인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

다음 실험의 전반적인 목표는 새롭고 빠른 신호 증폭 방법을 활용하여 저밀도 마이크로어레이 플랫폼인 독감 칩에서 인플루엔자 바이러스 아형을 검출하고 특성화하는 것입니다. 이는 비오틴화된 DTP를 통합하고 5개의 프라임 포스폴 말단을 가진 프라이머를 사용하여 인플루엔자 RNA 추출물의 매트릭스 유전자 세그먼트와 비구조적 유전자 세그먼트를 증폭함으로써 달성됩니다. PCR 후 효소 분해 및 단편화를 통해 짧은 단일 가닥 비오틴화 및 증폭된 바이러스 산물을 생성하고, 이는 혼성화 후 어레이에 혼성화됩니다.

여우 검출은 광 중합을 사용하여 혼성화가 발생하는 큰 폴리머 반점을 성장시키고 차등 혼성화 패턴을 사용하여 인플루엔자 바이러스 아형을 검출합니다. 표준 형광 검출과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 다소 저렴하고 형광과 유사한 분석 감도로 육안으로 볼 수 있는 빠른 결과를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 보편적인 검출 방법이기 때문에 독감 칩을 사용하여 인플루엔자 바이러스의 특성화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Ampl Fox는 다른 DNA 및 단백질 기반 저밀도 마이크로어레이와 같은 다양한 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이론적으로 모든 비오틴화 제품은 아목스를 사용하여 검출할 수 있어야 합니다. 지난 몇 년 동안 Fox 기기 및 검출 화학 개발의 중심에 서 있는 Endeavor의 연구원인 Amber Taylor와 연구 조교인 Kevin Moulton이 이 절차를 시연할 것입니다.

바이러스 RNA 추출 키트와 제조업체의 프로토콜을 사용하여 200마이크로리터의 바이러스 분리물에서 바이러스 RNA를 추출합니다. 60마이크로리터의 최종 부피를 용리하고 나중에 사용할 수 있도록 섭씨 영하 70도 이하에서 추출물을 보관합니다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 ICE에서 R-T-P-C-R 마스터 믹스를 준비합니다.

BIOTINYLATED DNTP 혼합물을 사용하여 마스터 믹스에 표시된 농도가 포함된 독감 칩 프라이머 믹스를 추가합니다. 각 세트의 프라이머 1개에는 효소 분해를 촉진하기 위해 5개의 프라임 포스폴 그룹이 포함되어야 합니다. 독감 A 프라이머 세트는 1032 염기쌍 제품을 생성하고, 독감 B 프라이머 세트는 811 염기쌍 제품을 생성합니다.

18마이크로리터의 마스터 믹스를 간단히 와류로 가열하여 얇은 벽의 PCR 튜브에 분배합니다. 그런 다음 각 반응 튜브에 2마이크로리터의 RNA 템플릿을 추가합니다. PCR 튜브를 열 순환기로 옮기고 적절한 무릎 꿇기 온도의 사이클링 프로파일을 사용합니다.

이 분석에 사용된 사이클링 프로파일은 다음과 같습니다. PCR 반응당 2.2 마이크로리터의 효소 반응 완충액, 0.8 마이크로리터의 뉴클레아제 유리수 및 1.0 마이크로리터의 람다 엑소뉴클레아제 효소를 결합하여 효소 분해 혼합물을 준비합니다. 열 순환기에서 샘플을 제거하고 각 PCR 튜브에 4마이크로리터를 추가합니다.

샘플을 열 순환기로 반환하고 그림과 같이 열 순환기를 섭씨 37도에서 15분 동안 프로그래밍한 다음 섭씨 95도에서 10분 동안 프로그래밍합니다. 다음으로, 하이브리드화할 마이크로어레이 주위에 일회용 하이브리드화 웰을 적용합니다. 그런 다음 110ml의 정제수로 슬라이드를 오비탈 셰이커에서 5분 동안 세척합니다.

티슈 물티슈를 우물 가장자리에 부드럽게 만져 슬라이드를 말리십시오. 22마이크로리터의 2 x hybridization buffer를 단편화된 단일 가닥 DNA 산물 각각과 간단히 혼합하고 40μl를 microarray well에 피펫팅합니다. 하이브리드화 후 습도 챔버에서 슬라이드를 1시간 동안 하이브리드화하고 습도 챔버에서 슬라이드를 제거하고 각 슬라이드를 2밀리리터의 세척 버퍼로 간단히 헹굽니다. D. 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣습니다.

다음으로, 오비탈 셰이커를 사용하여 110ml의 세척 버퍼 A와 B를 별도의 용기에 추가합니다. 버퍼 A의 슬라이드 랙을 60-90RPM으로 세척하고 이후 모든 세척에 사용되는 속도를 1분 동안 세척합니다. 그런 다음 세척 버퍼 A에서 슬라이드 랙을 제거하고 세척 버퍼 D로 간단히 헹굽니다. 슬라이드 랙을 세척 버퍼 B로 옮기고 오비탈 셰이커에서 5분 동안 세척합니다.

세척 후 티슈 닦음으로 각 슬라이드의 어레이를 부드럽게 말리고 건조된 슬라이드를 습도 챔버에 넣습니다. 여우 색상 메트릭 검출 단계를 준비하기 위해 각 어레이를 처리하기 위해 10 마이크로 리터의 진폭, 2 개의 x 진폭 완충액 20 마이크로 리터 및 10 마이크로 리터의 정제수를 결합하고 40 마이크로 리터의 라벨 혼합물을 각 어레이에 전달하고 밀폐 된 습도 챔버에서 라벨링 반응이 진행되도록합니다 5 분 동안 혼성화 중, 용기에 110ml의 세척 완충액 C를 준비합니다. 라벨링 후 즉시 각 어레이를 세척 버퍼로 헹굽니다 D. 슬라이드 랙에 각 슬라이드를 놓고 버퍼 바다 세척 후 5 분 동안 오비탈 셰이커에서 버퍼 C를 세척 및 세척하고 슬라이드 랙을 정제수 용기에 세 번 짧게 담그십시오.

소금 잔여물을 제거하려면 앞서 표시된 대로 어레이를 건조시키십시오. 24시간 이내에 완료되어야 하는 사진 활성화 및 이미징이 완료될 때까지 어레이를 어두운 슬라이드 상자에 보관하십시오. 그런 다음 Amli Fox 리더를 켜고 어레이 샘플을 감지하기 전에 Amli 보기 소프트웨어가 사진을 활성화할 준비가 되었는지 확인합니다.

먼저, 간단한 보정 절차에 따라 모든 샘플에 대한 최적의 광 활성화 시간을 결정합니다. 매일 한 번 Amplify 용액을 실온으로 데우고 잠시 와류를 일으켜 3마이크로리터의 앰플리파이 인핸서를 앰플리파이 바이알에 넣고 와류를 완전히 섞습니다. 10초 동안 40마이크로리터의 Amplify 용액을 한 번에 하나의 슬라이드에만 균일하게 도포하여 기포가 없는지 확인합니다.

마이크로어레이 슬라이드를 Amplify Reader의 사진 활성화 베이에 삽입합니다. 를 선택하여 사진 활성화를 시작하고 보정 프로세스에서 결정된 사진 활성화 시간을 사용하여 PL 보기 소프트웨어에서 시작합니다. 완료되면 마이크로어레이를 2밀리리터의 정제수로 헹구어 과잉 증폭 투명 폴리머 형성을 제거하고, 이제 표적 DNA를 포함하는 지점에서 발생했지만 더 잘 시각화됩니다.

염색 후 폴리머 반점을 2분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 어레이에 충분한 빨간색 두 방울을 분배하고 2분 동안 염색을 진행하도록 합니다.염색 후 앞서 그림과 같이 슬라이드를 정제수로 빠르게 헹구고 건조시킨 다음 슬라이드를 Amli Fox 리더의 이미징 베이에 삽입하여 amli 소프트웨어를 사용하여 결과를 처리하는 이미지를 수집합니다. 왼쪽 이미지는 Amli Fox의 2009년 소설 H one N one 표본의 탐지를 보여줍니다.

오른쪽 이미지는 컨포칼 형광 마이크로어레이 스캐너에서 생성된 기존 형광을 사용하지만, 두 방법 모두에서 동일한 전체 검출 패턴을 쉽게 볼 수 있습니다. 그러나 Amli 여우 결과는 육안으로 볼 수 있습니다. 이 이미지는 인간 기원, H 3 N 2 인간 기원, H 1 N 1, 돼지 기원, H 1 N 1 및 검출 가능한 인플루엔자가 없는 음성 여우 배열의 독감 칩 결과를 보여줍니다.

파란색으로 표시된 시퀀스 2와 3은 모든 인플루엔자에 대한 신호를 생성합니다. 아형이 표시되었지만 오른쪽 하단에서 빨간색으로 표시된 염기서열은 돼지 기원에 대한 신호만 생성하며, H는 N 1 표본입니다. 음성 검체는 녹색으로 표시된 내부 제어 시퀀스의 신호를 표시하며, 이는 R-T-P-C-R 반응의 억제 또는 실패가 없음을 나타냅니다.

일단 마스터하면 바이알 추출부터 아목스 검출 및 최종 결과 해석에 이르는 전체 프로세스를 약 6시간 내에 수행할 수 있습니다. 기기 보정을 포함한 절차의 Ampl Fox 감지 부분은 이 절차에 따라 약 30분 내에 완료할 수 있습니다. 추가 질문에 답하기 위해 부분 또는 전체 게놈 염기서열 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 인플루엔자 분석은 특히 고유한 혼성화 패턴을 초래하는 샘플에 대한 초기 스크리닝으로 사용됩니다. 검출은 일반적인 분석법이기 때문에 연구자들이 검출이 가치를 더할 수 있는 새롭고 흥미로운 저밀도 마이크로어레이 응용 분야를 찾기를 바랍니다.