Name: 효과기 - 단지에게 사용 BMP4의 다운 스트림 신호의 감지 현장에서 괞찮아, 근접 내고 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-03T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 배우세요 근접 연결 분석법(PLA)을 사용하여 고정 세포에서 BMP4 신호 전달을 시각화하고 정량화하는 방법을. 이 기술은 Neuro 2A 세포에서 활성화된 효과기 복합체를 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 MRC와 BBSRC의 기금에 의해 후원됩니다. 우리는 기술과 유용한 조언을 설정 도와 줘서 Ulf Landegren의 실험실에있는 웁살라 대학을 아가타 Zieba와 카테 리나 Pardalis 감사드립니다. 기술 지원 및 프레 젠 테이션에 대한 Olink의 Biosience.

1. 전지 도금 및 BMP 치료 <ol><li> GMEM 문화 Neuro2a 세포 10 % FBS와 보충, 1X 비 필수 아미노산 (NEAM), 1X 나트륨 pyruvate과 L - 글루타민 1X. 16 잘 챔버 슬라이드에 트립신 (0.05 % - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))과 잘 따라 플레이트 15.000-20.000 세포를 사용하여 세포를 분리. DMEM 문화 HEK293T 또는 Cos7 세포 10 % FBS, 1X L - 글루타민과 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보완. 70 % 에탄올에서 그들을 immersing 및 Immedge 펜은 1cm이 우물을 그릴 사용하여 polysine 슬라이드를 소독. 50 μl 매체 트립신 (0.05 % - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))과 잘 따라 플레이트 20.000-25.000 세포를 사용하여 세포를 분리. </li><li> 37 세포를 품어 ° humidified 5 % CO 2 배양기에서 C. </li><li> 24 후 H는 Neuro2a에 대한 혈청 무료 GMEM (알부민 0.1 %, 1X NEAM, 1X 나트륨 pyruvate 및 1X L - 글루타민과 보충) 또는 HEK293T에 대한 혈청 무료 DMEM (L - 글루타민과 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충)로 매체를 교체 / Cos7 후 2-3 H. 위해 전지를 품어 컨트롤로 사용하는 일반 culturing 조건 하에서 세포 (즉, 10% FBS) 세 우물 보관하십시오. </li><li> 원하는 시간 dorsomorphin (BMP 경로, 2 μm의의 억제제) 또는 BMP4 (25 NG / ML)와 세포 (10 분 - 1 H에 대한 예) 5를 처리합니다. </li></ol> 2. 고정 및 Permeabilization <ol><li> 정착액, 4퍼센트 PFA를 준비합니다. 100 ML PBS에 4 %의 솔루션을 준비하는 PFA의 4g의 무게를. 50 솔루션을 따뜻한 ° 그것이 명확 C까지. 사용까지 4 0.22 μm의 필터와 매장 ° C를 통해 솔루션을 필터링합니다. 신선한 정착액을 (이상 2 일간 저장되지 않습니다)를 사용합니다. </li><li> 우물에서 매체를 기음과 1xPBS로 씻으십시오. 이것은 세포의 분리의 결과 수 있으므로 직접 세포에 솔루션을 피펫하지 마십시오. 챔버 슬라이드를 사용하는 경우 다음 단계로 진행하기 전에, 회의소를 제거하지만, 우물 주변의 실리콘을 두십시오. </li><li> 동요하지 않고, RT에서 10 분 50 μl 4퍼센트 PFA과 부화를 추가합니다. </li><li> RT에서 교반과 코플린 병 3 X 5 분 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 0,5 % 트리톤 PBS에서 X - 100 10 분에 대한 RT에 동요하지 않고있는 세포를 처리합니다. </li><li> RT에서 교반과 코플린 병 3 X 5 분 TBS의 0,05 % 트윈 20 (TBS - T)으로 세포를 씻으십시오. </li></ol> 3. 블로킹 <ol><li> TBS - T를 누릅니다. 물론 당 Duolink II 차단 솔루션 (1X) 중 하나 드롭을 추가합니다. </li><li> 37 1 H를위한 사전 가열 습도 챔버 ° C.에있는 슬라이드를 품어 </li></ol> 4. 프라이 머리 항체 <ol><li> 믹스와 1:100에서 aP-Smad1/5/8을 (토끼 polyclonal) 희석과 Duolink II 항체 희석액 (1X)에 1:100에서 - Smad4 (마우스 단클론). 컨트롤에 사용되는 동일한 농도에서도 aP-Smad1/5/8 준비하고 A - Smad4 혼자. </li><li> 슬라이드에서 차단 솔루션을 누릅니다. 최대한 차단 솔루션을 제거하지만 항체를 추가하기 전에 세포가 건조하게하지 여분의 처리. 우물에 항체 솔루션 40 μl를 추가합니다. 하나에 잘 추가 대조군에 불과 항체 희석액을 추가합니다. </li></ol> 5. 플레 프로브 <ol><li> 항체 희석액에 두 플레 프로브 (Duolink II 안티 마우스 빼기와 Duolink II 안티 래빗 플러스) 1:5 희석. </li><li> 슬라이드의 기본 항체 솔루션을 누릅니다. 1X Duolink II 씻으 버퍼 각 슬라이드에게 2 번 5 분 씻어 RT에서 교반과 코플린있는 항아리에. </li><li> 슬라이드에서 씻으 버퍼를 누르하고 (물론 40 μl /) 괞찮아 프로브 솔루션을 추가합니다. 37 1 H를위한 사전 가열 습도 챔버 ° C.에있는 슬라이드를 품어 </li></ol> 6. 내고 <ol><li> 소용돌이 Duolink II의 결합 주식 (5 배)와 고순도 물 혼합에 1:5 희석. 물의 볼륨을 계산할 때, 계정으로 바로 우물에 혼합을 추가하기 전에 1시 40분의 최종 희석에 추가됩니다 Ligase의 볼륨을. </li><li> 슬라이드에서 플레 프로브 솔루션을 누릅니다. 1X 와시 버퍼에있는 슬라이드 RT에서 교반과 코플린 병 2 번 5 분 각각 씻으십시오. </li><li> 냉동 블록 (-20 ° C)를 사용하여 냉동고에서 Ligase를 가져가라. 1시 40분 희석과 와동의 결합 솔루션 (6.1에서 준비)에 Ligase를 추가합니다. </li><li> 슬라이드에서 씻으 버퍼를 누르하고 내고 - Ligase 솔루션을 추가하는 것은 각 웰 (물론 40 μl /). 37 30 분 미리 가열 습도 챔버 ° C.에있는 슬라이드를 품어 </li></ol> 7. 확대 참고 : 라이트 민감한 시약. 조명으로부터 보호 슬라이드 보관하십시오. <ol><li> 고순도 물 혼합에 Duolink II의 증폭 주식 (5 배) 1:5 희석. 물 볼륨이 계정으로 단지 일까지 혼합을 추가하기 전에 1:80의 최종 희석에 추가됩니다 효소의 볼륨을 계산할 때E 웰스. </li><li> 슬라이드에서 내고 - Ligase 솔루션을 누릅니다. 1X 와시 버퍼에있는 슬라이드를 씻어 RT에서 교반과 코플린있는 항아리에 A 2 번 2 분 각. </li><li> 냉동 블록 (-20 ° C)를 사용하여 냉동고에서 효소를 가져가라. 1:80 희석과 와동의 증폭 솔루션 (7.1에서 준비)에 효소를 추가합니다. </li><li> 슬라이드에서 씻으 버퍼를 누르하고 증폭 - 효소 솔루션을 추가하는 것은 각 웰 (물론 40 μl /). 37 100 분 미리 가열 습도 챔버 ° C.에있는 슬라이드를 품어 </li></ol> 8. 이미징을위한 준비 참고 : 라이트 민감한 시약. 조명으로부터 보호 슬라이드 보관하십시오. <ol><li> 슬라이드에서 증폭 - 효소 솔루션을 누르고 RT에서 교반과 코플린있는 항아리에 1X Duolink II 워시 버퍼 B에 각 2 회 10 분에 대한 세척. </li><li> 0.1 X 와시 버퍼 B.에있는 슬라이드를 찍어 </li><li> 완전히 16 잘 슬라이드에서 실리콘을 제거합니다. coverslip에 DAPI와 매체를 장착 Duolink II의 ~ 40μl를 추가하고 부드럽게 약간하므로 커버 슬립 아래에서 기포가가 없다는 것을 그것을 눌러 샘플을 통해 그것을 놓으십시오. 수정 및 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 coverslip을 봉쇄. 영상을 계속하기 전에 적어도 15 분 기다립니다. </li><li> 공촛점 또는 형광 현미경으로 샘플을 분석할 수 있습니다. 디지털 이미지를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 9. 부량 참고 : 라이트 민감한 시약. 조명으로부터 보호 슬라이드 보관하십시오. <ol><li> 신호 레벨의 측정을 얻기 위해 이미지에 신호를 계산하는 Duolink ImageTool을 사용합니다. </li><li> 측정을 비교하고 그래프를 확인합니다. </li></ol> 10. 대표 결과 현장 플레 실험의에서 결과는 개별 형광 명소를 보여줍니다. 신호의 위치는 공부의 특정 단백질에 따라 달라집니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 원위치 괞찮아에서 BMP4 자극 후 Neuro2a 세포에. 셀 2 μm의 dorsomorphin (BMP 경로의 억제제) (A) 또는 25 NG / ML BMP4 취급했다 (B)에 대한 치료 60 분 또는 왼쪽 (CE). P-Smad1/5/8 및 Smad4에 대한 항체는 A와 B. 혼자 aP-Smad1/5/8 (C) 기본 항체와 A - Smad4 혼자 (D) 또는 기본 태만에의 적극적인 단지를 검색하는 데 사용되었다 항체 (E)는 컨트롤로 사용되었습니다. 블루 : DAPI, 빨간색 : 괞찮아 신호. 사진은 Leica SP5 공촛점 현미경과 함께 획득했다. (F) 괞찮아 신호는 Duolink ImageTool 소프트웨어로 간주되었으며 세포 당 핵에있는 명소의 평균 개수는 그래프에 표시됩니다. (G) Neuro2a 세포는 치료 왼쪽 또는 Dorsomorphin (2 μm의) 또는 60 분 BMP4 (25 NG / ML)로 처리되었습니다. 세포 lysed되었으며 단백질은 SDS - PAGE의 대상 및 제어를 로딩으로 aP-Smad1/5/8과 - PCNA와 immunoblotting에 의해 분석되었다. (*)가 아닌 특정 밴드. aP-Smad1/5/8 항체는 3 가지 단백질을 구별 수 없습니다이 Smad4 복잡한에 존재.

<ol><li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. one <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li>
<li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun%2FAP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun%2FFra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 Forthcoming.</li>
<li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li>
<li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor%2Fretinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li>
</ol>

이 비디오 문서의 생산은 근접 내고 분석 절차에 사용되는 시약을 만드는 사람 OLINK 후원했다.

현장에서 단백질 단지의 시각은 특히 단백질 상호 작용과 단백질 수정은 세포들은 표면에서 핵으로 신호를 보내기를 위해 사용하는 수단입니다 어디 신호의 연구, 큰 수요에있다. 그것은 전에 immunofluorescence과 함께 현장에서 두 내생 단백질 사이의 단지를 시각화하고 계량 가능한되지 않았습니다. 항체의 공동 지방화는 낮은 해상도를 전시하고 진정한 상호 작용을 시각화하는 데 사용할 수 없습니다. 플레은 연구자가 성공 6, 7과 다른 시스템에서 사용하기 시작한다는 새로운 기술입니다. 여기, 우리는 시간이 지남에 BMP의 자극의 하류 활성화 Smad effectors 사이의 내생 단지를 시각적으로뿐만 아니라 수치뿐만 아니라 괞찮아를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 Neuro2a이 (그림 1) 달성 종 (마우스 - Smad4와 토끼 aP-Smad1/5/8)에서 제기된 상업 항체에 의존을 포함한 다른 조직 문화 전지를 사용했습니다. 이 방법은 모든 Smad4와 활성화 단지에 종사하지 않을 수 있습니다 phosphorylated Smad1/5/8의 단지 존재가 아니라 시간이 지남에 따라 BMP 효과기 - 단지의 활성화를 참조하고, 처음으로 우리를 허용했다. 우리는 신호 (그림 1 층)을 계산하고 같은 세포 8 (그림 1G)의 immunoblot에서 얻은 부량로 측정을 비교했다. 우리는 반점의 수가 시간이 지남에 따라 레벨을 신호의 정확한 비교 측정을 제공 결론을 내렸다. 이 기술은 또한 유사한 결과를 다른 세포 라인 (HEK293T 및 Cos7) (데이터가 표시되지 않음)에 적용되었습니다. 기술의 원리는 Duolink 키트와 함께 제공되는 두 개의 정점이 프로브에 따라 달라집니다. 각 플레 프로브는 기자 역할을 독특한 합성 oligonucleotide에 연결된 보조 항체로 구성되어 있습니다. 프로브의 근접이 탐사선이 근접에 부착되는 정확한 위치에서 DNA의 결합을 허용합니다. DNA의 하이브리드화 및 내고 작은 (&lt;40nm) 및 그러므로 수있는 oligonucleotides의 거리, 상호 작용에만 단백질이 결합을 허용할 수 있습니다. 출혈도 잡았 DNA는 다음 증폭 및 증폭 순서 분류 oligonucleotides의 하이브리드화로 검색하실 수 있습니다. 증폭은 DNA - DNA의 하이브리드화 원칙에 따라 같은 특정되고 출혈도 잡았 DNA가 초기 내고 이벤트의 향상의 결과로 몇 배 증폭이므로 또한 고감도를 제공합니다. 증폭된 DNA는 레이블 oligonucleotides와 하이브리드화하여 검색하고 볼 수와 약간 큰 자리를 생산합니다. 반점이 계산 수 있듯이, 플레 신호의 정확한 공간 정보 (상호 작용 이벤트의 위치)뿐만 아니라, 이러한 이벤트를 2-4 quantifying의 객관적인 방법뿐만 아니라를 제공합니다. 단백질 상호 작용의 검출을 위해 고용하는 다른 기술은 공동 immunoprecipitation, immunofluoresence와 형광 공명 에너지 전송을 (무서워)가 있습니다. 공동 immunoprecipitation의 assays 널리 단백질 단지의 절연을 활성화하는 데 사용됩니다. 방법은 단백질을 감지하기 위해 상대적으로 높은 수준의 표현이어야합니다 즉 immunoblotting 함께합니다. 높은 배경이나 비즈 일부 단백질이 아닌 특정 바인딩의 문제는 종종 공동 immunoprecipitation에서 극복하기 어렵습니다. 또한, 공동 immunoprecipitation의 assays는 단백질 복합의 일부가 될 수있는 단백질의 검출을 허용하지만, 서로 물리적으로 상호 작용하는 매우 가까이에있는 이들을 구분할 수 없습니다. 또한, 공동 immunoprecipitations은 세포에서 단백질 단지의 지방화에 대한 단세포 해상도 또는 정보에 quantitation를 제공할 수 없습니다. immunofluoresence하여 셀 또는 셀 구획에 단백질 단지의 공동 존재의 감지 따라서 확산 신호의 중복에 기초하고있다, 낮은 공간 해상도를 가지고 있으며 단백질의 상호 작용에 대한 정확한 정보를 제공할 수 없습니다. 차이가 몇 배 이상이며, 정확한 또는 괞찮아 명소로 측정 수없는 경우에만 immunofluoresence 신호의 양을 정함은 Visual 추정하여이 작업을 수행할 수 있습니다. 안달 라이브 세포에 단백질 단지의 시각화를 허용하고 항체의 필요성과 에피토프의 노출을 극복. 그러나, 걱정은 보통 플레 같이 내생 단백질 단지를 반영하지 않을 수 있습니다 인공 융합 단백질의 overexpression에 따라 달라집니다. 플레 프로토콜 차단 조건 항​​체 집합이 발생하고 배경을 증가 수 있으므로 중요합니다. 대체 차단 조건은 항체 제품 시트에서 찾을 수 있습니다. 기본 및 보조 항체 누락과 함께 적절한 컨트롤이 잘못 됐을 수도 있습니다 어떤 정보를 제공하고 그들은 항상 포함해야합니다. 그들이 만날 때 그들이 단독으로 사용하는 이상의 배경과 최상의 신호를 제공합니다 다른 항체를 스크린하는 것이 중요합니다. 셀의 고정부족한 고정이 절차의 단계 동안 단백질 단지의 손실로 이어질 수 있습니다 반면,여 - 고정이 단백질 단지 완전히 변성 및 저하를 일으킬 수로인가가 중요합니다. 이것은 3 % 정착액의 농도를 낮추거나 고정 시간을 제한하여 제어할 수 있습니다. 그러나, 고정은 기본 항체가 변성 단백질 여부를 인식하는지 여부에도 달려 있습니다. 플레 기술은 매우 민감한이기 때문에, 특별한주의는 배양 시간 및 다른 샘플간에 동등한 마이크로 조건을 유지하기 위해 필요합니다. 샘플은 최종 단계 이전에 어떤 경우에 건조 왼쪽해서는 안됩니다. 샘플의 건조하면 증가 배경으로 이어질 수 있습니다. 차단 솔루션의 완전한 제거는 배경을 방지하기 위해 중요합니다. 낮은 온도가 효소 반응을 느리게으로 세척 버퍼는 항상 사용하기 전에 실온에 회부해야합니다. 추가 문제 해결을위한 키트의 설명서를 참조하십시오. 그것은 괞찮아 신호 (예 : DAPI, 굴지 등)의 하위 세포 현지화을 확인할 얼룩을 사용하는 데 유용합니다. 여기서 우리는 핵을 얼룩이 DAPI을 (장착 매체) 사용하고 있습니다. 플레은 셀 형식이나 세포 구획을 (여기에 표시되지 않음)를 확인하는 항체와 immunofluorescence의 사용과 호환됩니다. 정확한 양을 정함은 신호와 특정 소프트웨어 (Duolink 이미지 도구 Olink Biosience)의 사용을 계산하여이 작업을 수행할 수 있습니다. 고감도 사용하기 쉽고, 노 배경, 그리고 현장에서 신호 활성 BMP를 정할 수있는 독특한 능력 : 결론적으로 우리는 BMP가 고정된 세포의 신호 전달과 그 이점을 제시 감지 Duolink 키트를 사용하여 현장 괞찮아에 사용하는 방법을 증명하고있다. 다른 단백질 상호 작용을 연구하기 위해이 기술을 적용의 제한은 조사에 따라 단백질을 인식 차 항체의 가용성과 품질에 따라 달라집니다.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21710025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>AutogenBioclear</td><td>7.01</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산 (Non-essential Amino Acids)</td><td>Invitrogen</td><td>11149068</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 (Sodium Pyruvate)</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 (Penicillin / Streptomycin)</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 (L-glutamine)</td><td>Invitrogen</td><td>25030-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, EDTA 4Na 포함 0.05% (1X), 액체</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>16-well 챔버 슬라이드</td><td>Lab-Tek</td><td>178599</td><td></td></tr><tr><td>폴리리신 (Polysine)</td><td>VWR international</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>커버 글라스</td><td>VWR international</td><td>631-0138</td><td></td></tr><tr><td>a-pSmad1/5/8</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>a-Smad4 (B8)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-7966</td><td></td></tr><tr><td>도르소모르핀 (Dorsomorphin)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>171260-10MG</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 BMP-4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega Corp.</td><td>H5151</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II 검출 시약 (Orange)&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92007-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA 프로브 anti-Mouse MINUS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92004-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA 프로브 anti-Rabbit PLUS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92002-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">DAPI 포함 Duolink II 마운팅 매질&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82040-0005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II 형광 세척 완충액&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82049</td><td></td></tr></tbody></table>

효과기 - 단지에게 사용 bmp4의 다운 스트림 신호의 감지 현장에서 괞찮아, 근접 내고 분석

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs는 발달 및 생물 학적 효과의 광범위한 책임이 있습니다. BMP 수용체 다음, Smad4와 복잡한을 형성하고 그들이 BMP 특정 다운 스트림 효과 1 시작 전사 요소로 기능을 핵으로 이동시키다 (phosphorylate) Smad1/5/8 effectors를 활성화해야합니다. phospho - Smad의 펩티드에 대한 항체와 함께 전통적인 단백질 형광 기법은 낮은 감도, 높은 배경을 전시하고이 형광 감광성의 경우 그들이 특히 항체 신호의 강도에 의존하는 등 총 부량을 제공합니다. 또한, phospho - Smads 모든 Smad4 복잡한으로되지 않을 수 있으며 적극적인 녹​​음에 참여. 현장에서 플레은 높은 특이성과 민감도 2-4과 단백질 상호 작용을 검출 수있는 기술입니다. 단백질의 DNA를 대리의 증폭과 함께이 새로운 기술 커플 항체 인식. 그것은 인식 행사의 정확한 위치를 공개 장소의 형태로 지역화된, 이산 신호를 생성합니다. 신호의 수를 계산하고 측정을 제공 비교할 수 있습니다. 우리는이 신호만을 발생하는 복잡한에 근접 즉,에있는 경우에만 BMP 신호 effectors phospho-Smad1/5/8 및 Smad4의 감지를 허용 항체의 조합으로 Duolink 키트를 사용하여 현장 플레 적용 활성화. 이것은 처음 BMP4 자극 아래 시간 코스 실험에서 높은 특이성과 민감도와 신호 내생 BMP의 시각화 및 측정에 대한 허용.

여기 우리는 뼈 Morphogenetic의 단백질 (BMP) 고정 세포에 신호를 시각화하는 항체의 조합과 근접 내고 분석 (괞찮아)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 BMP4 자극을 아래에 효과기 - 단지를 활성화 내생 BMP의 핵 축적에 따라 자신의 수준 시간이 지남에를 정할 수있었습니다.

효과기 - 단지에게 사용 BMP4의 다운 스트림 신호의 감지 현장에서 괞찮아, 근접 내고 분석

BMP는 광범위한 발달 및 생물학적 효과를 담당합니다. BMP 수용체는 Smad1/5/8 작동체(effector)를 활성화(인산화)하며, 이후 이들은...

다음 실험의 전반적인 목표는 조직 배양 세포에서 BMP 신호 전달을 시각화하고 정량화하는 것입니다. BMP는 세포 표면의 수용체에 결합하여 세 가지 smad 이펙터인 smad 1, smad 5 및 SMAD 8을 인산화합니다. 이들은 smad 4와 복합체를 형성하여 핵으로 이동하며, 그곳에서 전사를 조절합니다.본 실험에서는 BMP 자극 여부에 따른 조직 배양 세포 내 내인성 SMA 작동체와 smad four 사이에 형성되는 복합체를 시각화하기 위해 PLA를 사용합니다. 먼저 두 종류의 1차 항체를 병행하여 사용하는데, 하나는 인산화된 세 가지 smma 작동체를 모두 인식하고, 다른 하나는 smad four를 인식합니다. PLA 프로브라고 불리는 2차 항체는 각각 고유한 짧은 DNA 가닥이 부착되어 있으며, 이들이 1차 항체에 결합하여 PLA 프로브들이 서로 근접하게 위치하게 됩니다. 이후 두 개의 원형 형성 DNA 올리고뉴클레오타이드를 추가하면 DNA 가닥들이 서로 상호작용합니다.이들은 효소적 결합(ligation)을 통해 서로 연결되어 원형을 형성하며, 증폭 반응 후 롤링 서클 복제(rolling circle replication)를 통해 증폭됩니다. 표지된 상보적 올리고뉴클레오타이드 프로브의 하이브리드화를 통해 각 원형화된 DNA 산물의 증폭과 관련된 형광 반점이 강조되어 쉽게 확인할 수 있습니다.형광 현미경으로 관찰했을 때, 반점들은 effector, seds 및 smad four 사이의 복합체에 해당하며, 이는 세포 내에서 BMP 신호 전달이 활성화되었음을 나타냅니다. 기존 방법들과 비교하여 PLA의 주요 장점은 사용이 간편하고 민감도가 높으며 배경 신호가 없다는 점이며, 이를 통해 in situ에서 활성 BMP 신호 전달을 정량화할 수 있다는 것입니다. BMP 경로는 여러 장기와 조직의 발달뿐만 아니라 줄기세포의 증식 및 분화를 포함한 과정에 필수적입니다.PLA는 BMP 신호 전달의 역학, 수준 및 세포 내 국소화에 관한 핵심 질문을 해결하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 진단 목적으로도 활용 가능합니다. 이 경로는 여러 질환의 근간이 되므로, BLA를 사용하여 BMP 또는 다른 경로의 다른 신호 전달 구성 요소를 연구할 수 있으며, 조직 절편이나 전체 배아에 적용하도록 최적화할 수 있습니다. 인 시튜 근접 결찰 분석(in situ proximity ligation assay)을 시작하기 위해 세포 배양을 준비하십시오. Neuro 2A 세포는 10% FBS, 1배 농도의 비필수 아미노산, 1배 농도의 피루브산 및 1배 농도의 L-글루타민이 첨가된 GMEM에서 배양합니다.트립신을 사용하여 세포를 분리하고, 웰당 15,000에서 20,000개의 세포를 접종합니다. 16웰 챔버 슬라이드에 담긴 세포를 습도가 유지되는 5% carbon dioxide 배양기에서 37 °C로 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후.대조군의 경우, 배양액을 보충된 무혈청 GMEM으로 교체하고 2~3시간 더 배양합니다. 두 번째 배양 후, 세포가 담긴 3개의 웰을 일반 배양 조건에서 유지합니다. 2 µM dorsamorphine을 처리하여 BMP 경로를 억제하거나, BMP 4를 10~60분 동안 처리하여 신호를 유도합니다.세포 자극 후, 웰에서 배지를 흡입하고 세포가 떨어지지 않도록 PBS로 부드럽게 세척합니다. PBS를 세포 위에 직접 피펫팅하지 마십시오. 그런 다음 PBS를 흡입하고 챔버를 제거하되, 웰 주변의 실리콘은 그대로 둡니다.새로 준비하여 필터링한 4% para formaldehyde 50 µL를 웰에 넣고, 교반 없이 실온에서 10분 동안 배양합니다. 고정 후, 코핀 자(copin jar)에서 교반하며 실온에서 PBS로 5분 동안 세포를 세척합니다. 이 세척 과정을 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척합니다.다음으로, 코핀 자(copin jar)에서 PBS에 0.5% Triton X 100을 희석한 용액으로 세포를 투과성 있게 처리하고, 교반 없이 상온에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, 커플링 자(coupling jar)에서 0.05% Tween 20과 TBS로 세포를 3회 세척하며, 각 세척 단계마다 교반하며 5분 동안 진행합니다. 슬라이드를 가볍게 두드려 마지막 세척액을 제거함으로써 블로킹 과정을 시작합니다.세포가 건조되지 않도록 주의하십시오. 각 웰에 DUO link 한 방울을 블로킹 용액에 추가합니다. 증류수가 담긴 빈 피펫 팁 박스로 구성된 예열된 습윤 챔버에서 37 °C로 30분 동안 세포를 블로킹 용액에 배양합니다.1차 항체 용액을 준비하려면 anti phospho smad 1 5 8 및 anti SMAD four를 DuoLink 2 항체 희석액에 1:100으로 희석하십시오. 각 항체를 단독으로 또는 조합하여 사용합니다. 이제 슬라이드를 가볍게 두드려 블로킹 용액을 제거하고, 해당 웰에 항체 용액 40 µL를 첨가합니다. 희석액만 사용하는 음성 대조군을 포함할 수 있습니다.세포가 건조되지 않도록 이 단계를 빠르게 수행하십시오. 이제 슬라이드를 미리 가열된 습윤 챔버에서 37 °C로 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 두 종류의 PLA 프로브를 희석액에 희석하십시오.각 반응 혼합물에 대해 각 프로브 8 µL와 희석액 24 µL를 섞어 프로브가 용액 내에서 1:5로 희석되도록 합니다. 1시간의 배양 후, 1차 항체 용액을 따라내고 슬라이드를 Duo link to Wash Buffer a로 실온에서 교반기가 포함된 커플링 자(coupling jar) 내에서 5분씩 두 번 세척합니다. 세척이 완료되면 슬라이드에 남아있는 Wash Buffer A를 따라내고 각 슬라이드에 PLA 프로브 용액 40 µL를 추가합니다.이제 슬라이드를 37 °C로 예열된 습윤 챔버에서 배양하십시오. 1시간 동안 DuoLink ligation stock을 처리하고 ligation mix를 위한 볼륨을 준비합니다. 먼저 DuoLink ligation stock을 vortexing한 후, high purity water로 1배 희석하십시오.Ligase 효소가 이 용액에 1:40 비율로 첨가되며, 웰당 40 µL의 혼합액이 필요하다는 점을 고려하십시오. 배양 후, 슬라이드에서 PLA probe 용액을 털어내고 Wash Buffer로 두 번 세척하십시오. 마지막 세척 시에는 결합 용기(coupling jar)를 이용하여 실온에서 5분 동안 교반하며 세척하십시오. Duo link Ligase를 냉동 블록에 꺼내어 ligation 용액에 최종 희석 배율 1:40이 되도록 첨가한 후 Vortex 하십시오.이제 슬라이드에서 Wash Buffer A의 최종 부피를 털어내고, ligation 혼합물 40 µL를 첨가합니다. 각 슬라이드에 효소가 섞이도록 잘 혼합합니다. 예열된 습도 챔버에서 슬라이드를 30분 동안 배양합니다.37°C에서 DUO link 증폭 스톡을 해동하고, DUO Link 증폭 스톡을 고순수수로 1배 희석하여 배양 중 증폭 단계를 위한 준비를 합니다. 시약은 빛에 민감하므로 차광 보관하십시오. 라이게이션 단계가 완료되면 용액을 제거하고, 상온에서 교반 장치가 있는 커플링 자를 사용하여 슬라이드를 Wash Buffer A로 2분씩 2회 세척합니다. 마지막 세척 중에 amplification solution에 duo link polymerase를 최종 희석 배수 1:280이 되도록 첨가하고 볼텍싱합니다. 세척 버퍼를 제거한 후, 각 웰에 증폭 혼합물 40 µL를 첨가하고 37°C로 예열된 암실 습도 챔버에서 100분 동안 슬라이드를 배양합니다.증폭 배양이 완료되면 슬라이드에서 폴리머라아제 용액을 털어내고, 결합 용기(coupling jar)를 이용해 Wash buffer B로 10분씩 두 번 세척합니다. 이때 시약이 빛에 민감하므로 세척 단계 동안 슬라이드가 빛에 노출되지 않도록 주의하십시오. 두 번의 세척 후 0.1배 희석된 wash buffer B에 담급니다. 이제 16-well 슬라이드에서 실리콘을 완전히 제거한 다음, duo 40 µL를 약 40 µL씩 첨가합니다.커버슬립에 마운팅 매질을 묻혀 샘플 위에 조심스럽게 덮고, 커버슬립 아래에 기포가 생기지 않도록 살짝 누릅니다. 네일 폴리시를 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 고정하고 밀봉한 후, 이미징 전 최소 15분 동안 기다립니다. 이는 BMP 경로 억제제인 2 µM dorsa morphine으로 처리하거나 25 ng/mL BMP four로 60분 동안 처리한 세포의 공초점 이미지입니다.Phospho Smad 1 58 및 Smad 4에 대한 항체를 사용하여 활성 smad 복합체를 검출하였으며, 이는 적색 점으로 나타납니다. 세포핵은 dpi에 의해 청색으로 염색되었습니다. PLA 신호는 DUO link image tool 소프트웨어를 사용하여 측정하였으며, 세포당 핵 내 평균 점의 수를 그래프로 나타내었습니다.어느 한 쪽의 1차 항체만 단독으로 사용했을 때는 염색이 관찰되지 않으며, 이는 PLA 프로브의 배경 신호나 이후의 올리고뉴클레오타이드 결합이 일어나지 않았음을 나타냅니다. 마찬가지로, 두 1차 항체를 모두 생략한 또 다른 음성 대조군에서도 점이 검출되지 않았습니다. neuro two A 세포의 SDS page 면역 블로팅 결과, 처리하지 않은 세포와 BMP 처리 세포 모두에서 인산화된 SMAD 1 5 8이 확인되었습니다.하지만 배측 모르핀으로 처리한 세포에서는 phospho smad의 수준이 현저히 감소했습니다. PCNA에 대한 항체는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 세포 고정 후 6시간 이내에 결과를 얻기 위해 우리가 제안하는 단계와 설정을 어떻게 수행해야 하는지 충분히 이해하시게 될 것입니다.요약하자면, 단계는 1차 항체 배양을 위한 블로킹, PLA 프로브 배양, 결합 증폭, 마운팅 및 이미징 순으로 진행됩니다.

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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