초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

본 절차의 전체적인 목적은 염색질 면역침전법(chromatin immunoprecipitation) 또는 ChIP 분석에 사용할 E 8.5 마우스 배아를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 배아를 분리하여 단일 세포 현탁액을 준비함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 게놈 DNA에 결합된 단백질을 화학적으로 교차 결합시킨 후, 초음파 처리를 통해 DNA를 단편화하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 단백질 염색질 복합체를 면역 침전시키고 정제된 DNA를 분리하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 정제된 면역 침전 DNA를 일반적인 PCR 또는 정량적 실시간 PCR로 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 발달 중인 조직과 기관에서 분화 프로그램이 시작될 때 분화 특이적 유전자의 조절 서열과 단백질 간의 상호작용을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이번 학기에는 분화 특이적 유전자가 전사 가능 상태가 됨에 따라 해당 유전자의 조절 서열과 상호작용하는 조절 인자들을 식별함으로써, 배아 발생 중 분화 프로그램의 개시에 관한 중요한 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 위해, 배아 발생 8.5일 차에 희생시킨 마우스로부터 자궁각을 적출합니다. 승인된 프로토콜에 따라, 가위로 조직을 절단하여 신선한 절편 배지가 담긴 페트리 접시에 넣습니다.

과도한 출혈을 방지하기 위해 각 착상 부위를 개별적으로 절개하여 신선한 해부 배지가 담긴 페트리 접시에 옮깁니다. 핀셋을 사용하여 각 착상 부위에서 자궁층을 제거함으로써 배아를 노출시킵니다. 핀셋으로 개별 배아를 분리합니다. 발달의 이 단계에서 배아는 데시둠 조직과 접촉하는 벽측 난황낭, 내장성 난황낭 및 양막으로 둘러싸여 있습니다.

양막은 배아와 직접 접촉하고 있는 투명한 막입니다. 내장성 난황낭은 양막과 벽성 난황낭 사이에 위치하며, 배아에 영양을 공급하는 뚜렷한 혈관들이 존재하므로 8.5에서 9.5일 된 배아에서 쉽게 구별할 수 있습니다. 각 배아를 주변 막에서 분리하여 과도한 혈액을 제거하기 위해 해부용 배지가 담긴 새 플레이트에 개별적으로 옮깁니다.

그런 다음 각 배아를 200 µL의 해부 배지가 들어 있는 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 분리된 배아의 균질화는 각 배아가 담긴 에펜도르프 튜브에 200 µL의 collagenase Type II 용액을 첨가함으로써 시작됩니다.

37 °C 셰이커에서 100 RPM으로 20분 동안 샘플을 부드럽게 흔들어 줍니다. 그 다음, 가볍게 두드려 세포 덩어리를 풀어줌으로써 샘플을 재현탁합니다. 1.5 mL 원심 분리 튜브 위에 놓인 40 µm 메쉬 크기의 멸균 세포 스트레이너 상단에 세포 현탁액을 도포합니다.

분리를 완료하기 위해 상온의 1X DPBS 600 µL를 셀 스트레이너 상단에 즉시 가합니다. 현탁액의 여과가 끝나면 셀 스트레이너를 폐기하고, 샘플을 4 °C에서 4,000 G로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 폐기합니다.

각 펠렛을 상온의 1X DPBS 1mL에 현탁합니다. 그 다음, 상온에서 4,000 G로 1분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 다시 한번 제거한 후, 각 펠렛을 상온의 해부용 배지 200µL에 재현탁합니다. 200µL 샘플에 37% formaldehyde 5.6µL를 첨가하여 최종 농도가 1% formaldehyde가 되도록 크로마틴을 가교 결합시킵니다.

샘플을 실온에서 10분 동안 배양한 후, 4 °C에서 4,000 G로 3분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. ml당 80 µL의 프로테아제 억제제 칵테일(PIC)이 포함된 차가운 1X DPBS로 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 4 °C에서 4,000 G로 3분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거한 후, 샘플은 -80 °C에서 냉동 보관할 수 있으며 초음파 처리 전까지 수개월 동안 안정적입니다. 냉동된 세포 펠렛을 얼음 위에서 해동하거나, 이전 단계의 펠렛을 얼음 위에 둡니다. 세포 펠렛을 실온의 SDS 용해 버퍼 100 µL에 재현탁합니다. 재현탁 후 실온의 SDS 용해 버퍼 100 µL를 추가로 넣고, 피펫팅과 도립 혼합을 통해 샘플을 재현탁합니다.

세포 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양하십시오. 배양 후, 가교된 DNA를 200에서 500 base pairs 사이로 전단(shear)하도록 장비를 설정하십시오. 본 시연에서는 DIO geno bio rupture UCD 200이 사용되었습니다.

얼음 슬러리에 둘러싸인 상태로 샘플을 초음파 처리하십시오. 온도가 4 °C 이상으로 올라가거나 얼지 않도록 주의하십시오. 초음파 처리된 샘플을 4 °C에서 14,000 G로 10분 동안 원심분리하십시오.

상층액을 얼음 위에서 미리 냉각시킨 새 eend DPH 튜브로 옮깁니다. 초음파 처리된 샘플을 최대 5개의 분주량으로 나눕니다. 가교 역반응(cross-link reversal)을 위한 입력 샘플로 보관하기 위해, 분주량 중 하나를 -20 °C에서 보관합니다.

나머지 분주액들을 800 µL의 버퍼당 1 µL의 PIC를 새로 첨가한 칩 희석 버퍼로 10배 희석합니다. 먼저, 칩 분석 단백질에 사용할 항체에 따라 사전 제거(pre clearing)에 사용할 에어로 속도를 결정합니다. 칩에 사용할 항체가 토끼 유래(rabbit)이므로 여기서는 A 비즈를 사용합니다.

살몬 정자 DNA 및 단백질 50% 용액 75 µL를 첨가하여 희석된 상층액을 사전 정제합니다. 4 °C에서 회전하며 1시간 동안 배양한 후, 샘플을 4 °C에서 2,500 G로 1분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 미리 냉각된 새 EP tube로 옮깁니다.

샘플당 4 µg의 항체를 전처리(pre-cleared)된 Eloqua에 첨가하고 4 °C에서 회전시키며 하룻밤 동안 배양합니다. 먼저 각 샘플에 60 µL의 연어 정자 DNA 단백질 A-ros bead 현탁액을 첨가하고 4 °C에서 회전시키며 1시간 동안 배양합니다. 샘플을 4 °C에서 1000 ×g로 1분 동안 원심 분리합니다.

원심분리 후, 상층액을 조심스럽게 제거하여 버리고 DNA-단백질 비드 복합체는 얼음 위에 보관하십시오. 서면 프로토콜에 설명된 대로 버퍼 1부터 4를 사용하여 펠렛을 재현탁하고 세척하십시오.

각 세척 단계는 회전 상태에서 5분간 배양한 후, 1000 G에서 1분 동안 원심분리하고 세척 후 상층액을 제거하는 과정으로 구성됩니다. 세척된 크로마틴 단백질 비드 복합체를 250 µL의 갓 준비한 용출 버퍼에 다시 현탁하여 크로마틴 항체 복합체를 용출합니다. 각 시료를 5초 동안 강하게 Vortexing한 후, 회전 상태에서 상온으로 15분간 배양하고 2,500 G에서 1분 동안 원심분리합니다. 상온에서 각 용출액을 새로운 eph 튜브로 옮깁니다.

용출 과정을 반복하고 각 샘플의 용출액을 동일한 eph 튜브에 모읍니다. 가교 결합을 해제하려면 500 µL의 각 용출액에 20 µL의 5 M sodium chloride를 첨가합니다. 이전에 따로 보관해 둔 input control에는 mL당 40 µL의 5 M sodium chloride를 첨가합니다.

EIT를 65 °C 항온수조에서 4시간 동안 가열합니다. DNA 단편 크기를 확인하기 위해, 각 샘플 10 µL를 0.1에서 1 kb 범위의 크기 마커와 함께 2% agarose gel의 input control에 로딩하여 하룻밤 동안 전기영동을 수행합니다. DNA는 선명한 밴드가 아닌 스미어(smear) 형태로 나타납니다.

Kaya Quick Gel Extraction Kit를 사용하여 각 500 µL 샘플에서 DNA를 회수합니다. 먼저 Kaya Quick Spin Column 내의 실리카 막에 DNA 흡착이 최적화되도록 QG buffer 600 µL를 첨가한 다음, 컬럼에 로딩하기 전에 isopropanol 200 µL를 추가합니다. 혼합물을 확인하여 SDS 침전물이 있는지 결정합니다.

SDS 침전이 발생한 경우, 침전물이 사라질 때까지 샘플을 42 °C 항온수조에서 가온해야 합니다. 그 다음 샘플을 컬럼에 로딩하고 제조사의 지침에 따라 DNA를 용출하십시오. SDS는 PCRT polymerase의 활성을 저해할 수 있으므로 PCR을 수행하기 전에 완전히 제거해야 합니다.

각 DNA 샘플을 얼음 위에서 배양하여 잔류 SDS를 침전시킨 후, 4°C에서 14,000 G로 1분 동안 원심 분리합니다. SANE를 새 ependorf 튜브로 옮깁니다. DNA EIT는 일반적인 PCR 또는 각 분석 서열에 특이적인 프라이머를 이용한 정량적 실시간 PCR(qPCR)로 검출할 수 있습니다. 분석할 각 서열에 대해, 1회 PCR 또는 qPCR 반응당 전체 DNA IIT에서 5~10 µL를 사용하며, PCR 및 qPCR 조건은 상이할 수 있습니다.

하지만 시작 물질의 양이 제한적이기 때문에 일반적인 PCR 검출을 위해서는 추가적인 PCR 사이클이 필요하며, 40 사이클로 시작하여 필요에 따라 조정하십시오. 본 프로토콜을 사용하여 E 8.5 및 E 9.5 배아 모두에서 칩 작업을 수행하였습니다. 칩으로 정제된 DNA는 일반 PCR 및 정량적 실시간 PCR로 분석되었습니다.

결과는 근분화 및 조절 인자가 E 8.5 및 E 9.5 배아의 근분화 및 프로모터에 존재함을 보여줍니다. 반면, 근분화 인자가 발현되지 않는 oak sac에서는 근분화 인자와 근분화 프로모터의 결합 징후가 나타나지 않았습니다. 근분화 결합 부위와 일치하는 서열을 포함하는 인터페론 감마 프로모터는 음성 서열 대조군으로 사용되었으며, 예상대로 테스트한 모든 조직 샘플에서 근분화 인자가 인터페론 감마 프로모터에 결합하지 않았습니다.

myo Genin이 해당 단계의 체절에서 특이적으로 발현되므로, 결과는 Myogenic이 E 8.5 및 E 9.5 배아의 체절 내 Myogenic 프로모터에 결합되어 있음을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후, 귀하는 발달 중인 조직의 조직 특이적 유전자에서 발견되는 조절 인자를 식별하기 위해 E 8.5 마우스 배아를 분리하고 염색질 침전 분석을 위해 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.