효과기 - 단지에게 사용 BMP4의 다운 스트림 신호의 감지 현장에서 괞찮아, 근접 내고 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 조직 배양 세포에서 BMP 신호 전달을 시각화하고 정량화하는 것입니다. BMP는 세포 표면의 수용체에 결합하여 세 가지 smad 이펙터인 smad 1, smad 5 및 SMAD 8을 인산화합니다. 이들은 smad 4와 복합체를 형성하여 핵으로 이동하며, 그곳에서 전사를 조절합니다.

본 실험에서는 BMP 자극 여부에 따른 조직 배양 세포 내 내인성 SMA 작동체와 smad four 사이에 형성되는 복합체를 시각화하기 위해 PLA를 사용합니다. 먼저 두 종류의 1차 항체를 병행하여 사용하는데, 하나는 인산화된 세 가지 smma 작동체를 모두 인식하고, 다른 하나는 smad four를 인식합니다. PLA 프로브라고 불리는 2차 항체는 각각 고유한 짧은 DNA 가닥이 부착되어 있으며, 이들이 1차 항체에 결합하여 PLA 프로브들이 서로 근접하게 위치하게 됩니다. 이후 두 개의 원형 형성 DNA 올리고뉴클레오타이드를 추가하면 DNA 가닥들이 서로 상호작용합니다.

이들은 효소적 결합(ligation)을 통해 서로 연결되어 원형을 형성하며, 증폭 반응 후 롤링 서클 복제(rolling circle replication)를 통해 증폭됩니다. 표지된 상보적 올리고뉴클레오타이드 프로브의 하이브리드화를 통해 각 원형화된 DNA 산물의 증폭과 관련된 형광 반점이 강조되어 쉽게 확인할 수 있습니다.

형광 현미경으로 관찰했을 때, 반점들은 effector, seds 및 smad four 사이의 복합체에 해당하며, 이는 세포 내에서 BMP 신호 전달이 활성화되었음을 나타냅니다. 기존 방법들과 비교하여 PLA의 주요 장점은 사용이 간편하고 민감도가 높으며 배경 신호가 없다는 점이며, 이를 통해 in situ에서 활성 BMP 신호 전달을 정량화할 수 있다는 것입니다. BMP 경로는 여러 장기와 조직의 발달뿐만 아니라 줄기세포의 증식 및 분화를 포함한 과정에 필수적입니다.

PLA는 BMP 신호 전달의 역학, 수준 및 세포 내 국소화에 관한 핵심 질문을 해결하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 진단 목적으로도 활용 가능합니다. 이 경로는 여러 질환의 근간이 되므로, BLA를 사용하여 BMP 또는 다른 경로의 다른 신호 전달 구성 요소를 연구할 수 있으며, 조직 절편이나 전체 배아에 적용하도록 최적화할 수 있습니다. 인 시튜 근접 결찰 분석(in situ proximity ligation assay)을 시작하기 위해 세포 배양을 준비하십시오. Neuro 2A 세포는 10% FBS, 1배 농도의 비필수 아미노산, 1배 농도의 피루브산 및 1배 농도의 L-글루타민이 첨가된 GMEM에서 배양합니다.

트립신을 사용하여 세포를 분리하고, 웰당 15,000에서 20,000개의 세포를 접종합니다. 16웰 챔버 슬라이드에 담긴 세포를 습도가 유지되는 5% carbon dioxide 배양기에서 37 °C로 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후.

대조군의 경우, 배양액을 보충된 무혈청 GMEM으로 교체하고 2~3시간 더 배양합니다. 두 번째 배양 후, 세포가 담긴 3개의 웰을 일반 배양 조건에서 유지합니다. 2 µM dorsamorphine을 처리하여 BMP 경로를 억제하거나, BMP 4를 10~60분 동안 처리하여 신호를 유도합니다.

세포 자극 후, 웰에서 배지를 흡입하고 세포가 떨어지지 않도록 PBS로 부드럽게 세척합니다. PBS를 세포 위에 직접 피펫팅하지 마십시오. 그런 다음 PBS를 흡입하고 챔버를 제거하되, 웰 주변의 실리콘은 그대로 둡니다.

새로 준비하여 필터링한 4% para formaldehyde 50 µL를 웰에 넣고, 교반 없이 실온에서 10분 동안 배양합니다. 고정 후, 코핀 자(copin jar)에서 교반하며 실온에서 PBS로 5분 동안 세포를 세척합니다. 이 세척 과정을 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척합니다.

다음으로, 코핀 자(copin jar)에서 PBS에 0.5% Triton X 100을 희석한 용액으로 세포를 투과성 있게 처리하고, 교반 없이 상온에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, 커플링 자(coupling jar)에서 0.05% Tween 20과 TBS로 세포를 3회 세척하며, 각 세척 단계마다 교반하며 5분 동안 진행합니다. 슬라이드를 가볍게 두드려 마지막 세척액을 제거함으로써 블로킹 과정을 시작합니다.

세포가 건조되지 않도록 주의하십시오. 각 웰에 DUO link 한 방울을 블로킹 용액에 추가합니다. 증류수가 담긴 빈 피펫 팁 박스로 구성된 예열된 습윤 챔버에서 37 °C로 30분 동안 세포를 블로킹 용액에 배양합니다.

1차 항체 용액을 준비하려면 anti phospho smad 1 5 8 및 anti SMAD four를 DuoLink 2 항체 희석액에 1:100으로 희석하십시오. 각 항체를 단독으로 또는 조합하여 사용합니다. 이제 슬라이드를 가볍게 두드려 블로킹 용액을 제거하고, 해당 웰에 항체 용액 40 µL를 첨가합니다. 희석액만 사용하는 음성 대조군을 포함할 수 있습니다.

세포가 건조되지 않도록 이 단계를 빠르게 수행하십시오. 이제 슬라이드를 미리 가열된 습윤 챔버에서 37 °C로 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 두 종류의 PLA 프로브를 희석액에 희석하십시오.

각 반응 혼합물에 대해 각 프로브 8 µL와 희석액 24 µL를 섞어 프로브가 용액 내에서 1:5로 희석되도록 합니다. 1시간의 배양 후, 1차 항체 용액을 따라내고 슬라이드를 Duo link to Wash Buffer a로 실온에서 교반기가 포함된 커플링 자(coupling jar) 내에서 5분씩 두 번 세척합니다. 세척이 완료되면 슬라이드에 남아있는 Wash Buffer A를 따라내고 각 슬라이드에 PLA 프로브 용액 40 µL를 추가합니다.

이제 슬라이드를 37 °C로 예열된 습윤 챔버에서 배양하십시오. 1시간 동안 DuoLink ligation stock을 처리하고 ligation mix를 위한 볼륨을 준비합니다. 먼저 DuoLink ligation stock을 vortexing한 후, high purity water로 1배 희석하십시오.

Ligase 효소가 이 용액에 1:40 비율로 첨가되며, 웰당 40 µL의 혼합액이 필요하다는 점을 고려하십시오. 배양 후, 슬라이드에서 PLA probe 용액을 털어내고 Wash Buffer로 두 번 세척하십시오. 마지막 세척 시에는 결합 용기(coupling jar)를 이용하여 실온에서 5분 동안 교반하며 세척하십시오. Duo link Ligase를 냉동 블록에 꺼내어 ligation 용액에 최종 희석 배율 1:40이 되도록 첨가한 후 Vortex 하십시오.

이제 슬라이드에서 Wash Buffer A의 최종 부피를 털어내고, ligation 혼합물 40 µL를 첨가합니다. 각 슬라이드에 효소가 섞이도록 잘 혼합합니다. 예열된 습도 챔버에서 슬라이드를 30분 동안 배양합니다.

37°C에서 DUO link 증폭 스톡을 해동하고, DUO Link 증폭 스톡을 고순수수로 1배 희석하여 배양 중 증폭 단계를 위한 준비를 합니다. 시약은 빛에 민감하므로 차광 보관하십시오. 라이게이션 단계가 완료되면 용액을 제거하고, 상온에서 교반 장치가 있는 커플링 자를 사용하여 슬라이드를 Wash Buffer A로 2분씩 2회 세척합니다. 마지막 세척 중에 amplification solution에 duo link polymerase를 최종 희석 배수 1:280이 되도록 첨가하고 볼텍싱합니다. 세척 버퍼를 제거한 후, 각 웰에 증폭 혼합물 40 µL를 첨가하고 37°C로 예열된 암실 습도 챔버에서 100분 동안 슬라이드를 배양합니다.

증폭 배양이 완료되면 슬라이드에서 폴리머라아제 용액을 털어내고, 결합 용기(coupling jar)를 이용해 Wash buffer B로 10분씩 두 번 세척합니다. 이때 시약이 빛에 민감하므로 세척 단계 동안 슬라이드가 빛에 노출되지 않도록 주의하십시오. 두 번의 세척 후 0.1배 희석된 wash buffer B에 담급니다. 이제 16-well 슬라이드에서 실리콘을 완전히 제거한 다음, duo 40 µL를 약 40 µL씩 첨가합니다.

커버슬립에 마운팅 매질을 묻혀 샘플 위에 조심스럽게 덮고, 커버슬립 아래에 기포가 생기지 않도록 살짝 누릅니다. 네일 폴리시를 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 고정하고 밀봉한 후, 이미징 전 최소 15분 동안 기다립니다. 이는 BMP 경로 억제제인 2 µM dorsa morphine으로 처리하거나 25 ng/mL BMP four로 60분 동안 처리한 세포의 공초점 이미지입니다.

Phospho Smad 1 58 및 Smad 4에 대한 항체를 사용하여 활성 smad 복합체를 검출하였으며, 이는 적색 점으로 나타납니다. 세포핵은 dpi에 의해 청색으로 염색되었습니다. PLA 신호는 DUO link image tool 소프트웨어를 사용하여 측정하였으며, 세포당 핵 내 평균 점의 수를 그래프로 나타내었습니다.

어느 한 쪽의 1차 항체만 단독으로 사용했을 때는 염색이 관찰되지 않으며, 이는 PLA 프로브의 배경 신호나 이후의 올리고뉴클레오타이드 결합이 일어나지 않았음을 나타냅니다. 마찬가지로, 두 1차 항체를 모두 생략한 또 다른 음성 대조군에서도 점이 검출되지 않았습니다. neuro two A 세포의 SDS page 면역 블로팅 결과, 처리하지 않은 세포와 BMP 처리 세포 모두에서 인산화된 SMAD 1 5 8이 확인되었습니다.

하지만 배측 모르핀으로 처리한 세포에서는 phospho smad의 수준이 현저히 감소했습니다. PCNA에 대한 항체는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 세포 고정 후 6시간 이내에 결과를 얻기 위해 우리가 제안하는 단계와 설정을 어떻게 수행해야 하는지 충분히 이해하시게 될 것입니다.

요약하자면, 단계는 1차 항체 배양을 위한 블로킹, PLA 프로브 배양, 결합 증폭, 마운팅 및 이미징 순으로 진행됩니다.