Name: 인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 학습하세요 인플루엔자 바이러스 아형을 빠르게 검출하는 ampliPHOX 색소 검출법을 이용한 DNA 마이크로어레이 분석법입니다. 이 방법은 형광 검출 대비 저렴하면서도 눈으로 확인 가능한 신속한 결과를 제공합니다.

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InDevR이 작품을 자금에 대한 NIH / NIAID U01AI070276 및 R43AI077112을 인정합니다.

1. RT - PCR을 사용하여 샘​​플 증폭 <ol><li> 임상 자료나 바이러스 QIAcube 자동 핵산 추출 플랫폼과 함께 Qiagen MinElute 바이러스 스핀 키트를 사용하여 분리.부터 바이러스 RNA를 추출 Extractions은 60 μl의 최종 용출 량 200 μl 표본에서 수행됩니다. -70에서 보관 추출물 ° C 또는 나중에 사용하기 위해 낮은. </li><li> 템플릿 자유 영역에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 얼음의 RT - PCR 마스터 믹스를 준비합니다. RT - PCR 중에 비오틴을 통합하려면, dNTP 혼합 제공된 제조 업체의 자리에 biotinylated dNTP 혼합물을 사용합니다. biotinylated dNTP 혼합물을 사용하는 비용은 1 달러 미만 USD / 분석이다. biotinylated 프라이머의 사용과 같은 비오틴의 정관의 다른 방법도 사용할 수 있습니다. 추가 프라이머는 독감을위한 1.0 μm의 최종 농도로 혼합, 인플루엔자 B에 대해 1.0 μm의 및 내부 통제를위한 0.14 μm의. 독감은 프라이머 세트는 매트릭스 유전자 세그먼트 (1032 NT 제품)를 증폭하고 독감 B 프라이머 세트가 아닌 구조 유전자 세그먼트 (811 NT 제품)을 증폭. 각 FluChip 프라이머 세트는 다음과 PCR 람다 exonuclease와 효소 소화를 통해 단일 ​​좌초된 DNA의 생성을 촉진하기 위하여 5 'phosphoryl 그룹과 하나 뇌관이 포함되어 있습니다. 그 결과 단일 좌초 제품은 이중 좌초 상응하는 것보다 훨씬 짧은 하이브리드화 시간을 요구하고 크게 전반적인 분석 시간을 단축. 이러한 primers의 사전 준비 혼합뿐만 아니라 내부 통제 템플릿 RNA는 InDevR에서 제한적으로 관심 연구자 사용할 수 있습니다. </li><li> 간단히 와동과 얇은 벽의 PCR 튜브에 마스터 믹스 18 μl를 배포합니다. </li><li> 템플릿 이외에 적합한 작업 영역에 얼음에 튜브를 전송하고, 각각의 반응 관 2 μl 템플릿을 추가합니다. </li><li> 열 자전거 타는 사람, 다음과 같은 열 프로파일 실행하는 전송 PCR 튜브 : 50 역방향 전송을 ° 95시 30 분, 효소 불활 성화 / 활성화를위한 C ° 15 분, 30 S 95 ° C의 40 PCR 사이클 55를위한 C ° 30에 대한 C, 72 ° C 1 분, 72에서 마지막 확장자 ° 10 분 C하십시오. </li></ol> 2. 저밀도 microarrays에 RT - PCR 제품의 하이브리드화 <ol><li> FluChip의 하이브 리다이 제이션을위한 하나의 좌초 DNA을 생성하기 위해, 1.0 μl 람다의 exonuclease 효소, 수반되는 반응 버퍼의 2.2 μl와 nuclease없는 물 0.8 μl를 결합하여 효소 소화 혼합물을 준비합니다. 이 금액은 하나의 샘플에 대한하지만, 단순히 소화하는 샘플의 총수에 대한 크기를 조정하실 수 있습니다. 열 자전거 타는 사람에서 샘플을 제거하고 PCR 제품의 phosphorylated 가닥을 소화하기 위해 각각의 반응은 준비된 혼합물 4 μl를 추가합니다. 열 자전거 타는 사람 및 프로그램 효소 소화 및 열 조각 단계를 완료하는 데 10 분 동안 섭씨 95 도까지 다음 15 분 동안 섭씨 37 도까지 온도 자전거 타는 사람에 샘플을 반환합니다. </li><li> 사용되는 사용자 정의 인플루엔자 microarrays이 적용 Microarrays 주식 회사 (템피, AZ)에 의해 알데히드 기능화 유리 슬라이드에 인쇄됩니다. 5' - 아미노 종료 캡처 시퀀스는 (추가 3' - 비오틴 수정을 500 nm의의 최종 농도에서 발견되는 긍정적인 제어 시퀀스 제외) 최적화된 야생 버퍼와 결합하여 20 μm의의 최종 농도에 인쇄됩니다 . 방법을 찾는 비 접촉 300 μm의와 700 μm의 중심 피치 중심의 최적의 장소 직경과 함께 사용됩니다. </li><li> 저장 상자에서 microarrays를 제거하고 보호 시트를 제거하고 잘 주위에 단단히 눌러 microarrays 주위에 단일 사용 하이브 리다이 제이션 우물을 적용합니다. </li><li> 플레이스 60-90 RPM에서 궤도 통을 사용하여 5 분 미리 하이브 리다이 제이션 세척을위한 물을 정화의 110 ML를 포함 씻어 상자에 슬라이드. 부드럽게 잘 가장자리에 조직 와이퍼를 감동 물을 떠나 사악한 수 있도록하여 배열을 건조. </li><li> 조각난 ssDNA 제품의 각 2X 하이브 리다이 제이션 버퍼 22 μl, 그리고 microarray 우물에 하이브 리다이 제이션 솔루션 pipet 40 μl를 결합합니다. </li><li> 슬라이드 60 분 폐쇄 습도 챔버의 잡종 수 있습니다. </li><li> 습도 챔버에서 슬라이드를 제거 간단히 슬라이드 선반에 배치하기 전에 씻어 병에 워시 버퍼 D와 함께 배열을 씻어. 일반적으로 와시 버퍼 D의 rinsing 볼륨 배열 당 2 ML입니다. 1 분 60-90 RPM에서 궤도 쉐이크에 110 ML 와시 버퍼 A. 플레이스 bin을 포함 씻어 상자에서 슬라이드를 포함한 플레이스 슬라이드 선반. </li><li> 와시 버퍼에서 슬라이드 선반을 제거, 간단히 씻어 버퍼 D, 와시 버퍼 B를 포함하는 빈에게 이전 슬라이드 랙와 린스, 그리고 5 분 60-90 rpm으로 흔들. </li><li> 부드럽게 각 슬라이드에 배열을 건조하고, ampliPHOX Colorimetric 감지 단계 준비 습도 챔버에서 건조 슬라이드를 놓으십시오. </li></ol> 3. ampliPHOX : ampliTAG와 hybridized 제품 및 교정 칩 라벨링 <ol><li> 컴바인 ampliTAG 10 μl, 2X ampliTAG 버퍼 및 처리하는 각 배열에 대해 물을 정화 10 μl 20 μl. 시약 볼륨은 단순히 샘플의 총수에 대한 크기를 조정하실 수 있습니다. 필요한 모든 샘플 배열 및 교정 배열에 대해 계정에 충분한 라벨 혼합물을 준비하십시오. 필요한 교정 칩의 개수는 전체 교정 (새로운 기기 또는 시약의 새로운 많은 경우), 또는 악기 검사를 수행하는지 여부에 따라 달라집니다. 전체 보정을위한, 3 교정 칩을 표시해야하고, 시약의 확인, 단지 하나의 보정 칩을 표시해야합니다. 보정 배열이 표시되기 전에, 그들이 이전에 독감 배열에 대해 설명한 사전 하이브 리다이 제이션 세척 단계를 통해 이동해야 유의하시기 바랍니다. </li><li> 각 배열 라벨 혼합 40 μl를 전송하고 5 분 폐쇄 습도 챔버에서 진행하는 반응을 레이블링 수 있습니다. </li><li> 즉시 슬라이드 랙에 슬라이드를 삽입하기 전에 씻어 병에 워시 버퍼 D와 함께 배열을 씻어. 와시 버퍼 C의 110 ML를 포함하는 bin에 랙를 전송하고, 5 분 60-90 rpm으로 흔들. </li><li> 정화의 물로 채워진 두 번째 세차 상자를 사용하여, 소금 성분을 제거하는 세 가지 간단한 연속 수상 저러나 수행합니다. 부드럽게 우물의 가장자리에 조직 와이퍼를 만지고하여 배열을 건조. </li><li> microarrays 이제 제대로 ampliTAG으로 표시되며, ampliPHOX 감지 절차의 나머지 수행할 수 있습니다. 분류 배열 Photoactivati​​on 및 이미징은 24 시간 이내에 완료해야하며, 추가적인 배열을 사용할 때까지 어두운 슬라이드 상자에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 4. ampliPHOX : 교정, 신호 증폭, 및 이미징 <ol><li> 에 ampliPHOX 리더를 켜고 ampliVIEW 소프트웨어 photoactivati​​on 준비되었는지 확인하십시오. </li><li> 보정 칩을 사용하여 최적의 photoactivati​​on 시간을 확인합니다. 다음 소개하는 것 외에도,이 절차는 또한 ampliPHOX 운영 매뉴얼에 자세히 설명되어 있습니다. 보정 칩은 소프트웨어에 의해 결정 긍정적인 신호를 생성 보정 칩의 행 수를 극대화를 목표로, 분석의 감도를 최적화하기 위해 이용하는 biotinylated 제어 시퀀스 dilutions 일련의 포함되어 있습니다. </li><li> 4 ampliPHY를 제거 ° C, 상온에 따뜻한 있도록하고, 혼합을 간략하게 와동. Pipet 3 ampliPHY의 약병에 ampliPHY 향상제의 μl, 10 초 동안 철저히 와동. </li><li> 균등도 거품이 존재하지 있도록, 잘 ampliTAG - 라벨 배열을 포함하고있는 microarray에 ampliPHY 솔루션을 40 μl를 전송합니다. 각 응용 프로그램 사이의 ampliPHY 유리병을 닫습니다. ampliPHOX의 리더의 photoactivati​​on 베이에 microarray 슬라이드를 삽입합니다. </li><li> 첫 번째 보정 배열, 소프트웨어의 레프트 핸드 패널에있는 '시간'상자에서 기본 photoactivati​​on 시간을 사용하고 photoactivati​​on를 시작하는 녹색 '시작'버튼을 클릭하십시오. 마치고, 배열을 제거하고 여분의 ampliPHY를 제거하는 물 정화와 린스. 반점의 일부를 클리어 폴리머 형성은 이제 볼 수 있습니다. </li><li> 폴리머 명소 2 분 동안 건조하도록 허용, 다음 배열에 ampliRED 두 방울의 배포 및 2 분 동안 진행하는 염색법 수 있습니다. </li><li> 다음 신속하게 물을 정화하고 조직 닦아와 건조와 microarray 린스. </li><li> ampliPHOX 리더의 이미지 베이에 microarray를 삽입하고 영상 탭에서 '새 이미지 캡처'버튼을 클릭하십시오. 일단 몇 군데, 자르기를 조정하여 이미지를 저장합니다. </li><li> 분석 탭에서 분석을 시작 보정 칩 마스크와 '자동 배치'버튼을 선택합니다. 소프트웨어는 자동으로 계량 결과를 보여주는 '요약 기록'을 생산합니다. 이러한 결과를 바탕으로 photoactivati​​on 시간은 두 번째 보정 배열 10 초 조정이며, 절차는 반복됩니다. </li><li> 최적의 photoactivati​​on 시간이 결정되면, 샘플 배열은 보정 배열에 사용된 것과 같은 신호 증폭 및 이미징 프로토콜을 사용하여 처리할 수 있습니다. </li><li> 일단 이미지가 샘플 배열에 대한 캡처이며, 등 인플루엔자 배열 레이아웃 여기 설명된대로 특정 배열 레이아웃을위한 마스크는 created.The ampliVIEW 소프트웨어가 자동 이미지 분석을 수행하여 각 샘플에 대한 독감 subtyping 결과를 생성할 수 수있다. </li></ol> 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. ampliPHOX colorimetric 탐지 방법의 도식 그림. (A) Biotinylated 대상 DNA는 배열의 각 자리에 hybridized이며, (B) ampliTAG으로 표시. (C) ampliPHY 솔루션은 다음 추가되며, (D) 표시 폴리머의 명소를 형성하기 위해 빛에 노출. (E) 형성 폴리머의 명소는 이후 명암을 향상시킬 수있는 무독성 염료로 얼룩이 있습니다. ontent "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. (A) 인플루엔자 저밀도 microarray 레이아웃. 시퀀스 1-7 및 10-13 대상 독감, 그리고 시퀀스 8, 9 대상 인플루엔자 B. (B) ampliPHOX 같은 검색 패턴을 보여주는 2009 소설 H1N1 ( '돼지 독감') 시편의 (C) 형광 이미지 모두에 의해 방법. <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 왼쪽부터 인플루엔자 H3N2, H1N1 인간 기원 2009 년 소설 H1N1 (돼지 - 원점), 그리고 부정적인 표본에 대한 권리, 대표 ampliPHOX 이미지 수 있습니다. 모든 3 subtypes는 배열에 대한 시각 뚜렷한 패턴을 보여줍니다. 오직 MS2 내부 통제가 본 것을 부정의 공지 사항은 RT - PCR의 증폭을 나타내는 것은 저해되지 않았습니다.

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</ol>

저자의 모든 InDevR, 주식 회사, 비영리 법인의 직원입니다. InDevR는 여기에 설명된 ampliPHOX 기술을 상용화입니다.

여기에 제시 ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 낮은 밀도 microarray 애플 리케이션을위한 단일 색상 형광 검출에 대한 신속하고 저렴한 대안입니다. 그림 1에 간략하게 구조와 같이 검출 원리는 photoinitiator 라벨 (1B)의 사용에 따라 달라집니다. 단량체 함유 용액 (1C)의 존재에 빛이 노출 photoinitiator (ampl​​iTAG)가에만 표시 지역의 중합 반응 (1D) 실행하도록합니다. 인플루엔자 식별 및 subtyping을위한 DNA 배열에 여기 보여주지만,이 기술은 microarray에서 캡처한 모든 biotinylated 제품을 감지하는 확장할 수 있습니다. 예를 들어, 다른 시약 화학을 사용하는 photopolymerization 기반 감지에 대한 이전의 작품은 핵산과 항체 기반 배열 모두에서 증명되었습니다. 12 기타 또한 photopolymerization 기반 시스템의 항체와 단백질 기반의 애플 리케이션을위한 개념의 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비 </th><th> 제조 업체 </th><th> 카탈로그 # </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> Qiagen MinElute 바이러스 스핀 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 57,704 </td><td> 싱글 60 μl 용리 </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9,001,292 </td><td> 옵션 </td></tr><tr><td> ABI 9800 빠른 열전달 자전거 타는 사람 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,441,166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen RT - PCR OneStep 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> 키트는 사용하지 dNTPs </td></tr><tr><td> 2X 구경 버퍼 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> MI - 5007 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated dNTP 믹스 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> MI - 5009 </td><td></td></tr><tr><td> 람다의 exonuclease </td><td> Epicentre의 Biotechnologies </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> FluChip 프라이머 믹스 </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> 판매 아직 없습니다 </td></tr><tr><td> 올비털 쉐이크 </td><td> Madell 기술 </td><td> ZD - 9556 - A </td><td></td></tr><tr><td> 방식 와시 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> MI - 4002 </td><td></td></tr><tr><td> 랙 와시 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> MI - 4003 </td><td></td></tr><tr><td> 2X 하이브리드화 버퍼 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> MI - 5004 </td><td></td></tr><tr><td> 보정 칩 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> AP - 5006 </td><td></td></tr><tr><td> 버퍼에게 광고를 와시 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> MI - 5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> AP - 5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> AP - 5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2X ampliTAG 버퍼 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> AP - 5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, ampliPHY 향상제 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> AP - 5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

인플루엔자에의 dna microarray에 ampliphox colorimetric 검색

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

의 DNA microarrays은 병원균 검출을위한 강력한 도구로 부상했습니다. 예를 들어 1-5를 입력하고, subtype의 독감 바이러스에 대한 능력의 많은 사례가 증명하고 있습니다.의 DNA microarrays에 독감의 6-11 식별 및 subtyping은 모두 공개 응용 프로그램을 가지고 건강과 조기 발견, 신속한 개입, 그리고 인플루엔자 유행의 영향을 최소화를위한 병원. 전통적인 형광 현재 가장 일반적으로 사용되는 microarray 검색 방법입니다. microarray 기술은 임상 사용을 향해 진행 그러나, 1 저비용 탐지 기술은 형광과 비슷한 성능 특성을 전시와 함께 고가의 장비를 대체하는 것은 microarray assays 더 매력적이고 비용 효율적인 것입니다. ampliPHOX colorimetric 탐지 기술 연구 애플 리케이션을위한, 그리고 형광 microarray에 필요한 공촛점 microarray 스캐너에 비해 대략 10 배로 낮은 악기 비용중인 주요 장점과 함께, 전통적인 형광 11 크기 중 하나를 순서 내에서 감지 한계를 가지고있다 감지. 또 다른 장점은 기존의 형광 악기와는 달리, 이동성과 유연성 수있는 악기의 컴팩트 사이즈입니다. 중합 기술 형광 감지만큼 본질적으로 선형되지 않기 때문에, 그러나, 그것은 최고의 같은 병원체 검출 배열에 관해서는 특정 순서의 존재에 대한 예 / 아니오 대답이 원하는되는 낮은 밀도 microarray 어플 리케이션에 적합합니다. 현재 ampliPHOX 감지와 호환 최대 현장 밀도 ~ 1800 장소 / 배열입니다. 때문에 현장 밀도 제한의 높은 밀도 microarrays은 ampliPHOX 감지에 적합하지 않습니다. 여기, 우리는 인플루엔자 바이러스의 검출 및 특성 (FluChip)에 대한 개발 저밀도 microarray에 신호 증폭의 방법으로 ampliPHOX colorimetric 탐지 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 ampliPHOX 감지, 비슷한 방식으로 표시하고 감지할 수 biotinylated 목표를 통합하는 microarray 중 하나가 특정 응용 프로그램으로 FluChip을 (DNA microarray)를 사용하지만. 캡쳐하는 대상의 microarray 디자인과 biotinylation은 사용자의 책임입니다. biotinylated 대상이 배열에 캡처되면 ampliPHOX 감지가 먼저 태그에 의해 streptavidin - 라벨 공액 (ampl​​iTAG)로 배열을 수행할 수 있습니다. 단량체 솔루션의 ampliPHOX 리더 악기, 중합을 사용하여 빛의 노출시 (ampl​​iPHY) ampliTAG - 표시 대상을 포함하는 지역에서만 발생합니다. 형성된 고분자는 연속적 간단한 소프트웨어 패키지 (ampl​​iVIEW)을 사용하여 이미징 및 분석 다음 영상 대비를 향상시킬 수있는 무독성 솔루션을 물들일 수 있습니다. 결과 해제 추출 샘플에서 전체 FluChip 분석은 약 6 시간 수행할 수 있으며, 위에서 설명한 ampliPHOX 탐지 단계는 약 30 분 안에 완료할 수 있습니다.

ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

DNA 마이크로어레이는 병원체 검출을 위한 강력한 도구로 부상했습니다.1-5 예를 들어, 인플루엔자 바이러스를 유형 및 아형으로 분류하는 능력의 여러 사례가...

다음 실험의 전반적인 목표는 새롭고 신속한 신호 증폭 방법을 활용하여 저밀도 마이크로어레이 플랫폼인 flu chip에서 인플루엔자 바이러스 아형을 검출하고 특성화하는 것입니다. 이는 biotinylated DTP를 통합하고 5' 말단에 인산기가 있는 프라이머를 사용하여 인플루엔자 RNA 추출물로부터 matrix 유전자 세그먼트와 non-structural 유전자 세그먼트를 증폭함으로써 달성됩니다. PCR 이후 효소 소화 및 단편화를 통해 짧은 단일 가닥의 biotinylated 증폭 바이러스 산물을 생성하며, 이를 어레이에 하이브리드화합니다.Fox 검출법은 광중합을 이용해 하이브리드화가 일어나는 커다란 폴리머 스팟을 성장시키며, 서로 다른 하이브리드화 패턴을 통해 인플루엔자 바이러스 아형을 검출합니다. 표준 형광 검출과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 비용이 상당히 저렴하고, 형광 검출과 유사한 분석 감도를 가지면서도 육안으로 빠르게 결과를 확인할 수 있다는 점입니다. 또한, 이 방법은 보편적인 검출법이기 때문에 flu 칩을 사용하여 인플루엔자 바이러스의 특성 분석에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.Ampl Fox는 다른 DNA 및 단백질 기반 저밀도 마이크로어레이와 같이 매우 다양한 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이론적으로 모든 비오틴화 생성물은 amox를 사용하여 검출할 수 있어야 합니다. 이번 절차의 시연은 지난 몇 년 동안 Fox 기기 및 검출 화학 개발의 중심 역할을 해온 Endeavor의 부연구원인 Amber Taylor와 연구 보조원인 Kevin Moulton이 담당하겠습니다.바이러스 RNA 추출 키트와 제조사의 프로토콜을 사용하여 200 µL의 바이러스 분리물에서 바이러스 RNA를 추출합니다. 최종 부피 60 µL로 용출하고, 추출물은 나중에 사용하기 위해 -70 °C 이하에서 보관합니다. 그다음 제조사의 프로토콜에 따라 얼음 위에서 RT-PCR 마스터 믹스를 준비합니다.BIOTINYLATED DNTP 혼합물을 사용하여, 표시된 농도가 포함된 flu 칩 프라이머 믹스를 마스터 믹스에 추가합니다. 효소 소화를 촉진하기 위해 각 세트 중 하나의 프라이머는 5' 인산기를 포함해야 합니다. flu A 프라이머 세트는 1032 base pair 생성물을 생성하며, flu B 프라이머 세트는 811 base pair 생성물을 생성합니다.마스터 믹스를 가볍게 볼텍싱한 후 18 µL씩 얇은 벽 PCR 튜브에 분주합니다. 그런 다음 각 반응 튜브에 2 µL의 RNA 템플릿을 첨가합니다. PCR 튜브를 서멀 사이클러로 옮기고 적절한 어닐링 온도가 설정된 사이클링 프로파일을 사용하여 반응시킵니다.이 분석에 사용된 사이클링 프로필이 여기에 제시되어 있습니다. PCR 반응당 효소 반응 버퍼 2.2 microliters, nuclease free water 0.8 microliters 및 lambda exonuclease enzyme 1.0 microliters를 혼합하여 효소 소화 믹스를 준비하십시오. 써멀 사이클러에서 샘플을 꺼내 각 PCR 튜브에 4 microliters씩 추가하십시오.시료를 써멀 사이클러에 다시 넣고, 써멀 사이클러를 표시된 대로 37 °C에서 15분, 이어서 95 °C에서 10분이 되도록 설정합니다. 다음으로, 하이브리드화할 마이크로어레이 주변에 일회용 하이브리드화 웰을 배치합니다. 그런 다음 오비탈 쉐이커 위에서 110 mL의 정제수로 슬라이드를 5분 동안 세척합니다.웰의 가장자리에 티슈 와이프를 살짝 접촉시켜 슬라이드를 건조합니다. 2x 하이브리드화 버퍼 22 µL를 각각의 단편화된 단일 가닥 DNA 생성물과 혼합하여 짧게 섞은 후, 40 µL를 마이크로어레이 웰에 피펫팅합니다. 습도 챔버 내에서 1시간 동안 슬라이드를 하이브리드화합니다. 하이브리드화가 완료되면 슬라이드를 습도 챔버에서 꺼내어 각 슬라이드를 세척 버퍼 D 2 mL로 짧게 헹굽니다. 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣습니다.다음으로, 오비탈 셰이커를 사용하여 각각의 용기에 세척 버퍼 A와 B를 110 milliliters씩 넣습니다. 이후 모든 세척 단계에서 사용될 속도인 60 to 90 RPM으로 슬라이드 랙을 버퍼 A에서 1분 동안 세척합니다. 그 다음 슬라이드 랙을 세척 버퍼 A에서 꺼내어 세척 버퍼 D로 짧게 헹굽니다. 슬라이드 랙을 세척 버퍼 B로 옮기고 오비탈 셰이커에서 5분 동안 세척합니다.세척 후, 각 슬라이드 위의 어레이를 티슈 와이프로 부드럽게 건조시키고 건조된 슬라이드를 습도 챔버에 넣습니다. Fox 컬러 메트릭 검출 단계를 준비하기 위해, 처리할 각 어레이당 amplitude 10 µL, 2x amplitude 버퍼 20 µL, 정제수 10 µL를 혼합합니다. 라벨 혼합물 40 µL를 각 어레이에 옮기고 밀폐된 습도 챔버에서 5분 동안 라벨링 반응이 진행되도록 합니다. 하이브리드화가 진행되는 동안, 용기에 세척 버퍼 C 110 mL를 준비합니다. 라벨링 후, 각 어레이를 세척 버퍼 D로 즉시 헹굽니다. 각 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣고 오비탈 셰이커에서 세척 버퍼 C로 5분 동안 세척합니다. 버퍼 C 세척 후, 슬라이드 랙을 정제수가 담긴 용기에 세 번 빠르게 담갔다 뺍니다.염분 잔여물을 제거하기 위해 이전 단계에서 설명한 대로 어레이를 건조합니다. 광활성화 및 이미징이 완료될 때까지 어레이를 어두운 슬라이드 보관함에 보관하며, 이 과정은 24시간 이내에 완료해야 합니다. 다음으로, Amli Fox 리더를 켜고 어레이 샘플 검출 전 광활성화를 위해 Amli view 소프트웨어가 준비되었는지 확인합니다.먼저, 짧은 캘리브레이션 절차에 따라 모든 샘플에 대한 최적의 광활성화 시간을 결정합니다. 매일 사용 전 한 번, Amplify 솔루션을 실온으로 데운 후 짧게 볼텍싱하여 혼합하고, Amplify 인핸서 3 µL를 Amplify 바이알에 피펫으로 넣고 충분히 볼텍싱합니다. 10초 동안 한 번에 하나의 슬라이드에만 Amplify 솔루션 40 µL를 기포가 생기지 않도록 고르게 도포합니다.마이크로어레이 슬라이드를 Amplify Reader의 광활성화 베이(photo activation bay)에 삽입하십시오. 캘리브레이션 과정에서 결정된 광활성화 시간을 사용하여 PL view 소프트웨어에서 'start'를 선택하여 광활성화를 시작하십시오. 완료되면, 과량의 amplify clear 폴리머를 제거하기 위해 마이크로어레이를 2 mL의 정제수로 헹굽니다. 이제 표적 DNA가 포함된 스팟에서 폴리머 형성이 일어났으며, 이를 통해 시각화가 더욱 용이해집니다.염색 후, 폴리머 스팟을 2분 동안 건조시킵니다. 그다음 Amply Red 두 방울을 어레이에 떨어뜨리고 2분 동안 염색을 진행합니다. 염색 후 슬라이드를 정제수로 빠르게 헹구고 앞서 설명한 방법으로 건조시킨 뒤, 슬라이드를 Amli Fox 리더의 이미징 베이에 삽입하고 Amli 소프트웨어를 사용하여 이미지를 수집하고 결과를 처리합니다. 왼쪽 이미지는 Amli Fox를 통해 검출한 2009년 신종 H1N1 표본을 보여줍니다.오른쪽 이미지는 공초점 형광 마이크로어레이 스캐너로 생성된 전통적인 형광을 사용한 것이지만, 두 방법 모두에서 동일한 전체 검출 패턴을 쉽게 확인할 수 있습니다. 하지만 Amli fox 결과는 육안으로 확인 가능합니다. 이 이미지들은 인간 유래 H3N2, 인간 유래 H1N1, 돼지 유래 H1N1 및 인플루엔자가 검출되지 않은 음성 fox 어레이의 flu 칩 결과를 보여줍니다.파란색으로 표시된 서열 2와 3은 표시된 모든 인플루엔자 아형에 대해 신호를 생성합니다. 반면, 오른쪽 하단의 빨간색으로 표시된 서열은 돼지 유래 H1N1 검체에 대해서만 신호를 생성합니다. 음성 검체는 초록색으로 표시된 내부 대조군 서열에서 신호를 보여, RT-PCR 반응의 억제나 실패가 없었음을 나타냅니다.전체 과정을 숙달하면 바이알 추출부터 amox 검출 및 최종 결과 해석까지 약 6시간 만에 수행할 수 있습니다. 기기 보정을 포함한 Ampl Fox 검출 단계는 본 절차를 따르면 약 30분 내에 완료될 수 있습니다. 추가적인 의문을 해결하기 위해 부분 또는 전체 게놈 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 인플루엔자 분석법은 특히 고유한 하이브리드화 패턴이 나타나는 샘플에 대한 초기 스크리닝 용도로 설계되었습니다. 본 검출법은 일반적인 분석법이므로, 연구자들이 검출 효율을 통해 가치를 더할 수 있는 새롭고 흥미로운 저밀도 마이크로어레이 응용 분야를 찾을 수 있기를 바랍니다.

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Virochip 동시에 보존 순서 상동에 기초하여 모든 알려진 바이러스뿐 아니라 소설의 바이러스를 검출하기위한 판 - 바이러스 microarray입니다. 여기 알려진 알려지지 않은 두 바이러스의 존재에 대한 임상 샘플을 분석 Virochip 분석을 실행하는 방법을 보여줍니다.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

이 비디오에서는 인플루엔자 바이러스 균주의 항원 아형이 인쇄된 마이크로어레이 슬라이드를 사용하여 여러 인간 혈청 샘플에서 항체 동형을 검출하는 프로세스를 보여줍니다.

바이러스 항원에 대한 혈청 내 항체 동형을 검출하기 위한 바이러스 항원 마이크로어레이 분석

이 비디오는 인플루엔자 바이러스 A와 B를 정량화하기 위한 분석을 보여줍니다. 이 분석은 인플루엔자 특이적 프라이머를 사용한 니킹 엔도뉴클레아제 증폭과 분자 비콘 프로브를 사용한 표적 검출을 사용합니다.

인플루엔자 A 및 B 바이러스를 정량화하기 위한 분자 기반 분석

통합 마이크로 열가소성 칩은 분자 진단으로 사용하기 위해 개발되었습니다. 이 칩은 핵산 추출, 역 transcriptase 및 PCR을 수행합니다. 제조 및 칩을 실행하기위한 방법은 설명되어 있습니다.

마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법

증폭 마이크로 어레이 크게 최종 사용자를위한 마이크로 어레이 플로 간소화 단일 챔버로 비대칭 PCR 증폭 및 마이크로 어레이 혼성화를 결합한다. 마이크로 어레이 워크 플로우를 간소화하는 것은 정기적으로 낮은 자원 환경에서 사용할 수있는 마이크로 어레이 기반의 진단 프로그램을 만들기위한 필요한 첫 번째 단계입니다.

다중 약물 내성을 보여<em&gt; 결핵균</em&gt; 증폭 마이크로 어레이

인쇄된 글라이칸 마이크로어레이 전략을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 열성 및 시알산 함유 수용체에 대한 특이성을 분석하기 위해 기존의 96웰 플레이트 분석을 소형화했습니다.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

우리는 분자 기반 인플루엔자 A, 신속하고 B 분석에 대해 설명합니다. 인플루엔자 분석은 분자 표지 프로브와 표적 탐지 뒤에 인플루엔자 특이 프라이머를 등온 증폭을 이용하여 15 분 이내에 각 대상을 감지합니다. 인플루엔자 A와 B의 분석은 사용자 친화적이고 수행 할 최소한의 실습 시간이 필요합니다.

빠른 분자 탐지 및 인플루엔자 바이러스 A와 B의 차별화

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

우리는 다른 바이러스 긴장에서 250개 이상의 항원에 대하여 다중 항체 이소타입을 위한 혈청을 동시에 조사하기 위하여 니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드에 인플루엔자 항원을 인쇄해서 건설된 단백질 마이크로어레이를 이용하기 위한 프로토콜을 제시합니다, 이렇게 바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭의 측정을 허용.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

학습하세요 인플루엔자 바이러스 아형을 빠르게 검출하는 ampliPHOX 색소 검출법을 이용한 DNA 마이크로어레이 분석법입니다. 이 방법은 형광 검출 대비 저렴하면서도 눈으로 확인 가능한 신속한 결과를 제공합니다.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

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