Name: 의 분리 Drosophila melanogaster Testes (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 13 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 수컷 고환 분리 방법을. 냉각 PBS와 해부 바늘을 사용하여 1분 이내에 신속하게 고환을 분리하고 RNA 및 단백질 분석을 위한 조직을 확보하는 효율적인 기술을 익히세요.

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저자는 우리 실험실에이 기술을 소개하는 Vasia Vagin 감사합니다.

<ol><li> 검은 배경과 유리 현미경 슬라이드 만들기 : 현미경 슬라이드와 같은 크기 20 # 백서 컷. 슬라이드 크기 용지 검은 색상의 한쪽 (예, 샤피) 영구 마커를 사용합니다. 검은 측면에 흰색 접착제 (엘머의)를 적용하고 슬라이드에 종이를 준수합니다. 슬라이드 활용할 수 있습니다. 사용 어 "라벨 테이프 (Fisherbrand)가, 장소에서 문제를 해결하기 위해 CO 2 비행 패드로, 최대 현미경 슬라이드, 유리 쪽을 확보. </li><li> 0~3일 오래된 남성의 파리를 수집합니다. </li><li> 얼음 통을 준비, 호수 (PBS), 해부 바늘을 인산 버퍼. </li><li> CO 2의 스트림을 사용하여 50-100 파리 마취시키다과 현미경 슬라이드 근처에 날아 패드로 병이나 유리병에서 그들을 전송. </li><li> 피펫 ~ 현미경 슬라이드 중간에 드롭 50 μl 얼음처럼 차가운 PBS. </li><li> 부드럽게과 남성 파리를 데리러 해부 바늘 수영 PBS의 드롭에 바늘 장소 그걸로 비행의 PBS, 부드러운 터치 복부 측면 (날개 근처 즉,)로 해부 바늘. </li><li> 확고하게 아래로 밀어, 흉부와 복부 사이의 비행 가운데 하나 주사를 놓으십시오. 여섯 번째 (A6) 그리고 일곱 번째 (A7) 복부 세그먼트 (바닥에서 두 번째와 세 번째 줄무늬) 사이의 다른 바늘을 플레이스, 멀리 흉부에서 복부를 가져옵니다. </li><li> 떨어져 특히 다른 기관, 창자에서 testes을 괴롭혀. 특히 흰색 돌연변이에 testes과 용기 비슷. 주요 차이점은 항상 쌍으로 와서 testes 해당되며 각 testis는 나선형 패턴을 보유하고 용기를보다 색상이 더 흰색이다. </li><li> 폴리 프로필렌의 microcentrifuge 관에서 얼음처럼 차가운 PBS에 testes를 저장합니다. </li></ol> 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2641/2641fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. flybase.org/reports/FBim0000074.html에서 남성의 생식 시스템의 도설보기. Flybase 저작자 :... "밀러 (1950) 페이지에서 508의 그림 38 후 A. 밀러 Drosophila melanogaster의 성충의 내부 해부학과 조직학 M. Demerec, 편집기, Drosophila, 6 장, 페이지 420의 생물학 - 534. 콜드 스프링 하버 연구소 보도 자료, 팩시밀리 판, 1994. 콜드 스프링 하버 연구소 보도 자료에 의해 ​​저작권 1994. 콜드 스프링 하버 연구소 (CSHL)에서 친절한 허가 보도와 함께 사용 참조. <a href="http://www.cshlpress.com">http://www.cshlpress.com을</a> . "

<ol><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+Techniques+for+Studying+the+Drosophila+Male+Germline+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell.</a> Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 성인 남자 Drosophila melanogaster에서 testes을 분리하는 프로토콜을 제공합니다. 기술은 하나 두 손으로 조정이 필요하기 때문에, 기술은 연습이 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>해부용 바늘</td><td>도구</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17346</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, 일반형</td><td>도구</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553</td><td></td></tr><tr><td>현미경 조명</td><td>도구</td><td>Schott AG</td><td>KO-1500</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 패드</td><td>도구</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 Flowbuddy 완제품 시스템</td><td>도구</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td></td></tr><tr><td>버블 가습기</td><td>도구</td><td>Salter Labs</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>볼 필러 바늘</td><td>도구</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#190;&amp;#8221; 라벨 테이프</td><td>소모품</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

의 분리 drosophila melanogaster testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster의 testes은 줄기 세포 유지 보수 및 차별화, 감수 분열, 그리고 소마 germline 상호 작용 연구를위한 중요한 모델을 제공합니다. Testes는 일반적으로 0-3일 pupal 사건에서 eclosion 후 성인 남성으로부터 격리됩니다. 야생 형 파리의 testes 쉽게 그들이 노란색이기 때문에 다른 조직의 구별하지만 흰색 돌연변이 파리의 testes은 실험실 실험에 대한 일반적인 유전적 배경은 파리 창자로 모양과 색상이 모두 비슷합니다. 검은 배경과 유리 현미경 슬라이드에 절개를 수행하면 상당히 쉽게 testes을 식별합니다. Testes는 해부 바늘을 사용하여 파리에서 제거됩니다. testes의 해부에 대한 집게를 사용하는 프로토콜에 비해, 우리의 방법은 잘 연습 개인 400-600 testes을 항복, 시간 당 200-300 야생 형 파리에서 testes을 해부하다 수 있도록, 훨씬 빠른 것입니다. 흰색 벌레 또는 testes 크기를 줄일 돌연변이에서 Testes는 해부하다 일반적으로 시간당 200-400 testes를 얻을 수 어렵습니다.

Drosophila melanogaster의 testes 신속하게하고 효율적으로 해부 바늘을 사용하여 성인 남성에서 격리 수 있습니다. 연습, 하나는 쉽게 하나 또는 두 일 이내에 항체 또는 효소 기반 assays 높은 처리량 시퀀싱 이상의 전통적인 분자 생물학의 방법으로 DNA 또는 RNA의 분석 또는 단백질의 충분한 testes의 양을 분리 수 있습니다.

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

*Drosophila melanogaster*의 정소는 줄기세포의 유지 및 분화, 감수분열, 그리고 체세포-생식세포... 연구를 위한 중요한 모델을 제공합니다.

이 실험 절차의 전체적인 목표는 생후 0~3일 된 수컷 drosophila melanogaster로부터 정소(testes)를 분리하는 것입니다. 이는 수컷 초파리를 마취시킨 후, 현미경 하에서 두 개의 해부용 바늘을 사용하여 얼음처럼 차가운 PBS 한 방울 속에서 초파리의 복부를 흉부에서 분리하여 정소를 적출함으로써 수행됩니다.마지막으로 정소를 나머지 조직에서 분리하여 면역형광 염색이나 총 RNA 및 단백질 분리와 같은 다양한 분석 기법에 사용할 수 있도록 수집합니다. 박리된 정소는 장과 구별하기 어려워 식별법을 익히기 힘들 수 있으므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 해당 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 shemei ma가 진행하겠습니다.먼저 얼음 버킷, 해부용 바늘 및 약 100 milliliters의 인산 완충 식염수(PBS)를 준비합니다. PBS를 얼음 버킷에 넣어 냉각시킵니다. 슬라이드 크기에 맞게 자른 20 파운드 백지를 부착하여 배경이 검은색인 현미경 슬라이드를 제작합니다.그런 다음 한쪽 면을 검게 칠합니다. 유성 마커를 사용하여 슬라이드 위에 종이를 고정하고, 슬라이드를 CO2 패드에 고정합니다. 해부 현미경 아래에서, 0~3일 된 파리들이 들어있는 병에 CO2 스트림을 흘려 마취시킨 후 패드 위에 쏟아냅니다.고정된 현미경 슬라이드 근처에서 특유의 어두운 색 교미 갈고리를 통해 수컷 파리를 식별하고 50~100마리를 분류합니다. 피펫을 사용하여 약 50 µL의 차가운 PBS를 현미경 슬라이드 중앙에 떨어뜨려 방울을 형성합니다. 해부침을 PBS 방울에 담갔다가 파리의 복부 쪽에 살짝 접촉시켜 수컷 파리를 바늘에 붙여 들어 올립니다.초파리를 PBS 방울 속에 놓고, 바늘 하나를 초파리의 흉부와 복부 사이에 단단히 누릅니다. 다른 바늘 하나를 복부의 여섯 번째와 일곱 번째 마디 사이에 누른 다음, 복부를 흉부로부터 잡아당겨 분리합니다. 정소와 나머지 장기, 특히 정소와 비슷하게 보일 수 있는 장을 주의 깊게 떼어내어 정소와 장을 구분합니다.정소는 항상 쌍으로 존재하며, 특유의 나선형 모양을 띠고 장 조직보다 더 하얗다는 점을 기억하십시오. 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 정소를 수집하고 얼음 위에 보관하며, 이 상태로 몇 시간 동안 보관할 수 있습니다. 숙련되면 이 절차를 통해 초파리 한 마리를 1분 이내로 해부할 수 있습니다.특정 돌연변이 초파리에서 RNA 레퍼토리가 어떻게 변화하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 소형 사이런싱 RNA 또는 microRNA의 딥 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 수컷 파리의 부속샘을 해부하는 방법을 설명하고 고립된 분비샘이 단일 세포 현탁액으로 해리되는 예를 보여줍니다.

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이 비디오는 초파리 난소의 일반적인 해부학적 구조를 설명하고 실시간 또는 고정 이미징을 위해 난소를 해부하는 방법을 제공합니다.

초파리 melanogaster 난소 박리: 생체 외 조직 준비를 위한 기술

이 동영상은 생합성과 엑디스테로이드 및 기타 호르몬 분비에 중요한 복잡한 내분비 구조인 초파리 고리샘에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜은 해부, 고정 및 면역 염색을 보여줍니다.

유충 고리 분비선 박리: 초파리에서 발달 내분비 기관의 분리

중후반 초파리 여포의 단계 별 분리는 다양한 목적에 유용합니다. 이러한 모낭이 체외 개발 분석 및 라이브 영상과 결합하는 유전자 및 / 또는 약물 조작이 가능 문화, 발전. 또한, 모낭은 mRNA와 단백질을 단리 같은 분자 연구에 사용될 수있다.

의 유틸리티 스테이지 별 중후반<em&gt; 초파리</em&gt; 난포 격리

분리 및 위상 콘트라스트와 형광 현미경으로 이미징 초파리 고환 샘플 (생활하고 고정)을 제조하는 방법이 설명된다.

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster 번데기에서 온전한 고환과 생식 세포 낭종의 해부 및 배양을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 생체 외 정자 형성을 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 또한, 번데기 고환에서 생식 세포 발달의 특정 단계에 대한 억제제의 효과에 대한 약리학적 분석을 설명합니다.

해부, 이미징 및 약물 학적 치료 : 초파리의 번데기 고환 및 단일 남성 생식 줄 낭종의 생체 내 문화

여기에서, 우리는 RNA 염기서열 분석 및 RT-qPCR를 위한 Drosophila 남성 부속부전 (이차 세포)에서 특정 세포 집단을 해리하고 분류하는 프로토콜을 제시합니다. 세포 분리는 해부, 프로테아제 소화 및 기계적 분산을 요구하는 다단계 해리 과정 후 GFP 발현 이차 세포의 FACS 정제를 통해 달성된다.

체미애 남성 액세서리 땀샘의 이차 세포에서 RNA를 분리하는 FACS 기반 프로토콜

혈액-뇌 장벽 무결성은 신경계 기능에 매우 중요합니다. Drosophila melanogaster에서는,혈액 두뇌 방벽은 늦은 배아 발생 도중 신경교 세포에 의해 형성됩니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 태아 및 제 3 instar 애벌레에 있는 혈액 두뇌 방벽 대형 및 유지보수를 위한 분석하는 방법을 기술합니다.

초파리 멜라노가스터의 혈액-뇌 장벽 무결성에 대한 분석

이 프로토콜의 목표는 Drosophila meiotocytes를 사용하여 살아있는 고정 세포 현미경 검사법에 의해 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 분석하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 유충과 초기 번데기에서 전체, 손상되지 않은 고환을 분리하는 방법과 현미경 검사를 위해 처리하고 장착하는 방법을 보여줍니다.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

우리는 여기에 공초점 현미경 검사법에 적합하고 재현 가능하고 신뢰할 수있는 라벨을 허용 Drosophila 고환의 전체 마운트 준비 및 면역 스테인링을위한 향상된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 대형 S4-S5 정자 세포에 대한 공동 지역화 실험의 3D 표현 및 정량화에 의해이 프로토콜을 설명합니다.

대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster의 X 또는 Y 염색체 리보솜 DNA 자리에서 유래한 리보솜 RNA 전사체를 구별하기 위해 단일 뉴클레오티드 다형성에 민감한 제자리 형광 혼성화(SNP-FISH) 방법을 설명합니다.

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH: Drosophila melanogaster에서 유전자좌 특이적 리보솜 RNA 전사 검출

배우세요 Drosophila melanogaster 수컷 고환 분리 방법을. 냉각 PBS와 해부 바늘을 사용하여 1분 이내에 신속하게 고환을 분리하고 RNA 및 단백질 분석을 위한 조직을 확보하는 효율적인 기술을 익히세요.

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