488nm 청색 레이저를 사용 이외에 405nm 바이올렛 레이저를 사용하여 Hoescht 얼룩을 검출을위한 프로토콜을 적응. 또한, 일부 필터는 개선 흩어져 플롯 선명도에서 발생하는 몇 가지 빨간색 레이저 leakiness을 제한하기 위해 수정되었습니다. </li><li> 바이올렛 레이저 Hoescht 블루 방출의 검출을위한 450/40nm 밴드 패스와 Hoescht 레드 방출을위한 585/42nm 밴드 패스로 구성되었다. 502nm 긴 패스는 적색 형광에서 파란색으로 구분하는 데 사용되었다. </li><li> 100 μm의 노즐은 28000 방울 / 초의 드롭 드라이브 주파수로 사용되었다. 샘플 임계값 속도는 약 4000 이벤트 / 초되었다. 온도 제어 옵션은 4 샘플 및 수집 튜브를 유지하는 데 사용된 ° C 정렬의 전체 기간. 또한, 샘플 교반 기능은 일종의 전역 sedimenting에서 샘플을 방지하기 위해 200 rpm으로 사용되었다. </li><li> 보통 2-3 testes은 각 인구 0.5 - 2.0x10 6 전지 (대표 섹션을 참조)의 컬렉션을 허용 6시간 정렬마다 처리되었습니다. </li><li> 샘플은 주사기에서 적절 약 750μl의 aliquots으로 정렬되었습니다. 한편, 이러한 일시 중지하는 동안 컬렉션 튜브는 4 유지되었습니다 ° C, 빛으로부터 보호하고, 부드럽게 사전 재개 정렬 혼합. </li><li> 정렬 샘플 10% FCS와 보충 250μl를 포함한 DMEM 12x75mm 유리 borosilicated 수집 튜브에 수집되었다. </li></ol> 3. 대표 결과 : 일반 외과 프로필은 그림 1에 표시됩니다. 감수 분열의 주요 단계를 모두 식별하고 전설에 표시됩니다. Hoechst 33342는 최적되지 얼룩 경우, 글로벌 프로파일은 훨씬 더 컴팩트 나타나고 이하 정의합니다. 일반적인 문제는 급속한 세포 clumping을 유도합니다 충분한 DNAse를 추가하지하시오. 모든 기소 단계에서 추가 DNAse의 추가는 일반적으로이 문제를 해결합니다. 프리즈 일DNAse 주식 (-20 ° C에 저장된)의 awing는 효소 활동의 급속한 손실이 결과로, 최소로 보관해야합니다. Spo11는 meiotic 재조합 핫스팟 12 사이트에서 더블 스트랜드 나누기를 안내 meiotic endonuclease이다. 그림 2는 전형적인 불임 감수 분열 12 결과 더블 스트랜드 브레이크가 형성되지 않은 Spo11 - NULL testis의 프로필,뿐만 아니라를 보여줍니다 감수 분열의이 첫 번째 물결의 비동기 자연을 밝히지 13 일 옛 마우스, 사전 puberous 프로필입니다. synaptonemal 복잡한 단백질 3 (SCP3) 및 phosphorylated 히스톤 H2AX 항체의 조합을 사용하여 표준 cytogenetic 분석은 무대 특정 세포의 감수 분열의 마커가 처음으로 elswhere 11 설명한 정렬 meiotic 세포의 순수 자연을 확인하는 데 사용해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 와일드 타입의 감수 분열의 외과 프로필. A) 대표 스캐터 플롯이 표시됩니다. 문이 세포가 표시됩니다. 대부분 비어있는 점막 및 spermatid 꼬리를 포함한 성인 testis에있는 파편의 많은 양의 있습니다. B) 대표 PI의 줄거리는 샘플에있는 PI 긍정적인 세포의 매우 제한된 금액을 보여줍니다. 전형적인 게이트가 표시됩니다. C) 대표 야생 타입 Hoechst 33342 외과 프로필이 표시됩니다. 진학이 방법을 사용하여 정화 수있는 다양한 meiotic 세포 집단이 표시됩니다 : spermatogonia (SP), 사전 leptotene (PL), leptotene - 접합기에 이어지는시기로 (L / Z), 초기 Pachytene (EP), 중간 Pachytene ( MP), 늦은 Pachytene (LP), diplotene (D), 그리고 원형 spermatids (RS). <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Spo11 - NULL과 야생 형 13 일 meiotic 외과 프로필. A) 일반적인 Spo11 - NULL 프로필 접합기에 이어지는시기로 / leptotene 초기 pachytene 과거의 어떤 단계가 감지 수 없습니다 명확한 meiotic 실패와 표시됩니다. B) 13 일 된 야생 형 남성 마우스의 프로필 leptotene / 접합기에 이어지는시기로 세포의 높은 농도를 나타냅니다. 감수 분열의 첫 번째 물결은 명확하게이 방법을 사용하여 시각, 오히려 비동기입니다.

<ol><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+elutriation%3A+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).</li>
<li>Purification, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Lassalle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+Population%27+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131, 479-487 (2004).</li>
<li>Bastos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li>
<li>Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+variation+in+human+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of variation in human meiotic recombination.</a> PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).</li>
<li>Roig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+TRIP13%2FPCH2+is+required+for+recombination+and+normal+higher-order+chromosome+structure+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis.</a> PLoS Genet. 6, (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+occupancy+landscape+and+dynamics+at+mouse+recombination+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots.</a> EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).</li>
<li>Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Spo11+gene+is+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis.</a> Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 프로토콜 사람이 동시에 조사이 근본적인 프로세스의 역학을 연구 수 있도록, 성인 남자 생쥐에서 매우 높은 순도로 meiotic 무대 세포의 전체 범위를 정화 수 있습니다. 정화 세포는 RNA 추출 9,10, nucleosome 매핑 11, 재조합 분자 탐지, 단백질 분석, 그리고 많은 이르기까지 다양한 애플 리케이션에 사용할 수 있습니다. 그러나, 검출 방법은 정화 meiotic 세포의 금액에 적응해야합니다. 또한,이 방법의 높은 재현성과 함께, 그것은 특정 실험에 필요한 재료의 양을 증가하기 위해 다른 일에서 수행 같은 분수의 수영장 여러 독립적인 종류의 수 있습니다. 또한이 방법은 하나가 빠른 속도로 유전자 녹아웃, 발달 진행 수차, 또는 세포의 감수 분열에 영향을 목적으로 특정 치료의 효과 (예, 방사선 조사의 효과를 평가할 수있는 전체 meiotic 프로세스의 독특한 시각적 표현과 함께 조사를 제공하거나, 작은 분자 억제제 치료). <p clas...

<table><tbody><tr><td>Collagenase Type-1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLSS1</td><td>GBSS에 12,000U/ml로 용해하여 4&amp;#x00B0;C에서 보관</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington Biochemical</td><td>TRL3</td><td>1mM HCl에 50mg/ml로 용해하여 4&amp;#x00B0;C에서 보관</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Acros Organics</td><td>230001000</td><td>포화 용액 (DMSO에 10mg/ml, 4&amp;#x00B0;C에서 보관)</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNEP</td><td>물/50% glycerol에 1mg/ml로 용해하여 -20&amp;#x00B0;C에서 보관</td></tr><tr><td>Gey&amp;rsquo;s Balance Salt Solution </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>6&quot; Transfer Pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

testis의 세포 유형의 이질적인 성격과 meiotic 세포 배양 모델의 부재는 감수 분열 동안 매니 페스트의 독특한 차별화 프로그램의 연구에 상당한 장애물을하고 있습니다. elutriation 또는 Staput (침전) BSA 및 / 또는 percoll 그라디언트를 사용하는 두 가지 주요 방법은, 다양한 도로, 성인 및 미숙 동물 모두에서 다양한 meiotic 분수를 정화하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방법 중 두 세포 크기와 세포 meiotic에게 1-5 분리 밀도에 의존하고 있습니다. 전반적으로, 몇 가지 세포 인구 6 제외하고, 이러한 프로토콜 자세한 분자 분석을 위해 필요한 수많은 meiotic 세포 집단의 충분한 순도를 얻을하지. 또한, 같은 방법으로 meiotic 세포의 보통 한 종류는 meiotic 세포 샘플을 비교했을 때 재현성과 균질성에 관한 복잡한 여분 수준을 추가 주어진 시간에서 정화 수 있습니다. 여기, 우리는 Hoechst 33342 얼룩 7,8와 함께 외과를 사용하여 배아 세포에서 라운드 spermatids로, 하나는 쉽게 시각화 식별하고, meiotic 세포를 정화 수있는 세련된 방법을 설명합니다. 이 방법은 전체 meiotic 프로세스의 전반적인 스냅샷을 제공하며 하나는 높은 감수 분열 대부분의 단계에서 가능한 세포를 정화 수 있습니다. 이러한 정화 전지는 다음 meiotic 재조합 11 핫스팟에서 예제 유전자 발현 9,10의 변화와 nucleosome 인의 역학에 대해, 세포의 감수 분열을 통해 진행을 수반하는 분자 변경 사항을 자세하게 분석할 수 있습니다.

마우스 testis에서 높은 정화 가능한 meiotic 분수를 얻는 효과적인 방법은 형광 활성 세포 분류 (외과)와 세련된 세포 분리 프로토콜을 결합하는, 설명되어 있습니다. 이 방법은 DNA의 내용과 개별 meiotic 분수의 핵 밀도의 차이 활용합니다.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

고환 내 세포 유형의 이질적인 특성과 감수분열 세포 배양 모델의 부재는 ... 연구에 있어 상당한 장애물이 되어 왔습니다.

다음 실험의 전반적인 목적은 성체 마우스의 고환에서 광범위한 분열기 세포를 한 번에 높은 순도로 정제하여, 이 독특한 세포 주기 동안 일어나는 역동적인 과정을 연구하는 것입니다. 이는 DNA의 존재 하에서 콜라게나아제와 트립신을 이용한 일련의 효소 소화를 통해 고환 세포를 효율적으로 분리함으로써 이루어지며, 두 번째 단계로 단일 세포 고환 현탁액을 얻게 됩니다.시험 현탁액을 Hulk's 3 33 42 형광 생존 DNA 염색약으로 염색하며, 이를 통해 DNA 함량과 밀도에 따라 다양한 유사분열 세포 유형을 구분할 수 있습니다. 다음으로, 세포유전학적 분석 또는 유전자 발현 분석과 같은 추가 분석에 필요한 모든 분획을 식별하고 정제하기 위해 형광 활성 세포 분류법(FACS)으로 유사분열 세포를 분석합니다. 종합적인 세포유전학 및 발현 어레이 연구를 통해, 얻기 어려운 유사분열 세포 집단이 높은 순도로 효율적으로 정제되었음을 보여주는 결과를 얻습니다.원심 분리, 리터레이션 또는 중력 침강과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 사실 기반 프로토콜의 주요 장점은 매우 높은 순도로 대부분의 유사분열 분획을 한 번에 수집할 수 있다는 점입니다. 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 효율적인 조직 해리와 현탁액 조제, 그리고 최적의 세포 분리를 수행하기 위해 서로 매우 다른 기술 집합을 결합해야 하며, 세포를 준비하는 사람과 유세포 분석기 운영자 간의 원활한 상호작용뿐만 아니라 성공에 필수적인 이 프로토콜의 기본 원리에 대한 깊은 이해가 필요합니다. 본 세포 해리 프로토콜의 시연은 저희 실험실에서 이 프로토콜을 상당히 개선한 시니어 박사후 연구원인 Dr.I Gatun이 진행하겠습니다.BVN Tores. 저희 유세포 분석기 담당자가 효율적인 세포 분리를 위한 최적의 설정을 안내해 드릴 것입니다. 본 프로토콜에서는 성체 생쥐의 고환 2개를 해리하는 과정을 시연하지만, 어린 생쥐를 사용하거나 고환의 개수가 추가될 경우 그에 맞게 부피를 조절할 수 있습니다.먼저 collagenase type one이 120 units/mL 포함된 gaze balanced salt solution 3 mL를 튜브에 넣습니다. 효율적이고 완전한 조직 해리는 세포의 정확한 염색과 문제 없는 분리를 위해 필수적입니다. 충분한 collagenase one을 첨가하고, 교반 중에 튜브를 수평 상태로 유지하는 것이 효율적인 조직 해리에 매우 중요합니다. 캡슐화된 정소 하나를 15 mL 튜브에 넣으십시오.DNase I 10 µL를 고환 조직에 첨가하고, 세정관이 분리되기 시작할 때까지 튜브를 손으로 세게 흔듭니다. 다음으로 튜브를 회전 쉐이커에 수평으로 고정하고 33 °C에서 최대 120 RPM으로 15분 동안 교반합니다. 15분 후, 상온에서 1분 동안 수직으로 원심분리하여 상층액을 가라앉힙니다. 그런 다음 일회용 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 콜라게나제 type I와 DNase I 10 µL가 포함된 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution) 3 mL를 시료에 첨가합니다.다시 튜브를 손으로 몇 번 흔들어 줍니다. 이전과 같이 33 °C에서 최대 120 RPM으로 15분 동안 튜브를 수평으로 교반한 후, 상온에서 1분 동안 수직으로 데칸테이션(decant)하고 상층액을 버립니다. 그다음, 콜라게나아제(collagenase)가 포함된 GBSS 2.5 milliliters를 첨가합니다.트립신 50 µL와 dase 10 µL를 넣습니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어준 후, 33 °C에서 최대 120 RPM으로 15분 동안 수평으로 교반합니다. 15분간의 교반이 끝나면, 입구가 넓은 일회용 플라스틱 파스텟 피펫을 사용하여 3분 동안 샘플을 부드럽게 파이펫팅합니다.이 시점에서 덩어리가 보이지 않아야 합니다. 그런 다음 30 µL의 trypsin, 10 µL의 DNAs one 및 DMSO에 재현탁된 40 µL의 Hulks 3 33 42를 추가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어줍니다.33 °C에서 최대 120 RPM으로 15분 동안 수평으로 교반합니다. 시료의 교반이 완료되면, trypsin을 불활성화하기 위해 fetal calf serum 400 µL를 첨가하고 튜브를 반전시켜 혼합합니다. 최종 염색을 수행하려면, hoax 3 33 42 50 µL와 DNAs 10 µL를 첨가합니다.다시 한번, 튜브를 33 °C에서 최대 120 RPM으로 15분 동안 수평으로 교반합니다. 그다음 해리된 고환 샘플을 GBSS로 미리 적신 두 개의 40 micron 일회용 필터를 통해 50 milliliter 원추형 튜브에 통과시킵니다. 샘플에 5 µL의 propidium iodide 용액을 첨가하고, 일회용 파스퇴르 피펫으로 여러 번 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.다음으로, 18 gauge 바늘을 통해 시료를 5 mL 플라스틱 주사기로 옮깁니다. 그런 다음 시료 주입을 위해 18 gauge 바늘을 22 gauge 바늘로 교체합니다. 마지막으로, 시료를 fax 처리할 준비가 될 때까지 주사기를 얼음에 보관하고 빛으로부터 차단합니다.본 실험에서는 Backin Dixon 구역에서 세포 분리(cell sorting)를 수행합니다. 두 가지 세포 분리 조건은 360 nanometer 자외선 아르곤 레이저와 488 nanometer 아르곤 레이저가 장착된 유세포 분석기(flow cytometer)에 이전에 사용된 조건을 적용하였습니다. 최종적으로 유세포 분석기 설정은 세포 분리 작업자에 의해 최적화되어야 합니다.Becton Dixon Aria two U에는 UV 레이저가 없으므로, Hoechst 염색을 검출하기 위한 프로토콜을 405 nm 보라색 레이저를 사용하여 조정하였습니다. Hoechst는 405 nm 보라색 레이저에 의해 여기되며, 488 nm 파란색 레이저는 PI 여기와 전방 및 측방 산란 검출 모두에 사용됩니다. 또한, 일부 적색 레이저 누설을 제한하기 위해 Hoechst 검출용 필터를 수정하였으며, 이를 통해 산란 도표의 선명도를 향상시켰습니다.바이올렛 레이저는 가짜 블루 발광 검출을 위해 450 ± 40 nm 밴드 패스 필터로, 가짜 레드 발광 검출을 위해 585 ± 42 nm 밴드 패스 필터로 구성되어 있습니다. 블루 형광과 레드 형광을 분리하기 위해 502 nm 롱 패스 필터가 사용됩니다. 두 가지 서로 다른 필터 세트를 사용했을 때의 차이가 여기에 나타나 있습니다.5 85 42 nanometer 필터는 6 30 30 nanometer 필터보다 더 조밀한 세포군을 생성합니다. 따라서 운영자는 최적의 절충안을 얻기 위해 사용 중인 장비에서 다양한 조합을 직접 시도해 보아야 합니다. 28,000 drops per second의 드롭 구동 빈도와 함께 100 micron 노즐이 사용됩니다.샘플 임계율은 더 높은 해상도를 유지하기 위해 유속을 1~3 사이로 설정하여 초당 약 4,000 events로 유지합니다. 샘플을 시린지에서 약 750 µL씩 분주하여 소분 정렬합니다. 이 일시 정지 시간 동안, 시린지에 남은 샘플은 얼음 위에 두고 빛이 차단되도록 보호하십시오. 정렬된 샘플은 10% FCS가 보충된 250 µL DMEM이 들어 있는 12 x 75 mm 유리 보리사이리콜렉션 튜브에 수집합니다.수집 튜브 내의 샘플을 4 °C로 유지하려면, 소팅 전 과정 동안 온도 제어 옵션을 사용하십시오. 또한, 소팅 중에 샘플이 침전되는 것을 방지하기 위해 200 RPM으로 샘플 교반 기능을 사용하십시오. 메인 샘플의 분주액을 추가할 때마다, 수집된 세포의 무결성을 유지하기 위해 수집 튜브를 가볍게 튕겨주는 것이 중요합니다.야생형 감수분열의 모든 주요 단계가 식별된 대표적인 팩트 프로필(facts profiles)이 이 산점도에 표시되어 있으며, 게이팅된 세포들이 나타나 있습니다. 성체 정소에는 주로 빈 막과 정자 꼬리를 포함하는 다량의 잔해물이 존재합니다. 대표적인 Propidium iodide 도표는 샘플에 Propidium iodide 양성 세포가 매우 제한적인 양으로 존재함을 보여줍니다. 전형적인 게이트는 이 대표적인 야생형 hoax 3 33 42 fax 프로필에 표시되어 있습니다.이 방법을 사용하여 추가 연구를 위해 정제할 수 있는 다양한 감수분열 세포 집단으로는 정원세포, 전레프톤기, 레프톤기, 지고트, 파키텐기, 디플로텐기 및 원형 정세포가 있습니다. 마지막 두 단계의 프로파일은 13일 된 생쥐의 SPO 11 N 고환과 야생형 고환에서 얻은 것입니다. SPO 11은 감수분열 재조합 핫스팟 부위에서 이중 가닥 절단을 유도하는 감수분열 엔도뉴클레아제이며, 여기서 관찰된 바와 같이, SPO 11이 없으면 레프톤기, 지고트 및 초기 파키텐기 이후의 단계가 검출되지 않으므로 명백한 감수분열 부전이 발생합니다.반면, 13일 된 야생형 수컷 생쥐의 프로필은 렙틴 접합자 세포의 고농도를 보여줍니다. 시각화된 바와 같이, 이 첫 번째 감수분열 파동은 다소 비동기적입니다. 이 방법론을 사용하여 실험을 수행할 때, 충분한 양의 DNA를 사용하는 것이 중요합니다.원활한 분류를 위한 도시의 중심지입니다. 연구자들이 처음에는 사용을 꺼리지만, DNA를 추가하면 샘플의 점도가 낮아지고 세포 분리와 염색이 향상되며, 손상되지 않은 세포는 보호됩니다. 자동 세포 분리를 위한 FOX 방법은 유전자 발현 역학 연구를 위한 DNA/RNA 추출이나 다양한 후성유전학적 프로파일링을 확립하기 위한 염색질 면역침강법과 같은 광범위한 다운스트림 응용 분야에 사용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

의 흐름 세포 계측법 기반 정화<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

효소 세제를 피 설치류 자료에서 고환 세포 현탁액의 기계적 준비를위한 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 매우 간단하고 빠르고, 재현성 및 흐름 정렬 및 RNA 추출에 적합한 좋은 품질의 세포 현탁액을 렌더링합니다.

고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

유세포 분석을 사용하여 마우스 정자에 대한 정렬 전략을 설명합니다. 정자류는 둥글게(정자형성 단계 1-9), 초기신장(정자형성 단계 10-12), 후기신장(정자형성 단계 13-14) 및 길쭉한 정자류(정자형성 단계 15-16)를 포함하여 4개의 매우 순수한 개체군으로 분류됩니다. DNA 염색, 크기 및 입도는 선택 매개변수로 사용됩니다.

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

우리는 PDC의 기능 연구를위한 루푸스 발생하기 쉬운 마우스의 골수로부터 고순도 형질 수지상 세포 (PDC)를 분리 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 프로토콜을보고합니다.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

이 연구는 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터 정제 된 배아 세포 집단을 얻는 방법의 표준화를 기술한다. Hoechst-33342 및 propidium iodide로 염색하는 기계적 고환 해리와 남성 생식 생물학의 비교 연구에서 폭넓게 응용할 수있는 FACS 분류법을 결합한 간단한 프로토콜입니다.

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

이 문서에서는 미토 콘 드리 아 또는 살아있는 세포에서는 리소좀을 계량 하는 강력한 방법을 보여 줍니다. 표면 표식에 놓여있는지 활용 된 항 체와 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료의 조합 사용 하 여 조직 샘플에서 수확 하는 1 차 셀 같은 혼합된 세포 인구에 이러한 세포의 부 량 수 다 색 cytometry입니다.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비와 불연속 소 혈청 알부민 밀도 그라데이션을 사용하여 성인 마우스 고환에서 파키틴 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자를 풍부하게하기위한 프로토콜입니다.

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여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

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