Name: 마우스에서 자연 했습니다만 출혈을 모델로 Autologous 혈액 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 배우세요 마우스 뇌내출혈 자가혈액 주입 모델링 방법을. 스테레오택틱 기법으로 꼬리동맥에서 채혈한 혈액을 기저핵에 주입하여 병리와 신경행동학적 결과를 연구합니다.

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작품은 Translational 의학 및 치료학에 대한 연구소의 화목과에서 펜실베니아 대학과 마를린 L. 코헨과 제롬 H. Fleisch 학술 그랜트 의학 및 공학 (T32HL007954)의 연구소에서 교육 교부금에 의해 투자되었다 코네티컷 대학 보건 센터 (LHS)와 NIH NS - 029331 (FAW).

1. 장비 준비 <ol><li> 박테리아 오염을 최소화하기 위해 75 % 에탄올로 stereotaxic 프레임과 펌프를 아래로 닦아주십시오. </li><li> 해밀턴 주사기와 융합된 실리카 바늘을 소독. 참고 : 화학 살균을 사용하면, 사용하기 전에 멸균 물에 여러 번 씻어해야합니다. </li><li> 75 % 에탄올로 파라핀 왁스 종이의 표면을 닦아 건조 수 있습니다. </li></ol> 2. 분사에 대한 마우스의 준비 참고 : 그들이 새로운 환경에 적응하고 스트레스를 줄일 수 있도록 귀하의 동물 시설에 대한 수술 전 최소 7 일 전달 생쥐 되세요. <ol><li> 사전 수술 기본에 대한 마우스의 무게를. </li><li> 꼬리 핀치에 응답하기 전까지 Isoflurane 30 % 산소 70 % 질소 산화물, 4 %를 마취를 유발 </li><li> 이후 수술 진통제에 대한 buprenorphine 0.1mg/kg intraperitoneally와 마우스를 주사 </li><li> 두피를 쉐이브 </li><li> 무균 석유 젤리로 코트의 눈 </li><li> betadine × 3 잎사귀와 두피를 준비 후, 두피가 건조 수 </li><li> 멸균 수술 메스를 사용하여 두피의 1cm 절개 정중선 화살 만들기 참고 : 관대한 절개는 두개골의 랜드마크의 완전한 노출을 수 있습니다. </li><li> 베이스에서 1cm를 시작 꼬리 복부 표면의 1cm를 면도하고 betadine와 × 3 잎사귀 준비 </li><li> stereotaxic 프레임에 마우스 플레이스 참고 : 마우스 bregma의 오른쪽에있는 우수 bregma의 노출과 최소 3mm와 프레임의 기본과 두개골 병렬의 표면과 프레임에 안전하게하는 것이 중요합니다. </li></ol> 3. 했습니다만 출혈 수술 참고 : 전체 수술하는 동안 마우스를 지속적으로 37 유지 Isoflurane 30 % 산소 70 % 질소 산화물, 그리고 1-3%와 anesthetized있다 ± 0.5 ° C는 서미 스터 제어 가열 패드를 사용하고 직장 온도계에 의해 감시. <ol><li> 프레임 1 CC의 주사기에 살균 27g 바늘을 연결합니다. </li><li> 바늘 정확히 bregma 끝날 때까지 stereotaxic 팔을 조정합니다. </li><li> 그 바늘은 두개골의 표면에 bregma에 수평 낮은 2.5 mm에서되도록 팔을 조정합니다. </li><li> 수동으로 완전히 두개골을 구멍하지 프레임 복용 치료의 완만한 하향 운동을 적용하는 동안 머리의 표면에 버 구멍을 만들기 위해 주사기를 회전. </li><li> 주사기 / 바늘로 수동으로 바늘하고 완전한 버 구멍을 제거 참고 : 두개골과 뇌 실질 실수로 바늘을 밀어의 최소화 위험의 내부 테이블을 천공이있을 때 손으로 버 구멍을 완료하면 즉시 인식을 허용합니다. </li><li> 멸균 수술 블레이드를 사용하여 꼬리의 복부 표면에 가로 절개를하고 동맥혈로부터 2-3 큰 방울은 파라핀 왁스 종이에 떨어질 수 있습니다. 다음 신속하게 멸균 거즈를 사용하여 압력과 출혈 중지합니다. </li><li> 펌프에 해밀턴 주사기 및 장소 주사기에 17 μL 혈액을 철회. </li><li> 포인트 5 stereotaxic 팔을 조정 ° 수직 축에 상대 medially. </li><li> 바늘의 끝은 두개골에 버 구멍을 통해 그리고 낮은 바늘 3.5 mm가되도록 조심스럽게 stereotaxic 팔을 조정합니다. </li><li> 2 분 후 바늘 0.5 mm를 철회 잠깐 만요, (그래서 끝을 깊이 3mm입니다) </li><li> 두뇌가 바늘 주위에 다시 확장하고 주입하는 동안 바늘 삽입 트랙을 refluxing 혈액의 위험을 최소화할 수 있도록 5 분 동안 기다리십시오. </li><li> 7.5 μL를위한 혈액 1 μL / 분 주사. </li><li> 초기 혈액 응고 허용하고 조직 교대에 대한 intracranial 압력 고도를 최소화하기 위해 발생하는 5 분 동안 기다리십시오. </li><li> 1 μL / 분에 남아있는 7.5 μL를 주입 </li><li> 바늘이 응고 혈액 수 있도록 25 분 장소에서 유지하도록 허용 참고 : 응고 혈액은 바늘을 삽입 사이트를 refluxing 혈액집니다 위해 바늘을 철수 때 기다려야 실패 </li><li> 천천히 주사기를 철회하고 응고에서 바늘에 잔류 혈액을 방지하고 바늘의 재사용을 보장하기 위해 즉시 온수 헹굼. </li><li> 프레임에서 마우스를 제거하고 수의학 수술 접착제와 꼬리와 두피 incisions를 닫습니다. </li><li> 마취의 전원을 끕니다. </li><li> 지속적으로 음식을 moistened을 무료로 이용 예열되는 동안 학살 마우스 수 있습니다. </li><li> littermates 때 완전히 깨어와 케이지에 마우스를 반환합니다. 음식에 대한 액세스 동물 도움 새장 바닥에 서부 유럽 표준시 음식 펠릿를 놓습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2618/2618fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 십오분 ICH 수술 후 마우스 뇌 코로나 섹션을 참조하십시오. 즉시 두뇌가 바늘을 삽입 사이트에서 코로나 섹션의 총 점검에 따라 ICH의 성공을위한 검사되었습니다 희생. 코퍼스의 callosum 과거, 또는 심실에 바늘 트랙까지, 두뇌의 기본까지 추적 출혈이 실패한 것으로 간주되었고 그 생쥐는 모든 분석에서 제거되었습니다. 전체 ICH succeSS 요금은 0 % 사망률과 함께 50 생쥐에 75~85%되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2618/2618fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 실린더 시험 바로 기저 신경의 ICH 후 왼쪽 hemiparesis을 보여줍니다. ICH 수술 후 (A) 샘플 마우스 후면. 왼쪽 기초 신경의 ICH 후 실린더의 벽에에서만 오른쪽 forelimb의 위치를​​ 적어 둡니다. (B) 실린더 테스트 그래프 후 마우스 일대에서 1 결과 ICH 수술 (N = 5) 가짜에 비해 (n은 = 4). 위장 마우스는 혈액 주입 (바늘이 두뇌에 삽입되었다)를 제외한 모든 절차를했다. 각 마우스는 12 cm 직경 투명 유리 실린더에 배치 20 투우사에 대한 관찰되었다. 실린더의 벽면에있는 앞발의 초기 배치는 후면마다 득점했다. 마우스 바닥에 반환하고 다음 뒤쪽가 득점하기 전까지 후속 움직임은 (예 : 수평 탐사 등) 득점되지 않았습니다. 0 더 forelimb 선호 1은 오른쪽 forelimb가 사용되었습니다 표시하지 표시된 곳에, (# 오른쪽 + # 왼쪽 + # 모두) / - laterality 지수는 계산 (# forelimb 게재 위치 왼쪽 실린더의 측면에 # 오른쪽 forelimb 위치)가 .

<ol><li>Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Tests+After+Intracerebral+Hemorrhage+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat.</a> Stroke. 33, 2478-2484 (2002).</li>
<li>James, M., Warner, D., Laskowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Models+of+Intracerebral+Hemorrhage%3A+A+Translational+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocritical+Care%22%5BJournal%5D)">Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective.</a> Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).</li>
<li>Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Model+of+Warfarin-Associated+Intracerebral+Hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage.</a> Stroke. 39, 3397-3404 (2008).</li>
<li>Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+hemorrhage+in+mice%3A+model+characterization+and+application+for+genetically+modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).</li>
<li>Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+intracerebral+hemorrhage+using+autologous+blood+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion.</a> Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).</li>
<li>Wang, J., Fields, J., Doré, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+an+improved+preclinical+mouse+model+of+intracerebral+hemorrhage+using+double+infusion+of+autologous+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood.</a> Brain Research. 1222, 214-221 (2008).</li>
<li>Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoma+resolution+as+a+target+for+intracerebral+hemorrhage+treatment%3A+Role+for+peroxisome+proliferator-activated+receptor+%CE%B3+in+microglia%2Fmacrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages.</a> Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

자연 기초 신경의 출혈을 재현할 모델 autologous 꼬리 동맥 혈액 검사 결과를 사용하여 생쥐에서 했습니다만 출혈이 수술 모델입니다. 생쥐의 ICH 모델은 pathophysiology을 조사하기 위해 유전자 변형 동물의 이용의 장점을 제공하지만, 그들의 작은 크기가 큰 동물에 비해 neurosurgical 절차가 더 기술적으로 어려울 수 있습니다. collagenase 모델과 autologous 혈액 주입 모델은 실험 ICH 두 개의 잘 구축 모델입니다. collagenase 모델 쉽게 절차와 높은 재현성 출혈이 제공하는 동안, 지하 막이 저하될하는 데 사용되는 박테리아 단백질은 잠재적으로 타고난 염증 반응의 조사에 영향을 수 있습니다. 또한, BBB가 비정상적으로 약리 (예, neuroprotection) 실험을하는 동안 두뇌에 약물 액세스를 용이하게 수 collagenase은 - 중단. warfarin - 관련 ICH 모델은 최근 환자의 하위 집합...

마우스 신경 외과에 대한 Stereotaxic 프레임 (스토엘팅, 51925) Microinfusion 펌프 및 프로세서 (지금 뭐 - 3 Micro4, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다) 마우스 따뜻한 (스토엘팅, 50300) Inhalational 마우스 마취 (브레인 트리 과학, EZ - AF9000) 25 μL gastight borosilicate 해밀턴 코팅 플런저와 주사기없이 바늘 (해밀턴 회사, 리노, NV, 1702RN 주사기 : 765401, 물미 : 30,949, 스페이서 : 30,946) 융합 실리카 바늘은 2cm 길이 (해밀턴, 17739)에 컷 전에 각각의 수술을 소독하는 경우 * 참고 해밀턴 주사기와 융합된 실리카 바늘은 여러 수술을 위해 재사 용할 수 있습니다. 이 자료는 혈액이 응고되지 않도록하는 데있어 매우 중요합니다. 무균 수술 장갑 수술 가운, 모자 및 마스크 Betadine 75 % 에탄올 무균 27g 바늘 (싱글 사용) 무균 한 CC 주사기 (싱글 사용) 무균 수술 블레이드 Cidex 멸균 물 buprenorphine 및 isoflurane 멸균 거즈 파라핀 왁스 용지 사각형 베티 수술 접착제 (Vetbond, 3M, 세인트 폴, MN)

마우스에서 자연 했습니다만 출혈을 모델로 autologous 혈액 주입

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

뇌내출혈(ICH) 후 손상의 병태생리를 조사하기 위해서는 재현 가능한 동물 모델이 필요합니다. ICH는 전체 뇌졸중의 10-15%를 차지하지만, 여전히 특이적이고 효과적인 치료법이 없는 실정입니다. 마우스 자가혈 주입 모델은 기저핵에 동맥혈을 정위 주입하여 인간의 자연 발생성 고혈압성 출혈을 모사합니다. 이를 통해 출혈에 대한 반응을 in vivo에서 연구하고 신경 행동학적 결손을 정량화함으로써, 이후 발생하는 병리 현상을 기술하고 잠재적인 치료제의 효능을 테스트할 수 있습니다. 본 프로토콜에서 설명하는 절차는 바늘 경로를 통한 혈액 역류 위험을 최소화하기 위해 이중 주입 기술을 사용하며, 펌핑 시스템에 항응고제를 사용하지 않고, 시스템 내의 모든 데드 스페이스와 확장 가능한 튜빙을 제거한 방식입니다.

이 프로토콜에서 설명하는 생쥐에서 했습니다만 출혈의 autologous 혈액 주입 모델은 바늘 트랙까지 혈액 역류, 펌핑 시스템에서 anticoagulants의 위험을 최소화하기 위해 이중 사출 기술을 사용하고, 시스템의 모든 죽은 공간 및 확장 튜브를 제거합니다.

마우스에서 자연 했습니다만 출혈을 모델로 Autologous 혈액 주입

뇌내출혈(intracerebral hemorrhage, ICH) 후 손상의 병태생리학적 조사를 위해서는 재현 가능한 동물 모델이 필요합니다. ICH는 전체의 10-15%를 차지하며...

본 절차의 전반적인 목적은 생쥐 모델에서 자발적 뇌내출혈을 유도하여, 생체 내(in vivo)에서 지속되는 병리학적 변화와 신경 행동적 결과를 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 생쥐의 수술 준비를 진행합니다. 꼬리의 복측과 두피를 제모하고 세척합니다.다음으로, 두개골의 지표를 이용하여 두개골에 정밀하게 천공을 만듭니다. 셋째로, 꼬리 동맥에서 혈액을 채취하여 기저핵에 입체정위적으로 주입합니다. 그 후 주사 바늘을 조심스럽게 제거하고 절개 부위를 봉합합니다.최종적으로, 면역조직화학염색, 유세포 분석 및 기능 테스트 등의 방법을 통해 국소 염색, 세포 사멸 및 신경학적 결손을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 일반적으로 이 절차에 익숙하지 않은 연구자들은 주입되는 혈액의 양이 적어 주입하는 동안 시스템 내에서 혈액이 응고되는 문제로 어려움을 겪게 됩니다. isof fluorine으로 마취를 유도한 후, 두피를 면도하고 Betadine으로 피부를 세 번 닦아냅니다.다음으로, 동물의 눈에 멸균 바셀린을 도포합니다. 두피가 마르면 복강 내로 멸균 메스를 사용하여 수술 후 진통제를 주입합니다. 두피의 정중앙 시상면에 1 cm 길이의 충분한 절개를 가합니다.절개 부위를 통해 모든 두개골 지표가 드러나야 합니다. 이제 꼬리 기저부에서 1cm 떨어진 지점부터 시작하여 복면을 따라 1cm 구간을 제모하여 꼬리를 준비합니다. 제모된 부위를 Betadine으로 세 번 닦아낸 후, 준비된 마우스를 정위 고정 장치(stereotaxic frame)에 단단히 고정합니다.두개골 표면이 프레임 바닥과 평행해야 합니다. 또한 브리마(bregma)가 충분히 노출되어야 하며, 브리마의 오른쪽으로 최소 3 mm의 여유 공간이 있어야 합니다. 마우스가 마취 상태를 유지하도록 하고, 서미스터 제어 가열 패드를 사용하여 체온을 37 °C로 유지하십시오.직장 온도계를 사용하여 온도를 모니터링합니다. 이제 뇌내 출혈 수술을 진행합니다. 먼저 스테레오택식 암(stereotaxic arm)에 연결된 1 CC 주사기에 멸균된 27 gauge 바늘을 부착하는 것으로 시작합니다.프레임 위에서 바늘을 BMA의 외측으로 2.5 millimeters 지점의 두개골 표면에 위치시킵니다. 이제 주사기를 회전시켜 두개골 표면에 천공(bur hole)을 만들기 시작합니다.프레임에 부드럽게 하향력을 가하여 연구를 진행합니다. 이때 두개골을 완전히 관통하지 않도록 주의하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

intracerebral 출혈 (ICH)의 임상 관련 동물 모델은 출혈성 뇌졸중에 대한 지식을 확장하고 새로운 치료 전략을 검토 필요합니다. 본 연구에서는, 우리는 설명과 쥐의 기저 신경절 (코퍼스 striatum)에 autologous 전체 혈액이나 세균 collagenase 하나의 일방적 주사를 구현하는 두 ICH 모델을 평가합니다.

마우스의 모델링 Intracerebral 출혈 : Autologous 혈액이나 세균 Collagenase의 주입

이 비디오는 지주막하 출혈 쥐 모델을 설정하는 절차를 보여줍니다. 마취된 쥐에게는 두개내압과 뇌혈류를 측정하기 위해 프로브를 이식합니다. 표적 부위가 확인되고 바늘이 chiasmatic 전 위치에 삽입됩니다. 그런 다음 자가 혈액을 지주막하 공간으로 주입하여 두개내 압력을 높이고 뇌 혈류를 감소시켜 모델을 확립합니다.

자가 혈액 주입에 의해 유도된 지주막하 출혈 쥐 모델 구축

출처: Tang, X. et. al., 자가 혈액의 이중 주입에 의한 대량 폰틴 출혈. J. Vis. Exp. (2021)이 프로토콜은 쥐 뇌의 폰틴 부위에 자가 혈액을 제어하여 주입하여 대규모 폰틴 출혈을 모델링하는 방법을 설명합니다. 목적은 국소 압력을 증가시켜 국소적인 뇌출혈을 시뮬레이션하는 것입니다.

자가 혈액 주입에 의한 쥐 모델에서 대량 폰틴 출혈 유도

윌리스 천공의 관내 서클 지주막 하 출혈의 표준화 된 마우스 모델을 설명한다. 선박 천공 및 지주막 하 출혈은 두개 내 압력 모니터링에 의해 모니터링된다. 또 각종 중요한 파라미터는 기록 및 생리적 조건을 유지하도록 제어된다.

지주막 하 출혈의 생쥐 모델

뇌내출혈의 전임상 모델은 임상 질환의 특정 측면을 모방하는 데 사용됩니다. 따라서 부상의 메커니즘과 잠재적인 치료 전략을 탐구할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 뇌내 출혈의 두 가지 모델, 자가 혈액의 선조체내(기저핵) 주사 또는 콜라겐분해효소에 대해 설명합니다.

뇌출혈의 쥐과 모델로자가 혈액이나 클로스 트리 디움 콜라게나 제의 줄무늬 체 주입

우리는 이 프로토콜에서 시스테나 마그나에 자가 전혈을 이중 으로 주입하여 표준화된 지주막 출혈(SAH) 마우스 모델을 기술하였다. 이중 주사 절차의 높은 수준의 표준화는 사망률에 관한 상대적 안전과 SAH의 중간-급성 모델을 나타낸다.

수브라크누드 출혈의 모델로 시스테나 마그나에 혈액을 이중 직접 주입

우리는 자가 혈액의 이중 주입을 통해 쥐에 거대한 pontine 출혈 모델을 설정하는 프로토콜을 제시한다.

자동 혈액의 이중 주입에 의한 대규모 폰틴 출혈

지주막하 출혈은 계속해서 사람의 사망률과 이환율에 대한 높은 부담을 안고 있습니다. 상태와 병태생리학에 대한 추가 연구를 용이하게 하기 위해 pre-chiasmatic, 단일 주입 모델이 제시됩니다.

쥐 모델에서 실험적 지주막하 출혈을 유도하기 위한 자가 혈액의 Pre-chiasmatic, 단일 주사

파킨슨 병은 운동력 결함을 일으키는 중추 신경계의 도파민 성 뉴런의 변성으로 인한 신경 퇴행성 장애이다. 로테 논 모델 초파리 파킨슨 병. 이 논문은 로테 논으로 인한 자연 및 놀라게 유도 모두 운동 부족의 특성이 분석을 간략하게 설명합니다.

방법은 자발적인 특성화 및 놀라게 유도 로코을의 로테 논에 의한 파킨슨 병 모델에서합니다<em&gt; 초파리</em

여기는 마우스에서 바이러스 유도 microcephaly Zika의 모델을 설정 하는 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 Zika 바이러스의 미 발달, 신생아, 그리고 성인 무대 intracerebral 접종에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

Zika 바이러스 유도 신경 장애 Intracerebral 주입 전략을 사용 하 여 마우스 모델을 수립: 배아, 신생아, 및 성인

배우세요 마우스 뇌내출혈 자가혈액 주입 모델링 방법을. 스테레오택틱 기법으로 꼬리동맥에서 채혈한 혈액을 기저핵에 주입하여 병리와 신경행동학적 결과를 연구합니다.

마우스에서 자연 했습니다만 출혈을 모델로 Autologous 혈액 주입

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