폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

본 실험 절차의 전반적인 목적은 폐기된 전두엽 피질 조직에서 인간 신경줄기세포를 분리하는 것입니다. 이는 인간 태아 뇌를 해부하기 전, 용액과 재료를 미리 준비함으로써 수행됩니다. 이후 분리된 신경줄기세포의 추가 증식, 특성 분석 및 실험을 포함한 유지 관리 과정이 이어집니다.

장기 보관이 가능하며, 전구세포를 뉴런 및 글리아 세포 유형으로 분화시키기 위한 하위 배양 확립 또한 가능합니다. 궁극적으로, 정상 CNS 유래 세포의 분화 특성을 분석하고 이를 알려진 신경 질환이 있는 CNS 유래 세포의 분화와 비교할 수 있습니다. 이 기술의 함의는 모든 인간 CNS 질환의 치료 또는 진단으로 확장됩니다.

이 기술은 병리적 S를 평가하고 특정 질환에 대한 신약의 약리학적 효능을 측정할 수 있는 간단하고 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 다분화능 세포의 매우 높은 가치로 인해, 프로토콜을 시작하기 전에 모든 재료를 미리 준비해야 합니다. 샘플 손상 위험을 최소화하기 위해 냉장 해부 도구, 37 °C로 가온된 배양액 및 배지, 그리고 장기 보관을 위한 냉장 세포 동결 배지를 준비하십시오.

해부를 위한 저온 보존을 위해, 세포 해리를 위한 멸균 오토클레이브 처리된 핀셋과 핸들이 장착된 메스 날을 준비하십시오. 피펫 건, 10 milliliter 전이 피펫 및 40 micromolar 세포 스트레이너를 준비하십시오. 해부에 사용할 10 centimeter 배양 접시 여러 개를 준비하여 따로 둡니다.

해리를 위한 50 milliliter 원심분리 튜브, 조직 보관을 위한 1.5 milliliter 원심분리 튜브 및 세포 동결을 위한 냉동 보관 바이알을 준비합니다. 성공적인 실험을 위해, 18~22주령의 생존 조직은 확보 후 2시간 이내에 채취해야 합니다.

이상적으로는, 선택적 시술 후 수거할 수 있도록 미리 협의하여 태아 조직을 확보한 후 수 분 이내에 수집하는 것이 좋습니다. 조직이 파편화되어 있는 경우가 많으나, 뇌의 상당 부분은 온전하게 유지됩니다. 얼음처럼 차가운 dissection Medium이 채워진 10 milliliter 페트리 접시에 뇌를 수집하십시오.

해부학적 지표를 통해 피질의 서로 다른 부위를 식별합니다. 전두엽, 두정엽 및 후두엽 피질의 경계는 중심구(central sulcus)와 실비우스열(syl fissure)의 외삽된 교차점을 기준으로 설정합니다. 수술용 칼날을 사용하여 중심구 앞쪽의 전두엽 피질과 실비우스열 경계를 따라 조직을 절제합니다.

뇌실이 손상되지 않고 온전하게 유지되었는지 확인하십시오. 이제 분리된 전두엽 피질 블록에서 잔류 혈액과 뇌수막을 제거합니다. 샘플이 너무 파편화되지 않았고 충분히 크다면, 일부를 조직학 및 단백질 또는 mRNA 분석용으로 남겨두기 위해 블록을 여러 개의 작은 샘플로 분할하십시오.

이제 뇌 조직 블록을 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮기고 조직 부피의 3배에 해당하는 얼음처럼 차가운 박리 배지를 추가합니다. 피펫을 사용하여 모든 조직이 파편화될 때까지 조직을 부드럽게 분리합니다. 세포를 완전히 부유시키기 위해 40 micromolar 세포 스트레이너로 여과합니다.

이제 세포 현탁액을 원심 분리하고 세포 펠릿을 10 milliliters의 신선하고 따뜻한 배양 배지에 다시 현탁하십시오. 혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하고 2 million cells에 해당하는 부피를 계산하십시오. 이제 2 million cells 분량의 부피를 각각 25 centimeter square 배양 플라스크로 옮기십시오.

5 mL의 따뜻한 배양액으로 준비합니다. 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 일주일 동안 세포를 유지합니다. 장기 배양 시에는 일주일에 한 번 배지의 절반을 교체합니다. 배양 후 1~2주가 지나면 보통 NSC 직경 200~400 µm 사이의 신경구(neurosphere)가 형성됩니다.

뉴로스피어(neurosphere)를 단일 세포로 분리합니다. Hank's 배지가 포함된 EDTA와 함께 세포를 15분 동안 배양합니다. 서브컬처를 위해 현탁된 세포를 준비하려면, 원심 분리하여 가라앉힌 후 hanks로 세척하고 따뜻한 배양 배지로 세포를 다시 채웁니다.

분화를 시작하려면, 분리된 세포를 poly-D-lysine과 laminin 1이 코팅된 커버슬립에 커버슬립당 100,000 cells의 밀도로 플레이팅하고 30분 동안 배양하십시오. 이 세포들은 희소돌기아교세포, 뉴런 또는 성상교세포로 쉽게 분화될 수 있습니다.

신경세포 분화를 위해, B 27이 포함된 배지에서 세포를 7일 동안 유지합니다. 성상교세포 분화 배양을 위해, FBS가 포함된 배지에서 세포를 7일 동안 배양합니다. 희소돌기아교세포 분화를 위해, 성장 인자가 포함된 수정 배지에서 세포를 2일 동안 유지하고, 2일 후에는 성장 인자가 없는 동일한 수정 배지를 사용하여 줄기세포를 5일 더 보관합니다.

분리된 세포 현탁액을 원심 분리한 후, 바이알당 1,000만 개의 세포 농도로 동결 배지에 재현탁합니다. 세포를 -20 °C에서 서서히 냉각시킨 후, 장기 보관을 위해 -80 °C에서 동결합니다. 이후 액체 질소로 옮깁니다.

이후 세포를 37 °C 항온수조에서 빠르게 해동하여 재부유합니다. 세척을 위해 10% serum이 첨가된 가온된 D-M-E-M-F 12를 사용합니다. 가온된 세포를 원심 분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 가온된 배양액에 다시 부유시킵니다.

정상 태아의 중간 신경 줄기세포를 사용하였습니다. 임신 18주 차에 수집하여 뉴로스피어(neurospheres)를 형성하도록 배양하였으며, 여기에 GFP를 형질도입하였습니다. 이후 뉴로스피어를 분화시켜 여러 세포 유형을 생성하였고, 이를 고정하여 세포 마커와 루민(rumine)으로 염색하였습니다.

뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포를 나타내는 마커들의 발현을 통해 다분화능이 관찰됩니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 폐기된 전두엽 피질 조직에서 인간 신경 줄기세포를 분리, 확장 및 조작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 영역들은 인간 피질 환경의 질병 기전을 연구하고 약물 치료제의 잠재적 효능을 테스트할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다.