절연, 환기 및기구 마우스 폐의 특성화는 타악기 흐름 Perfused

박동성 폐압 흐름 관계를 연구합니다. 이 프로토콜은 마우스 폐를 분리, 환기 및 관류하는 방법을 설명합니다. 기관은 인공호흡을 위해 외과적으로 노출됩니다.

그런 다음 심장과 폐를 분리하여 폐동맥과 좌심방을 캐뉼레이션할 수 있습니다. 그런 다음 폐계를 관류합니다. 실험은 폐동맥의 흐름, 크기, 파형 및/또는 주파수를 변경하여 수행됩니다.

그 결과로 생성된 폐동맥 및 좌심방 압박 파형이 기록되고 박동 폐압 흐름 관계를 보여줍니다. 생체 내 제제와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 압력 흐름 관계의 변화입니다. 박동 압력 흐름 관계는 볼륨 상태, 교감 신경계 톤, 활동 및 마취 효과의 변화가 없는 경우 얻을 수 있습니다.

또한 대부분의 분리된 폐 제제는 일정한 압력 흐름 관계만 측정하는 반면, 당사의 기술은 박동 압력 흐름 관계를 결정할 수 있습니다. 이 방법은 폐 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 폐 혈관 질환이 박동성 폐 혈류역학에 어떤 영향을 미치는지, 또는 큰 폐동맥 경화가 우심실 후부하에 어떤 영향을 미치는지? 심장과 폐를 노출시키고 폐동맥에 캐뉼라를 고정하는 것은 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.

기구의 과도한 압력은 폐에 부종을 유발할 수 있으며 부적절한 캐뉼러 배치는 폐동맥에 구멍을 낼 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 분리된 폐를 환기시키고 관류하는 데 사용되는 IL one 시스템을 준비해야 합니다. 튜브는 압력 변환기에 연결해야 합니다.

O 단독 펌프 및 유량계 섭씨 37도로 예열된 증류수로 시스템을 완전히 세척하고 튜브의 기포를 제거합니다. 그런 다음 Endur tech 펌프 튜브에 1%PBS를 프라이밍합니다. 이제 0입니다.

각 P 75 트랜스듀서에 대한 압력은 먼저 IL one 시스템에 대한 밸브를 닫고 대기에 밸브를 개방합니다. 그런 다음 플러그 SIS 증폭기를 사용하여 동물을 준비하기 전에 압력을 자동으로 영점화하고 세라믹 다공성 조각을 증류수에 담가 IO one 설정을 가습합니다. 생쥐를 마취한 후 앞발을 코르크 판자에 고정하여 수술을 위해 생쥐를 안정시킵니다.

이제 가슴에 95% 알코올을 뿌립니다. 곧은 집게를 사용하여 목의 피부를 잡고 곧은 가위로 1cm 구멍을 자릅니다. 목 안쪽이 드러나면 식도와 기관을 찾으면서 표재성 근육의 흰색 선 조직을 잘라냅니다.

식도와 기관을 양쪽 및 뒤쪽 조직에서 분리하고 기관 주위에 느슨한 봉합사를 묶습니다. 기관을 캐뉼링하려면 작은 가위로 작은 V를 한쪽 면으로 조심스럽게 자릅니다. 이제 뭉툭한 집게를 사용하여 마우스를 IL 1 시스템으로 가져갑니다.

기관 캐뉼라를 잡고 기관 안으로 밀어 넣습니다. 봉합사로 캐뉼라를 고정합니다. 먼저 실내 공기로 환기를 시작하고 가슴에 알코올을 뿌리고 곧은 집게와 곧은 가위를 사용하여 피부를 제거합니다.

흉골을 따라 피부를 위쪽으로 자릅니다. 양쪽의 피부를 들어 올리고 아래쪽 갈비뼈의 선을 따라 자릅니다. 이제 핀셋으로 xiphoid 과정을 잡고 볼 팁 가위를 사용하여 흉골 바닥과 만나는 횡격막의 구멍을 자릅니다.

다이어프램을 잡고 갈비뼈에서 잘라냅니다. 볼 팁 가위를 사용하여 xiphoid 과정을 다시 잡고 볼 팁 가위를 사용하여 폐, 심장 또는 혈관을 손상시키지 않고 갈비뼈를 통해 흉골을 조심스럽게 자릅니다. 심장을 드러내려면 왼쪽 갈비뼈를 잡고 끝을 잘라냅니다.

이제 우심실에 0.1ml의 헤파린을 천천히 주입합니다 주사 후 나머지 갈비뼈를 잘라냅니다. 집게의 뒤쪽이나 둥근 끝을 사용하여 현미경으로 갈비뼈를 절단하면서 폐를 갈비뼈에서 부드럽게 밀어냅니다. 심장 위쪽의 지방에서 선 조직을 제거합니다.

핀셋을 사용하여 티슈를 떼어내고 잘라냅니다. 스프링 가위로 대동맥과 폐동맥 주위에 봉합사를 놓고 무딘 핀셋으로 심장을 부드럽게 숟가락으로 떠냅니다. 저항이 거의 없어야 합니다.

이제 더블 스로우로 느슨한 봉합사를 묶습니다. 다음으로 하복부를 잘라냅니다. 각진 가위를 사용하여 갈비뼈와 척추를 자릅니다.

이것은 상당한 양의 혈액을 흐르게 할 것입니다. Q-tip을 사용하여 흐름을 막습니다. 혈류가 멈추면 10ml의 RPMI가 채워진 주사기에서 4ml의 RPMI로 IL 시스템에 프라임합니다.

튜브에 기포가 없는지 다시 확인하는 것이 좋습니다. 이제 정점 근처에 작은 노치를 자르고 캐뉼라를 삽입하여 우심실을 캐뉼러합니다. 프로브의 끝은 거의 투명한 폐동맥 벽을 통해 볼 수 있어야 합니다.

그런 다음 캐뉼라, 대동맥 및 폐동맥 주위의 봉합사를 조여 좌심실을 캐뉼링합니다. 정점에 노치를 자르고 위쪽을 목표로 캐뉼라를 왼쪽 심방에 삽입합니다. 밸브를 찾기 위해 약간의 압력이 필요할 수 있지만 일단 발견되면 캐뉼라가 빠져나와 봉합사 없이 고정됩니다.

유출 튜브에서 흐름이 보일 때까지 10ml 주사기에서 분당 0.3ml의 RPMI를 수동으로 주입합니다. 유출 튜브에 흐름이 없으면 좌심실 캐뉼라를 재배치합니다. 그러나 폐에 흐름이 없으면 폐동맥에 누출이 있을 가능성이 있으므로 실험을 중단하십시오.

이제 심장이 완전히 캐뉼레이션되었으므로, 60ml 주사기를 IL one 시스템에 연결합니다. 정상 유량 펌프를 사용하여 RPMI Perfuse eight을 분당 1ml의 속도로 주입합니다. 초기 관류 중 누출을 확인하십시오.

2분 더 서서히 폐를 관류시키면 폐가 하얗게 변합니다. pulsatile flow 연구용. 먼저 단독 펌프 피스톤 변위를 원하는 수준으로 설정합니다.

그런 다음 일정한 유량을 설정합니다. 이제 osli 펌프의 밸브를 열고 osli 흐름 프로파일을 실행하기 직전에 데이터 기록을 시작합니다. 완료되면 데이터 출력 파일을 열고 초기 시험의 실험 흐름을 기반으로 실험 흐름을 플롯합니다.

Q max가 원하는 대로 되도록 각 주파수에서 진동 펌프 피스톤 변위를 조정합니다. 일정한 압력으로 환기 유지 정상 유량 시험을 위한 데이터 수집 중에는 단독 펌프의 밸브를 닫고 정상 유량을 원하는 수준으로 설정하십시오. 데이터 기록을 시작하고 정상 흐름 프로토콜을 단계별로 진행합니다.

최소 10초 동안 데이터 수집 시도 사이의 각 유속에서. 유속을 분당 0.5밀리리터로 재설정합니다. 데이터를 수집하는 동안 환기를 일정한 압력으로 유지하십시오.

제로 좌심방 압박 시험을 원하는 경우 시험을 수행하는 동안 유출 튜브를 제거합니다. 기도 튜브에서 RPMI를 주의 깊게 관찰하십시오. RPMI가 기도 압력 변환기에 닿지 않도록 해야 하며, 그렇지 않으면 손상될 수 있습니다.

다음은 다양한 조건에서 맨 윗줄의 흐름 Q와 함께 꾸준한 흐름 관류와 그 결과 두 번째 줄의 폐동맥 및 좌심방 압력의 결과입니다. 처음 두 패널에서는 유출 튜브가 제자리에 있었기 때문에 Q에 따라 좌심방 압력이 증가 및 감소했고, 첫 번째 패널은 끝의 기압, 흡기 압력을 표시하고, 두 번째 패널은 끝 호기압의 기압을 표시합니다. 다음으로, 튜브를 제거하여 좌심방 압력이 일정하고 Q와 무관하도록 한 다음 출구 튜브의 높이를 수동으로 조정하여 좌심방 압력이 더 높도록 했습니다.

그러나 Q와 무관하게 첫 번째 패널은 끝의 기압, 흡기 압력을 표시하고 두 번째 패널은 끝의 기압을 표시합니다. 호기압. 각 사례에 대한 결과적인 안정적인 폐동맥 압력 흐름 관계는 압력 대 흐름을 플로팅하여 얻을 수 있습니다.

다음은 상단 패널의 흐름 Q와 함께 박동 흐름 관류와 그에 따른 폐동맥, 좌심방 및 기압의 결과입니다. 아래쪽 패널에서. 이러한 박동성 폐압 흐름 관계에서 폐혈관 임피던스를 계산할 수 있으며, 이는 총 우심실 후부하를 반영합니다.

이 기술을 숙달하면 20분에서 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 손이 안정될 수 있도록 시간을 갖고 긴장을 푸는 것이 중요합니다. 폐가 적절하게 관류되면 어려운 부분이 끝납니다.

이 절차에 따라 폐 조직에 대한 조직학 또는 생화학적 분석과 같은 다른 기술을 수행하여 폐 박동 압력 흐름 관계에서 관찰된 변화를 담당하는 분자 메커니즘과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 폐 생리학 분야의 연구자들이 유전자 변형 마우스를 사용하여 폐 혈관 질환의 발병 및 진행에서 특정 유전자 및 단백질의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.