의 복합 식물의 생성 Medicago truncatula 유괴의 Assays 사용

안녕하세요, 저는 Dan 식물 과학 센터의 Oliver Yu입니다. 오늘은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용해 Ute Compote 식물을 생성하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 기술은 현재 오하이오 주립대학교에 재직 중인 Chris Taylor 박사에 의해 Dan 센터에 도입되었습니다.

지난 수년간 저의 이전 그룹 멤버 여러 명이 이 기술들을 개선해 왔으며, 현재 그룹 멤버인 Stone 박사와 Mao가 Harry Root Composite Plants가 어떻게 제작되는지 보여주기 위해 이 영상을 제작했습니다. Agrobacterium ZOS는 외래 DNA를 식물에 도입한다는 점에서 agrobacterium tumor fis와 매우 유사하지만, ZOS는 야생형 조직의 더 높은 뿌리 형성을 유도하여 이와 같은 복합 식물을 형성할 수 있습니다. 따라서 이러한 복합 식물에서는 일부 뿌리는 형질전환된 상태인 반면, 지상부는 여전히 야생형입니다.

따라서 이 기술은 형질 전환 종자를 생성하지 않습니다. 하지만, 고효율 뿌리 캠비움 식물을 이용하는 것에는 이 기술을 매우 유용하게 만드는 세 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 많은 식물 종, 특히 쌍자엽 식물 종은 아그로박테리움(agro bacterial ous)에 의해 형질 전환될 수 있습니다.

둘째로, 형질전환 전에 조직 배양을 확립할 필요가 없습니다. 유묘, 줄기, 뿌리 등 식물의 여러 부위를 이용하여 직접적으로 형질전환 식물을 생성할 수 있습니다. 마지막으로, 수주 이내에 형질전환된 뿌리 조직을 얻을 수 있습니다.

대두와 메디카고(medicargo) 형질전환의 경우, OPIS 형질전환보다 최대 3주 더 빠르게 형질전환 뿌리를 얻을 수 있습니다. 전반적으로, 고효율 뿌리 세포 식물 기술은 유전자 기능과 뿌리 관련 표현형을 연구하는 데 매우 유용한 도구입니다. 안녕하세요, 제 이름은 Ong입니다.

안녕하세요, 제 이름은 [이름]이며, 여기 촬영 담당 빌이 있습니다. 오늘은 Harry root 복합 식물 프로토콜을 소개해 드리겠습니다. 네, 저희는 여러 프로젝트에서 이 프로토콜을 사용하고 있습니다.

이미 시작했습니다. 네. 시연을 위해 meta cargo Tula를 예로 사용하겠습니다. 이것들은 meta cargo 성숙 꼬투리입니다.

꼬투리를 분쇄 상자에 넣고 길고 강한 동작으로 분쇄합니다. 꼬투리를 가볍게 흔들어 씨앗을 분리한 후, 씨앗을 50 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다. 그런 다음 5 milliliter의 진한 황산을 첨가합니다.

매우 주의해서 스캐닝합니다. 약 10분이 소요됩니다. 튜브를 2~3회 정도 가볍게 섞어줍니다.

산 처리 과정 동안 종피는 노란색으로 변합니다. 튜브에서 황산을 제거하고 멸균수로 종자를 최소 5회 헹굽니다. 종자를 실온의 탈이온수에 6시간 동안 담근 후, 4°C에서 2일 동안 보관합니다.

발아 시기를 맞추기 위해, 20~30개의 씨앗을 페트리 접시의 젖은 여과지 위에 펼쳐 놓습니다. 5~6일 후, 발아한 씨앗을 토양으로 옮기고 온실에서 4주 동안 재배합니다.

복합 식물 형질전환을 위해, 일반적으로 agrobacterium Zony K 5 99 균주를 사용합니다. 셔틀 벡터 또는 바이너리 벡터는 표준 agrobacterium tumor facit 형질전환 프로토콜에 따라 K 5 99로 형질전환될 수 있습니다. agrobacterium을 접종하고, 30 °C에서 16~24시간 동안 배양합니다. 배양 기간이 지난 후, 배양액을 50 mL 원심분리 튜브에 넣어 세포를 수집합니다.

원심분리기를 사용하여 5,000 G에서 30분 동안 원심분리합니다. 펠렛을 질소 제거 영양액으로 재현탁합니다. 아그로박테리움 세포를 OD 600 기준 0.3으로 희석하십시오.

이 농도는 최대 형질전환을 위해 중요합니다. 지지 매트릭스로 암벽(rock wall)을 사용합니다. 고빈도 형질전환을 위해서는 이 재료를 사용하는 것이 중요합니다.

암벽을 적절한 크기로 자릅니다. 플러그의 상단에 지름 약 1.5~2cm의 구멍을 뚫습니다. 피펫 팁을 사용하여 각 플러그에 Resuspended Agrobacterium Zony 용액 5mL를 첨가합니다.

2~3개의 측아(auxiliary buds)가 있는 줄기 절편을 선택하여 사선으로 자릅니다. 식물 절편을 암벽 구멍에 삽입합니다. 절단된 식물을 성장 챔버나 실험대 위에 3주 동안 둡니다.

10일마다 각 플러그에 영양액 5 mL를 첨가합니다. 3주 후, 절단면에서 뿌리가 재생됩니다. 식물을 물에 담급니다.

뿌리가 손상되지 않도록 주의하며 부드러워진 암벽을 조심스럽게 제거하십시오. 암벽을 완전히 제거해야 합니다. 모상근 복합 식물을 모래나 펄라이트로 옮길 수 있습니다. 공생 실험을 위해, 리조비움을 효모 추출물 매니토 배지에서 30 °C로 7일 동안 배양하십시오.

zoia 세포를 수집하여 재현탁합니다. 펠렛을 질소 제거 영양 용액으로 현탁합니다. 용액을 OD 600 기준 0.08까지 희석합니다.

각 복합 식물 배양액에 ZOA 용액 10 milliliters를 첨가하고, 뿌리혹이 형성될 수 있도록 식물을 2~3주 더 배양합니다. 복합 식물을 뿌리째 뽑아 세척하여 모래를 제거합니다. 녹색 형광 단백질 발현을 이용하여 형질전환된 뿌리를 확인합니다.

이를 위해 형광 현미경을 사용합니다. 모든 모상근 컨스트럭트에는 형질전환 라인을 선별하기 위한 구성적 GFP 카세트가 포함되어 있습니다. 이 사진은 형광 현미경으로 관찰한 GFP 형질전환 모상근 복합 식물을 보여줍니다.

더 밝은 녹색 형광을 띠는 형질전환 뿌리는 비형질전환 뿌리와 쉽게 구별할 수 있습니다. 복합 식물의 모상근에는 뿌리혹이 형성됩니다. 여기 전체 프로토콜이 있습니다.

다시 한번 강조하자면, 모상근 복합 식물체를 생성하는 것은 특히 이배체 종에서 다량의 형질전환 조직을 얻을 수 있는 빠르고 쉬운 방법입니다. 이 방법으로는 형질전환 종자를 얻을 수는 없지만, 몇 주 만에 형질전환 물질을 생산할 수 있습니다. 이는 조직 배양 및 형질전환 확립에 어려움이 있는 식물에 특히 적합합니다.

수년간 저희는 이 기술을 사용하여 유전자 기능, 프로모터 기능, microRNA, 뿌리 및 측근 발달, 방어 및 항생제 스트레스 반응, 근절 형성 및 기타 공생 과정을 연구해 왔습니다. 또한 상부 뿌리 복합 식물을 이용하여 호르몬 반응, 대사체 프로파일링, 유전자 프로파일링 및 단백질체 분석을 수행하였습니다. 이 영상이 여러분이 선호하는 종에 이 시스템을 적용하는 데 도움이 되기를 바랍니다.

본 기술과 관련된 문의 사항이 있으시면 언제든지 연락해 주시기 바라며, 좋은 결과가 있으시길 바랍니다.