Name: 초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 배우세요 초기 마우스 배아에서 염색질 면역침전(ChIP)을 이용한 조직 특이적 유전자의 단백질-DNA 상호작용 분석 방법입니다. 이 기술은 발달생물학 연구에서 유전자 활성화 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 미국의 복구 및 2009 년 재투자 법을 통해 취득 자금을 포함 ANI에 NIH R01 GM56244 지원하고, NIH R01 GM87130에 의해 JARP하는 것이었다

1. 태아의 분리 참고 : 마우스와 관련된 모든 작업이 적절한 동물 관리 및 사용 정책 및 프로토콜에 따라 수행되어야 <ol><li> 여성의 마우스의 짝짓기 플러그의 존재 짝짓기 후 아침 확인하고 다른 케이지에서 그들을 배치하여 스터드 남성에서 여성 성관계를 구분한다. 짝짓기 플러그가 관찰되는 그날 정오가 개발의 배아 일 0.5 (E0.5)로 간주됩니다. </li><li> E8.5에서 (또는 원하는 단계와 다를 경우), 승인된 프로토콜을 사용하여 마우스를 희생. </li><li> 70 % 에탄올로 euthanized 동물의 배를 습식과 복강을 엽니다. 개발 태아의 존재를 나타내는 주입 사이트는 각각의 자궁 호른 (그림 1A)의 길이를 따라 정렬 "문자열에 구슬"로 볼 수 있습니다. 가위를 사용하면, 두 자궁 뿔을를 제거 분리 개별적으로 주입 사이트를 잘라 (그림 1B)와 실내 온도 (RT)를 포함하는 100mm 배양 접시에 넣어 해부 매체 (DMEM 10 % 태아 소 혈청, 20 MM HEPES의 산도 7.4 60 μg / ML 페니실린, 스트렙토 마이신이 당연). </li><li> 포셉를 사용하여 자궁 (그림 1C)에서 각각의 배아 및 주변 세포막을 제거하고 신선한 해부 매체에서 그들을 놓으십시오. </li><li> 포셉를 사용하여 해부 현미경으로 각각의 배아를 분리. 개발이 단계에서, 태아는 정수리 난황, 연락처 deciduum 조직, 내장 난황과 양막합니다. 둘러싸인 양막은 태아와 직접 접촉에있는 투명한 막이다. 내장 난황은 양막과 정수리 부분 노른자의 색 사이에 위치하고 있으며 쉽게 배아를 육성 두드러진 혈관의 존재에 의해 E8.5 - E9.5의 배아에서 구별됩니다. 주변 점막에서 각 배아를 제거하고 여분의 혈액을 제거하기 위해 절개 미디어를 포함하는 새 접시에 개별적으로 전송할 수 있습니다. 발달 단계는 배아에서 배아와 새끼 사이 다를 수 있으며, 대표적인 E8.5 배아 및 대표 E9.5의 배아는 그림 1D 표시됩니다. </li><li> 해부 미디어 (앞의 4 단계에서 설명) 200 μl를 포함하는 1.5 ML eppendorf 튜브 각 배아를 전송합니다. </li></ol> 2. 절연 배의 균질화 <ol><li> 각 eppendorf 튜브에 200 UL의 볼륨 (DPBS 1X Dubbecco의 인산에 희석 살린 버퍼)에 Collagenase 유형 II의 20 단위를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 20 분 100 rpm으로 37 ° C 통에 샘플을 흔들. </li><li> 세포의 대단히 짧은 시간을 혼란 pipetting으로 잘 Resuspend. </li><li> 1.5 ML eppendorf 튜브를 통해 위치 살균 셀 스트레이너 (40 μm의 메쉬 크기)의 위에 세포 현탁액을 적용합니다. </li><li> 즉시 분리를 완료 실온 셀 스트레이너 위에 1X DPBS 600 μl를 적용합니다. 스트레이너를 폐기하십시오. </li><li> 4 견본을 원심 분리기 ° C를 5 분 4,000 XG에. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> RT 1X의 DPBS 1 ML에서 펠렛을 Resuspend. </li><li> RT 1 분 4,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 알티 해부 미디어 200 μl의 펠렛을 Resuspend. </li><li> 배아 세포를 계산합니다. 평균 3-5 X 10 6 cells/E8.5 배아가 있습니다. </li></ol> 3. 크로스 링크 염색질 <ol><li> 1 %의 포름 알데히드의 최종 농도에 대한 200 μl 샘플에 37 % 포름 알데히드 5.6 μl를 추가합니다. </li><li> RT 10 분 샘플을 품어. </li><li> 4 ° C 3 분 4,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 80 μl / ML 테아제 억제제 칵테일 (PIC)를 포함하는 차가운 1X DPBS와 세포 Resuspend. </li><li> 4 견본을 원심 분리기 ° C를 3 분 4,000 XG에. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. 이 단계에서는 샘플 -80에서 얼어 수 있습니다 ° C. 냉동, 가교 샘플 몇 달 동안 안정합니다. </li></ol> 4. Sonication <ol><li> RT SDS 용해 버퍼 (1 μl PIC/800 μl 전체 볼륨에서 갓 추가 PIC와 함께 50 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS) 100 μl의 세포 펠렛을 Resuspend. resuspended 경우, resuspension을 촉진하기 위해 RT SDS의 용해 버퍼의 추가 100 UL를 추가합니다. pipetting과 전도로 잘 섞는다. </li><li> 10 분 얼음에 세포 현탁액을 품어. </li><li> 200 사이 Diagenode Bioruptor를 사용하여 500 basepairs에 전단 DNA에 lysed 세포를 Sonicate ™ UCD200 (5 분 X 8 회 : 높음 (320w) 전원을 30 초 on/30 초의 진폭 설정 해제). 샘플은 얼음 슬러리 둘러싸여 있어야합니다. 샘플 4 ° C 이상의 따뜻한하거나 동결하는 것을 허용하지 않습니다. 사용 가능한 sonicators 많은 종류가 있습니다. Sonication 조건은 약 500 BP의 길이에 교차 연결된 DNA의 전단의 결과 각 sonicator에 최적화된해야합니다. </li><li> 4 sonicated 샘플을 원심 분리기 ° C, 10 분 14,000 XG에. </li><li> 티새로운 eppendorf 튜브 얼음 사전 냉각에 뜨는를 ransfer. </li><li> 5 aliquots 최대로 sonicated 샘플을 나누십시오. 우리는 경험적으로 한 E8.5 배아가 5 aliquots로 나눌 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 작은 또는 큰 샘플 크기는 적절하게 크기를 조정하실 수 있습니다. 이 단계에서는 샘플은 -80에 저장할 수 있습니다 ° C 이상 사용까지. </li><li> 상호 링크가 거꾸로 될 때까지 6 단계 -20 ° C에서 입력 및 저장소로 사용하기 위해 예약 한 나누어지는. 1 μl/800에서 갓 추가 PIC를 포함하는 칩 희석 버퍼 (16.7 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 1.2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1.1 % 트리톤 X - 100, 167 MM NaCl 및 0.01 % SDS)에 10 배 다른 aliquots를 희석 μl 버퍼. </li></ol> 5. 사전 지우고 Immunoprecipitation <ol><li> 연어 - 정자의 DNA / 단백질 4 또는 아가로 오스 G - 50 %의 슬러리 ° C, 회전, 1 시간을위한 75 μl 사전 명확 희석 뜨는. 또는 단백질 G 비즈가 칩을 사용하는 항체에 의해 결정되어야 하나 단백질 중 하나를 사용하십시오. 단백질 G 비즈가 염소 항체 드나 마우스 IgG 항체에 대한 1 추천 반면, 예를 들면, 단백질 구슬은 토끼 항체 권장됩니다. 자세한 내용은 비드 제조 업체에 의해 만들어진 권장 사항을 참조하십시오. </li><li> 1 분에 대한 2500 XG 4 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 새로운 사전 냉각 eppendorf 튜브에 뜨는를 전송합니다. </li><li> 사전 허가 나누어지는하는 항체 (4 μg / 샘플)을 추가하고 4 박 품어 ° C를 회전. </li></ol> 6. 염색질 단백질 - 비드 콤플렉스 워싱 <ol><li> ° C 회전 1 시간 4 각 유리병과 부화에 연어 정자는 DNA / 단백질 A 또는 G 아가로 오스 슬러리의 60 μl를 추가합니다. 위의 단계 3 미리 삭제에 사용되는 동일한 비드 유형을 사용합니다. </li><li> 1 분 1000 XG 4 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 제거하고 폐기. 얼음에서 DNA - 단백질 비드 복잡한 보관하십시오. </li><li> Resuspend과 같은 세척 버퍼 1, 2와 함께 아래의 감독 펠렛, 3, 4를 씻으십시오. 1-3 ° C가 이러한 버퍼와 세척이 4 수행해야 4 냉장되어야 버퍼 ° C. 와시 버퍼 4 실온에서 수행되어야 상온이 버퍼로 세척에 있어야 씻으십시오. 각 세차 적절한 온도에서 회전 5 분입니다. 4 ° C (세척 버퍼 네 세척을위한 실내 온도) 1 분 1000 XG에서 각 세척, 원심 분리기에 따라 다음 조심스럽게 대기음 또는 표면에 뜨는를 제거하십시오. </li></ol> 버퍼 1 : 낮은 소금 세척 버퍼 (20 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X - 100 150 MM NaCl 및 0.1 % SDS), 1 ML X 2 씻는다. 버퍼 2 : 높은 염분 세척 버퍼 (20 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X - 100 500 MM NaCl 및 0.1 % SDS), 1 ML X 2 씻는다. 버퍼 3 : LiCl 소금 세척 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % IGEPAL - CA630, 0.25 M LiCl과 1 % deoxycholic의 산성 (나트륨 소금)), 1 X 1 ML 씻으십시오. 버퍼 4 : TE 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 1 ML X 2 씻는다. 7. 염색질 - 항체 복합 용리 <ol><li> 신선한 용출 버퍼 (1 % SDS, 0.1 M NaHCO 3) 250 μl에 씻어 염색질 단백질 - 비드 복잡한을 Resuspend. 다음 회전 15 분 RT에서 품어 5 초에 대해 적극적으로 소용돌이로 샘플을. </li><li> RT 1 분 2,500 XG에 원심 분리기 새로운 eppendorf 튜브에 eluate를 전송합니다. </li><li> 1 단계와 2 단계를 반복하고 같은 eppendorf 튜브에 eluates을 결합. eluates는 상온에서 보관해야합니다. 이 단계를 완료되면, eluates가 더 사용하기 전까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 8. 크로스 링크를 바꾸게되면 DNA를 복구 <ol><li> 500 μl eluate (입력 컨트롤을 40 μl / ML) 20 μl 5 M NaCl을 추가합니다. </li><li> ° C 하루 4 시간을위한 물 목욕 65에서 eluates을 가열. </li><li> 각 샘플 (입력 컨트롤 포함) 10 μl는 DNA 조각의 크기를 확인 0.1-1 kbp를 스패닝 크기 표시 옆에있는 2 % 아가로 오스 겔에서 실행할 수 있습니다. DNA는 얼룩으로 나타납니다 아닌 날카로운 밴드 것입니다. 샘플의 나머지는 65 남아 수 있습니다 ° C 젤가 실행되는 동안. </li><li> QIAquick 젤 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 각 시료에서 DNA를 복구합니다. QIAquick의 스핀 열의와 500 μl의 시료에 이소프로판올 200 μl의 실리카 막과 DNA 흡착을 최적화하기 위해 600 μl QG 버퍼를 (키트에 제공)을 추가합니다. QG 버퍼는 시료의 산도 쉽게 결정을 허용하는 산도 표시기가 포함되어 있습니다. 샘플의 색상은 보라색에 노란색에서 전환하는 경우 (산도&gt; 7.5) 혼합 후, 시료와 혼합 3 M의 NaAcetate 10 μl (산도 5.2) 추가합니다. 이것은 열에있는 비즈에 바인딩 DNA를 극대화하기 위해 혼합물의 산도를 감소시킵니다. </li><li> 전에 칼럼을로드하는 모든 SDS의 침전물이 존재하는지 여부를 확인하기 위해 혼합물을 확인합니다. SDS 강수량이 발생한 경우에는 샘플로 예열한다42 ° C의 물 목욕 침전이 사라질 때까지. </li><li> QIAquick의 스핀 열 (키트에 보라색 열)로 혼합 700 μl를로드 1 분 14,000 XG에서 RT에서 원심 분리기. 진행하기 전에 칼럼에서를 통해 흐름을 삭제하고 샘플의 나머지와 함께이 단계를 반복합니다. </li><li> 열을 씻어 500 μl QG 버퍼를 추가합니다. 2 분 14,000 XG에서 RT에서 원심 분리기. 진행하기 전에 칼럼에서를 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 제조 업체의 지시에 따라 에탄올 것이 추가되었습니다하기 위해 PE 세척 버퍼 700 μl (키트에 공급)로 컬럼을 씻으십시오. 1 분 14,000 XG에서 RT에서 원심 분리기. 진행하기 전에 칼럼에서를 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 완전히 칼럼에서 PE 버퍼의 나머지 부분을 제거하기 위해 원심 분리 단계를 반복합니다. 을 통해 흐름과 수집 튜브를 폐기하십시오. </li><li> 60 μl EB 버퍼 (용출 버퍼 키트에서 제공)을 추가하여 새로운 eppendorf 튜브에 열을에서 Elute의 DNA. </li><li> 1 분 14,000 XG에 실온에서 원심 분리기. eluted DNA가 검출 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 복구 재료의 260 신호는 일반적으로 나누어지는 당 ~ 6-7 UG 총 복구를 위해, 90-120 NG / UL의 농도를 나타냅니다. 그러나 이러한 샘플 280분의 260 비율은 RNA의 예제에있다는 것을 제안, 일반적으로&gt; 1.8입니다. 따라서 복구 DNA의 정확한 금액은 낮을 수 있습니다. </li></ol> 9. 복구된 DNA 분석 <ol><li> SDS는 PCR DNA 형성 촉매 효소의 활동을 방해할 수 있습니다. SDS는 PCR을 수행하기 전에 완전히 제거하여야한다. 1 분 14,000 XG 4에서 잔여 SDS와 원심 분리기 ° C을 촉진하기 위해 얼음에 DNA를 품어. 새로운 eppendorf tube.This 단계에 뜨는을 전송 것은 좋습니다. </li><li> DNA의 eluates은 기존의 PCR 또는 분석 각 시퀀스에 대한 구체적인 primers와 양적 실시간 PCR (Q - PCR)을 통해 검색하실 수 있습니다. 전체 DNA를 eluate 5-10 μl 한 PCR 또는 Q - PCR 반응에 사용할 수 있습니다. 입력 컨트롤 PCR은 다른 샘플의 크기와 비교하여 DNA의 5-10 배 희석과 함께 수행할 수 있습니다. PCR 및 Q - PCR 조건하지만, 다양, 시작 물질의 제한된 양을 추가 PCR 사이클이 필요합니다. 기존의 PCR 검출을 위해, 우리는 40주기 시작하며 필요에 따라 조정하는 것이 좋습니다. </li></ol> 10. 대표 결과 우리는 E8.5과 E9.5의 배아 (그림 2) 모두에서 칩을 수행하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 결과는 myogenin가 E8.5과 E9.5의 배아에서 myogenin 모터에 존재하는 것을 보여줍니다. 칩 정화의 DNAs은 기존의 PCR (그림 2A)와 양적 실시간 PCR (그림 2B)에 의해 분석되었다. 대조적으로, myogenin이 표현되지 않은 난황에서 myogenin 모터에 바인딩 myogenin의 징후가 없었다. 인터페론 - γ (IFNγ) myogenin 바인딩 사이트를 일치 시퀀스를 포함 발기인은, 부정적인 시퀀스 제어로 사용되었다. 예상했던대로, myogenin는 테스트를 조직 샘플의에서 IFNγ업자에 바인딩되지 않았습니다. 골격근에 엽 성의 전구 물질 있으며,, E8.5 9.5 배아에서 myogenin은 특히 somites (6,10 그림 3)에 표시됩니다. 따라서 결과는 myogenin가 E8.5과 E9.5에서 somites에 myogenin 모터에 바인딩된을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. E8.5 배아 해부. (A) 절연 자궁 호른 (상단 패널, 하단 패널에 표시 상위 확대). (B) 자궁 경적 개별 배아를 포함하는 개별 주입 사이트를 분리하는 가위로 잘라. (C) 공룡의 태아가 해부하는 동안 자궁에서 튀어나온. 화살표는 여전히 엑스트라 배아 조직의 적용 배아를 표시합니다. 같은 쓰레기에서 (D) 2 E8.5 배아. 왼쪽의 배아 선회하는 과정을 시작하지 않았습니다. 오른쪽에 배아가 돌고를 겪고 있습니다. 맨 오른쪽 - 대표 E9.5의 배아. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 칩 분석은 E8.5과 E9.5의 배아에서 myogenin 모터에 바인딩 myogenin를 시연. myogenin 항체 또는 불특정 IgG가 전사의 시작 사이트를 -79에서 69 상대적으로 myogenin 모터의 일부를 증폭 primers로 수행된을 사용하여 칩 실험에서 정화 DNA의 5 UL의 (위) 기존의 PCR 분석되는 -12 또는 전사 시작 사이트의 ~ 1,075 BP 상류에 위치한 myogenin 바인딩 사이트를 일치하는 시퀀스를 포함하는 IFNγ 프로 모터의 일부를 증폭 primers에있는 myogenin 바인딩 사이트가 포함되어 있습니다. 사용 IFNγ의 프라이머 절차가 GAC TCA AGA CCC CGA GGC - 3 '와 5' - TGA GGA GGC TGG AGG AGG CC - 3'5' - GCT되었습니다. (A)에 사용되는 동일한 샘플 (아래) 정량 실시간 PCR 분석.표준 편차 - 데이터 입력 + /의 %로 꾸몄다 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. Myogenin 특별히 E8.5과 E9.5의 태아의 somites에 표시됩니다. myogenin의 현장 하이브리드화의 전체 마운트 somites에서 특정 mRNA 표현을 보여줍니다. 200 μm의 - E8.5 이미지의 크기 바. E9.5 이미지 크기 모음 - 500 μm의.

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<li>French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimers+of+myogenic+helix-loop-helix+regulatory+factors+and+E12+bind+a+complex+element+governing+myogenic+induction+of+the+avian+cardiac+alpha-actin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter.</a> Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).</li>
<li>Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+the+myogenin+basic+region+identifies+an+ancient+protein+motif+critical+for+activation+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).</li>
<li>Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+activity+of+myogenic+HLH+proteins+requires+hetero-oligomerization+with+E12%2FE47-like+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo.</a> Cell. 66, 305-315 (1991).</li>
<li>Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+homooligomerization+contributes+to+the+dependence+of+myogenin+on+E2A+products+for+efficient+DNA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding.</a> Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).</li>
<li>Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenin+induces+the+myocyte-specific+enhancer+binding+factor+MEF-2+independently+of+other+muscle-specific+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products.</a> Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).</li>
<li>Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+human+muscle+regulatory+helix-loop-helix+proteins+Myf3-Myf6+exhibit+similar+hetero-dimerization+and+DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).</li>
<li>Serna, dela, L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li>
<li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li>
<li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li>
<li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenin+and+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li>
<li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li>
<li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered%2C+cyclical%2C+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li>
<li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
</ol>

동물 실험은 매사 추세츠 의과 대학 IACUC 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

설명 칩 프로토콜에서는, 우리는 myogenic 조절기 myogenin가 단일 E8.5과 E9.5의 배아에있는 골격근 전구체 조직에서 myogenin 모터와 관련된 것을 보여줍니다. 이전 연구는 광범위 11-20 타겟 유전자 규제 시퀀스의 관련 부분을 인코딩 체외 번역 또는 bacterially 생산 myogenin 및 radiolabeled DNA에 활용하여 체외 겔 이동 실험의 초기부터 시작 시퀀스를 포함하는 E 상자에 바인딩 myogenin를 묘사했습니다. 종래의 칩 연구 myogenesis 21-24위한 조직 문화 모델의 myogenin 모터에 바인딩 myogenin를 증명하고있다. 그러나, 하나 myogenin에서 E15.5 혀 조직에서 관찰 myogenin 표현의 아래 규정에 따라이 embryogenesis의 뒷부분에 나와있는 경우로 예측 모르지만 그것 myogenin이 배아 골격근 개발 중에 myogenin 발기...

<table><tbody><tr><td>ChIP 분석 키트</td><td>Upstate, Millipore</td><td>17-295</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Invitrogen</td><td>17101015</td><td>1 x PBS로 희석</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified eagle medium (DMEM) </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12100-061</td><td>고농도 포도당 함유</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>염화칼슘 및 염화마그네슘 무첨가</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청 (FBS)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>겔 추출 키트</td><td>QIAquick</td><td>28704</td><td>50회 반응 키트</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin 스톡 용액</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td>5000 &amp;#x03BC;g/ml 농도</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA /Protein A agarose</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>myogenin 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-576</td><td></td></tr><tr><td>Normal rabbit IgG</td><td>EMD Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Q-PCR master mix</td><td>Promega Corp.</td><td>A6001</td><td></td></tr></tbody></table>

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 immunoprecipitation 분석

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

1-3 살아있는 세포의 맥락에서 발생하는 염색질의 상호 작용 : 염색질 immunoprecipitation (칩)은 단백질을 식별하는 강력한 도구입니다. 이 기술은 널리 기본 조직에서 낮은 정도 조직 문화 세포에 악용하고있다. 특히 개발 초기 시간에 쥐 배아 조직에 칩의 응용 프로그램, 조직의 한계와 배아의 세포와 조직 유형의 이질에 의해 복잡합니다. 여기 dissociated 배아 하루 8.5 (E8.5) 배아를 사용하여 칩을 수행하는 방법을 제시한다. 염색질 상호 작용 : 단일 E8.5 배아에서 가지각색 염색질은 컨트롤과 특정 단백질의 조사를 위해 조사 충분한 자료를 수있는 다섯 aliquots에로까지 나눌 수 있습니다. 조직 특정 유전자 발현 프로그램의 사양 중 염색질 상호 작용 : 우리는 단백질을 문서로 시작이 기술을 활용합니다. 모든 상호 작용이 발생 여부를 구별하지 않고 염색질 상호 작용의 일부, 또는 하나의 셀 타입 (S) : 결과가 단백질의 검출이기 때문에 배아에서 세포 유형의 이질 반드시이 기술의 응용 프로그램을 제한합니다. 그러나, 도중에 조직 특정 유전자 검사 또는 조직 특정 유전자 발현의 발병 다음 두 가지 이유 때문에 가능합니다. 첫째, 조직 구체적인 요인 immunoprecipitation 반드시 요소가 표현되는 세포 유형에서 염색질를 분리합니다. 둘째, coactivators 및 유전자 활성화와 관련된 포스트 translational 수정을 포함 histones의 immunoprecipitation은 유전자가되는 세포 유형의 유전자와 유전자의 규제 시퀀스에서 찾을 수 있어야하거나 활성화되었습니다. 이 기술은 대부분의 조직 특정 유전자 활성화 이벤트의 연구에 적용해야합니다. 예제는 아래에서 설명에서 우리는 골격근 특정 유전자 프로 모터에 바인딩 요소를 검토 E8.5과 E9.5 마우스 배아를 활용. 트렁크와 사지의 골격 근육이 형성하는 전구체 조직 아르 Somites는 E8.5 - 9.5 4,5에서 존재하고 있습니다. Myogenin는 골격 근육 차별 6-9에 필요한 규제 요소입니다. 데이터 myogenin가 E8.5과 E9.5의 배아 자체 발기인와 관련된 것을 보여줍니다. myogenin에만 개발 6,10이 단계에서 somites 표현이기 때문에, 데이터 자체 모터와 myogenin 상호 작용은 이미 E8.5 태아의 골격 근육 전구체 세포에서 발생한 것을 나타냅니다.

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

염색질 면역침전법(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)은 살아있는 세포 내에서 발생하는 단백질-염색질 상호작용을 식별할 수 있는 강력한 도구입니다 1-3. 이...

본 절차의 전체적인 목적은 염색질 면역침전법(chromatin immunoprecipitation) 또는 ChIP 분석에 사용할 E 8.5 마우스 배아를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 배아를 분리하여 단일 세포 현탁액을 준비함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 게놈 DNA에 결합된 단백질을 화학적으로 교차 결합시킨 후, 초음파 처리를 통해 DNA를 단편화하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 단백질 염색질 복합체를 면역 침전시키고 정제된 DNA를 분리하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 정제된 면역 침전 DNA를 일반적인 PCR 또는 정량적 실시간 PCR로 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 발달 중인 조직과 기관에서 분화 프로그램이 시작될 때 분화 특이적 유전자의 조절 서열과 단백질 간의 상호작용을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이번 학기에는 분화 특이적 유전자가 전사 가능 상태가 됨에 따라 해당 유전자의 조절 서열과 상호작용하는 조절 인자들을 식별함으로써, 배아 발생 중 분화 프로그램의 개시에 관한 중요한 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 위해, 배아 발생 8.5일 차에 희생시킨 마우스로부터 자궁각을 적출합니다. 승인된 프로토콜에 따라, 가위로 조직을 절단하여 신선한 절편 배지가 담긴 페트리 접시에 넣습니다.과도한 출혈을 방지하기 위해 각 착상 부위를 개별적으로 절개하여 신선한 해부 배지가 담긴 페트리 접시에 옮깁니다. 핀셋을 사용하여 각 착상 부위에서 자궁층을 제거함으로써 배아를 노출시킵니다. 핀셋으로 개별 배아를 분리합니다. 발달의 이 단계에서 배아는 데시둠 조직과 접촉하는 벽측 난황낭, 내장성 난황낭 및 양막으로 둘러싸여 있습니다.양막은 배아와 직접 접촉하고 있는 투명한 막입니다. 내장성 난황낭은 양막과 벽성 난황낭 사이에 위치하며, 배아에 영양을 공급하는 뚜렷한 혈관들이 존재하므로 8.5에서 9.5일 된 배아에서 쉽게 구별할 수 있습니다. 각 배아를 주변 막에서 분리하여 과도한 혈액을 제거하기 위해 해부용 배지가 담긴 새 플레이트에 개별적으로 옮깁니다.그런 다음 각 배아를 200 µL의 해부 배지가 들어 있는 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 분리된 배아의 균질화는 각 배아가 담긴 에펜도르프 튜브에 200 µL의 collagenase Type II 용액을 첨가함으로써 시작됩니다.37 °C 셰이커에서 100 RPM으로 20분 동안 샘플을 부드럽게 흔들어

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-tissue-specific-genes-using

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

ESC의 차별은 셀 타입의 특정 구조의 변화와 염색질의 구성과 일치한다. 이러한 변화의 감지는 stemcellness 및 세포 분화를 정의하는 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공합니다. 염색질 immunoprecipitation (칩)은 줄기 세포 분화를 기본 분자 메커니즘을 해부하다하는 소중한 방법을 나타냅니다.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

방법 염색질 규제 및 염색질 상태의 문제는 생체 내에서 유전자가 세포 운명 결정이 배아에서 어떻게 만들어 지는지 초기에 대한 우리의 이해의 열쇠입니다 영향을 미칩니다. 칩 서열 번호 - 글로벌 수준입니다 Xenopus의 배아 여기 설명에서 크로 마틴의 기능을 조사하기 가장 인기있는 방법.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

우리는 배양된 세포를 초기 마우스 배아의 정의된 부위에 이식하여 생체 내 잠재력을 결정하는 방법을 보여줍니다. 또한 알려진 직경의 유리 모세혈관을 사용하는 최적화된 전기천공법(electroporation method)을 도입하여 배아의 몇 개의 세포에 외인성 DNA를 정확하게 전달할 수 있습니다.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체​​로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

여기 우리가 전체 마우스 배아 초기에 β-galactosidase 활동의 검출을 위한 표준 프로토콜 및 파라핀 단면화 및 counterstaining에 대 한 방법을 설명 합니다. 이것은 개발 조직 단면도에 또한 적용 될 수 있는 유전자 발현을 모니터링 하는 간단 하 고 빠른 절차 기관 또는 배양된 세포.

전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

우리는 초기 마우스 배아에 있는 microRNAs를 프로파일링하기 위한 기술을 기술합니다. 이 프로토콜은 낮은 세포 입력 및 작은 RNA 농축의 도전을 극복합니다. 이 분석은 초기 마우스 배아의 상이한 세포 계보에서 시간이 지남에 따라 miRNA 발현의 변화를 분석하기 위하여 이용될 수 있다.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

배우세요 초기 마우스 배아에서 염색질 면역침전(ChIP)을 이용한 조직 특이적 유전자의 단백질-DNA 상호작용 분석 방법입니다. 이 기술은 발달생물학 연구에서 유전자 활성화 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

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