Name: C로 생체내 레이저 Axotomy에서 엘레간스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 학습하세요 C. elegans의 생체내 레이저 축절단 기법으로 GABA 운동신경원 재생을 연구하는 방법을. MicroPoint 레이저 시스템을 활용하여 정밀한 신경 절단과 재생 측정이 가능합니다.

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Hammarlund 실험실 작업에 의해 후원됩니다 NIH R01 부여 NS066082 - 01과 T32GM007223, 베크맨 재단, 그리고 엘리슨 의료 재단.

1. 시스템을 조립 시스템의 특정 구성 요소는 다음과 같습니다. 제대로 조립하면, 사용자가 한 손으로 현미경을 집중할 수 있어야합니다, (중 마우 스나 조이스틱과 함께) 다른과 함께 무대를 이동 발 페달로 레이저를 활성화하고, 온 -을 확연히 볼 수있다 화면 이미지. <ol><li> MicroPoint 레이저 복합 현미경의 에피 형광 포트를 탑재. 우리는 니콘 80i를 사용하지만, 모든 연구 수준의 직립하거나 거꾸로 범위는 작동합니다. MicroPoint 시스템은 절단하고자하는 세포 라벨 형광단과 일치해야합니다 사용자 정의 이색성를 포함합니다. 대안 fluorophores와 라벨 커팅 세포가 추가 dichroics이 필요합니다. 또한, 펄스 발생기 및 발 페달은 MicroPoint 시스템을 함께. </li><li> 100x, 1.4 NA 오일 수술을 수행하고 중생을 평가하기위한 목적뿐 아니라 슬라이드에 샘플을 위치에 필요한 추가적인 목표. 우리는 수술 니콘 계획 APO VC를 사용하여 4X가 거친 초점 샘플을 찾는 데 유용합니다 것을 발견했습니다. </li><li> 조이스틱과 함께 무대를 동력. 무대에만 타겟팅에 사용되기 때문에 매우 높은 정확성과 repeatability있는 무대가 필요합니다. 우리는 전에 OptiScan II를 (토론 참조)을 사용합니다. </li><li> 카메라. 카메라는 컴퓨터 모니터에 이미지를 떠올리면서, 초점과 100x 목적으로 표시된 neurite를 대상으로 충분한 프레임 속도를 제공해야합니다. 우리는 (아래 1.7 참조​​) 사진 표백 또는 손상의 가능성이 혼란함을 주죠 효과를 피하기 위해 axotomy 절차 동안 조명 광을 attenuating 선호합니다. 따라서, 카메라는이 빛을 감소 수준을 수용할 정도로 민감한해야합니다. 우리는 하마 마츠 오카 05G를 사용하고 16.3 Hz에서에서 이미지가 충분합니다 찾습니다. 상응하는 카메라가 대체 수 있습니다. </li><li> 카메라를 운전할 수 컴퓨터, 모니터, 및 이미징 소프트웨어. 또한, 우리는 (토론 참조) 마우스 전동 무대를 조작하는 이미징 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 에어 테이블. 이 요구 사항은 지역에 따라 달라질 수 있지만 수술이 100x 목적으로 수행되기 때문에, 우리는 진동 절연은 필수적으로 찾습니다. </li><li> 조명 가이드 및 형광단을 계몽을위한 셔터 메커니즘과 라이트 공급. 조명 가이드 MicroPoint에 연결합니다. 셔터 메커니즘은 독립적으로 레이저의 조명 강도를 줄이는 데 유용합니다. 우리는 이전 루멘 200 Leica EL6000를 사용하여 axotomy에 대한 전체 빛의 강도의 80 %까지 감쇠. </li></ol> 2. 레이저 설정 초기 정렬 및 레이저를 초점 자세한 프로토콜은 MicroPoint 레이저 시스템으로 제공됩니다. 우리는 그 절차가 초기 설정에 따라 성공적으로 뒤를되었습니다 가정합니다. 이것은 접안 렌즈의 주목을 가진 레이저를 정렬이 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 레이저의 초점과 강도의 정기적인 유지 보수를위한 프로토콜을 제공합니다. 로 MicroPoint 설명서에 명시된 바와 같이, 펄스 질소 레이저는 심각하게 인간의 눈을 손상시킬 수 있습니다. 치료는 레이저 빔을 직접 쳐다보지도 않을로 이동해야합니다. 일단 설치 장벽 필터 안전하게 eyepieces를 통해 방사선을 차단해야합니다. 유기체의 신경을 절단의 모래알의 크기는 도전하실 수 있습니다. 레이저에 의해 수행 피해 면적이 아주 작은이기 때문에 그것은 정확하게 샘플을 대상으로 위해 레이저의 초점의 3 차원 위치를 알고하는 것이 필수적입니다. 레이저 초점은 미러 슬라이드를 사용하여 발견된다. 첫째, 우리는 레이저 초점의 Z 위치는 이미지 경로의 초점과 일치하는지 확인하십시오. 다음 피해 초점의 XY 위치는 이미징 소프트웨어의 주목과 함께 표시됩니다. Z - 비행기에 초점 <ol><li> 중립 밀도 필터 ND16 (그림 1A)에서 누르십시오. 우리는 집중하는 동안 레이저를 자제하는 에피 조명 경로에 중립 밀도 필터를 사용합니다. 에도 미세한 초점을 맞추고, ND16 및 ND4 형광 필터 모두에 밀어. </li><li> 스위치 1 펄스에 MicroPoint 레이저를 세트 '선택'(그림 1B), 그리고 적절한 긴 도로 장벽 필터 (그림 1C)에 필터 휠을 이동으로 변하고있는 상황입니다. </li><li> 무대에서 미러 슬라이드를 삽입하고 전달 빛을 사용하여 4X 목적으로 그 안에서 pinholes에 중점을두고 있습니다. </li><li> 미러 슬라이드 침지 기름 한 방울을 추가하고 100X 목적으로 pinholes에 집중할. 레버 (그림 1D)와 레이저 셔터 (그림 1E)을 전환 광학 경로로 카메라 셔터를 엽니다. 필요한 경우 pinholes의 가장자리가 선명하므로, 전송 빛의 강도를 감소 : 이것은 정확하게 초점에 도움이됩니다. </li><li> 발 페달을 누르십시오. 레이저가 제대로 초점을 맞추고있다면 이것은 거울에 작은 구멍을 생산해야합니다. </li><li> 약간 미러 슬라이드의 비행기 위에 현미경을 집중하고 다시 레이저를 쏴. 이것은 심지어 작은해야첫 번째 총알보다 구멍, 또는 전혀 흔적을 남겨 두지 않습니다. 미러 슬라이드 아래에 초점을 맞춤으로써 반복합니다. </li><li> 구멍이 2.5에서 생산되지 않은 경우, 또는 거울의 표면 위 또는 아래 초점을 때 큰 구멍이 생산하는 경우, 절제 머리에 초점 링과 함께 레이저를 집중할. 구멍이 여전히 제대로 접안 렌즈의 주목에 부합되는지 확인합니다. 일관성 사용, Z - 비행기의 초점은 거의 조정할 필요가 없다. </li></ol> XY 평면의 중심 <ol start="8"><li> 위의 2.3을 통해 2.1 단계를 수행하여 미러 슬라이드에 작은 구멍을 만들기 위해 발 페달을 누르십시오. </li><li> 시작 메뉴 요소 '수집'에서 모드를 캡처 '를 라이브. '측정'툴바 선택 '투자 수익 (ROI) 편집기'에서 다음 '더블 십자가'도구를 선택하고 새로운 구멍의 중앙에 그들을 정렬하기 위해 주목을 끕니다. 그리고 '종료 편집기'은 투자 수익 (ROI) 저장 '을하고 라이브 캡처 모드를 다시 클릭합니다. </li><li> 마우스로 무대를 조작 요소의 '마우스 XY'설정을 활성화합니다. </li><li> , 다시 원래 위치 (S)에 대한 중립적인 밀도 필터를 당겨 10 레이저 펄스를 설정하고, 미러 슬라이드를 제거합니다. </li></ol> 레이저의 전원을 조정 <ol start="12"><li> 레이저의 능력은 선택의 신경 세포를 잘라하는 데 필요한 최소 전력으로 조정해야합니다. 생활 웜 (아래 설명) 깎다 감쇠기 판 (그림 1 층)을 이동하여 전력을 조정합니다. 레이저 전원이 너무 높으면, 그것은 주변 손상 시키거나 벌레 구멍을 폭발합니다. 레이저 전원이 너무 낮으면, 그것은 신경을 도려하지 않습니다. 시스템이 설치되면, 감쇠기 위치는 거의 변경할 필요가 없다. 레이저 약한되고, 감쇠기 플레이트가 절단 계속 이동해야하는 경우, 그것은 염색 세포에 염색이 (토론 참조) 교체해야한다는 서명 수 있습니다. </li></ol> 3. 벌레를 고정 <ol><li> 3퍼센트 M9의 용융 아가로 오스 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 85mM NaCl, 1mM MgSO4)의 솔루션을 준비합니다. 15 ML 팔콘 튜브로 용융 아가로 오스의 5 ML 하는걸. 다른 튜브 물을 채우십시오. 모듈형 가열 요소에 장소 튜브 55 ° C. 설정 각 튜브 미니 물 목욕을 만들 물로 가열 요소를 채웁니다. 참고 : 아가로 오스는 미리 대량으로 준비하고 후속 실험에 다시 녹아 수 있습니다. </li><li> 이 슬라이드의 각 이러한 슬라이드 사이에 깨끗한 슬라이드에 라벨 테이프 두 레이어를 놓습니다. 깨끗한 슬라이드 및 그 결과 아가로 오스 패드 테이프 두 조각 (그림 2)의 두께가되도록 첫 번째 장소 다른 슬라이드 직각을 중간에 플라스틱 전구의 피펫을 사용하여 아가로 오스의 드롭을 분배. 30초 후 패드에서 두 슬라이드 중 하나를 제거합니다. 린스 이후 슬라이드와 함께 사용하기 위해 물 채워진 팔콘 튜브의 플라스틱 피펫을 저장합니다. </li><li> 다음 장소 패드의 중앙에 0.10 μm의 또는 0.05 μm의의 폴리스티렌 구슬 3-5 μL. 관심의 뉴런에 형광 단백질을 표현 50-10 벌레를 추가합니다. 관심의 뉴런이 불균형 웜의 오른쪽이나 왼쪽에 배포하는 경우, 올바른 측면가 직면되도록 벌레를 돌려 플래티넘 선택을 사용합니다. 웜는 아가로 오스 패드 준비 10 분 이내에 슬라이드에 삽입되어야합니다. </li><li> 조심스럽게 벌레에 커버 전표를 놓습니다. 커버 슬립을 배치하면, 이것은 표피를 방해하고 벌레를 파괴하므로 아가로 오스 패드로 상대 이동하지 않습니다. 현미경 단계에 준비된 슬라이드를 놓습니다. </li></ol> 4. 컷 뉴런 <ol><li> 광학 경로 스위칭 레버와 eyepieces에 직접 빛을. 4X 목적으로 절단하는 벌레에 초점, 커버 슬립에 기름 한 방울을 배치하고, 100X 목표로 전환합니다. 카메라 광학 경로를 반환합니다. </li><li> 십자형 커서의 중앙 아래에 선택의 신경 세포를 이동하려면 마우스를 사용합니다. 레이저를 발사하기 위해 발 페달을 눌러 프로세스의 연결을 끊을 수. 필요한 경우, 펄스의 두 세트는 신경을 도려 사용할 수 있습니다. 처음에는 그것은 뉴런이 이후의 재생을 평가하기 위해 각각의 벌레에 심했을텐데 보유하고있는 정확하게 추적하기 위해 도움이됩니다. 제대로 수행되면, 레이저 axotomy은 주변 피부 조직이나 다른 뉴런 (그림 3 참조)에 상당한 손상을 초래하지 않고 신경 세포의 작은 휴식을 생산하고 있습니다. 어떤 경우에는 작은 상처는 부상의 사이트의 주위에 양식 있습니다. </li><li> 벌레는 아가로 오스 패드에 남아있을 것을주의하고, 직접 상향 움직임에 커버 슬립을 제거하여 벌레를 복구합니다. coverslip를 밀어하지 마십시오. 그런 다음, 바늘 코를 집게로 웜 주변의 패드를 잘라 OP50 8 포함된 갓 씨앗 NGM의 접시에 아가로 오스의 섹션을 놓으십시오. 구슬에서 벌레를 무료로 아가로 오스를 제거하는 패드에 멸균 M9 10 μL를 놓습니다. </li></ol> 5. 재생에 대한 점수 뉴런 <ol><li> 단계 2.2에 명시된 바와 같이 아가로 오스 패드를 준비합니다. </li><li> 3-5 &amp;에 플레이스 웜뮤, 폴리스티렌 구슬 L. coverslip을 적용합니다. 슬라이드는 순차적으로 준비하거나, 또는 모든 벌레는 사전과 10cm 문화 요리, 아가로 오스의 촉촉한을 유지하기 위해 습기가 Kimwipe를 포함하는 각에 보관 슬라이드에 준비하실 수 있습니다. </li><li> 잘린 신경을 시각화하기 위해 100X 목적을 사용합니다. 많은 뉴런에서 절단 사이트에 말초의 연결 그루터기가 유지됩니다. 우리는 신경 세포가 실제로 (그림 4) 절단이라고 ​​표시로 잔여의 존재를 사용합니다. 이 유세의 존재는 그것이 가능 잘라 아니었 하나 잘라 생성되었습니다 신경 세포를 구별할 수 있습니다. 참고 : 모두 말초 및 근위 스텀스 처음 절단 후에 철회. </li><li> 중생을 평가합니다. 매개 변수의 다양한 결정하실 수 있습니다. 하나의 간단한 분석은 부상당한 신경 세포가 성장 원뿔 (그림 4A)을 형성하고 (그림 4B)하지 생성, 또는이 있는지 여부입니다. 또는, neurite의 길이는 추적하고 비교할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 예를 들어, 우리는 γ - Aminobutyric의 산성 (GABA) 모터 뉴런의 중생의 특성을 설명합니다. 복부 신경 코드에 거주하고있는 특정 신경 코드에 circumferentially 프로세스를 확장하는 이들 뉴런은, 적절한 운동 9 필수적입니다. GABA의 신경은 UNC -47 또는 UNC의 통제 -25 발기인 (C. 엘레간스 유전 센터에서 사용할 종자 각각 EG1285 및 CZ1200, 아래와 같은 녹색 형광 단백질 (GFP) 같은 유전자 인코딩 형광단을 표현하여 시각 수 있습니다 ). 마운트 L4 단계의 웜은으로 설명, 자신의 오른쪽 측면에있는 GABA 뉴런가 직면하므로 벌레를 플립하고, 표지 용지를 넣으십시오. 지느러미와 복부 코드 사이의 각 웜, 미드웨이에서 사후 commissures의 1-3 컷. 다음과 같이 다른 commissures와 교차 또는 fasciculate 나중에 점수 어렵다는 것을 commissures을 절단하지 마십시오. 설명한대로 벌레를 복구할 수 있습니다. 18~24시간 성공 axotomy 후, 웜는 수술에서 회복하고 정상적인 locomotory 달걀 누워있는 행동을 전시됩니다. 죽거나 아픈가요 벌레를 폐기하십시오. 설명된대로 나머지를 리마운트하고, 중생을 평가합니다. 우리는 일반적으로 실험 조건마다 적어도 30 컷 뉴런을 평가하는 것을 목표로하고 있습니다. oxIs12 동물, 절단 L4 GABA 뉴런의 일반적 60-70%은 끝에 여러 neurite 지점의 확장에 막의 확대, 그리고 컷 사이트 (그림 4A)에서 마이 그 레이션에 의해 입증 성장 원뿔 구조를 시작합니다. 대부분의 경우에는 성장 콘은 지느러미 신경 코드, 인근의 연결을 접합면 또는 말초 그루터기와 재연결으로 마이 그 레이션해야합니다. 뉴런의 나머지 30 % 중 axotomy의 사이트에 근위 그루터기을 형성, 아무 성장을 시작하지 않았기에, 아니면 작은 filopodia (그림 4B)을 확장합니다. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. UV 레이저 axotomy 시스템을 펄스. 특정 구성 요소는 다음과 같습니다 (A) ND 필터는 (B) 펄스 선택 (C) 필터 휠 레버 (D) 레버 (E) 레이저 셔터 및 (F) 감쇠기 플레이트 전환 광학 경로입니다. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 아가로 오스 패드를 준비. 원하는 두께의 아가로 오스 패드를 준비하려면, 테이프의 두 계층은 (녹색) 2 슬라이드에 표시됩니다. 슬라이드는 첫 번째와 두 번째 사이에 위치하고, 아가로 오스의 드롭은 다음 깨끗한 슬라이드에 추가됩니다. 마지막으로 네 번째 슬라이드 테이프 두 조각의 두께는 패드의 결과, 처음 세에 수직으로 배치됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 대표 GABA 신경 세포의 axotomies. 전형적인 실험에서는 GABA 신경 세포의 commissures는 웜 측면의 중간에서 절단됩니다. 절단 접합면 바로 전 (왼쪽 패널) 및 (오른쪽 패널) axotomy 후 표시됩니다. 모든 이미지는 100X 오일 목적으로 찍은. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. GABA 신경 세포의 axotomies 대표 발생합니다. 24 시간 이후 axotomy 절단 axons은 중생에 대한 점수입니다. 성장 원뿔 (화살표)와 재생의 축삭은 (A)가 아닌 재생 축삭은 (B)에서 근위 그루터기 (화살표)로 볼 수있는 동안에 표시됩니다. 각 컷 축삭의 말초 그루터기는 각 패널 (화살촉)에 표시하고 축삭이 절단되었다는 표시입니다.

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<li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> Journal of Experimental Zoology. 231, 45-56 (1984).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

레이저 시스템의 다양한 C.에 neurites를 잘라하는 데 사용되었습니다 엘레간스, 여러 연구 세부 3,7,10,11에서 성능을 검사했습니다. 우리의 프로토콜에 사용되는 MicroPoint 레이저는 설치 및 유지 관리가 용이​​하고, 티 - 사파이어 레이저 시스템에 비해 연구자에게 저렴한 비용으로 사용할 수있는 턴키 시스템입니다. 티 - 사파이어 시스템에 비해 그러나, MicroPoint 레이저는 일부 응용 프로그램에 대한 불리한 수있는 더 큰 영역에 손상을 일으킬 것으로 예상된다. 티 - 사파이어 시스템을 원하는 경우, 이러한 시스템 구축에 우수한 프로토콜은 12 사용할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 C로 뉴런의 다양한 수행할 수 엘레간스는 있지만, 우리는 뉴런의 독특한 유형 간의 재생 능력의 차이가 13 예상됩니다. 또한, 다른 유전자 변형 배경 재생 성공에 영향을 줄 수 있습니다. 재생 GABA 뉴런의 비율이 다른 유전자 변형 종자 마커 사이의 매우 일관하지만, 우리는 oxIs12 15 웜 대 juIs76 14 재생에 전반적인 약간의 증가를 언급했습니다. 터치 뉴런의 마커 사이의 차이도 2 설명하고 있습니다. 비즈보다 빠르고 일관성있는 고정 16 결과로 우리는 오히려 anesthetics보다 microbeads로 벌레를 무력화하는 것을 선호합니다. 우리가 재생 마취 17 때문에 가능한 모든 혼란함을 주죠 효과를 무료로 관찰 할 수 있으므로 이것은 또한 유리한 것입니다. 고정을위한 대안 마취없는 방법 microfluidic 장치의 사용이다. axotomy위한 microfluidics의 사용은 광범위 17-22을 설명하고 있습니다. 우리는 각 주 MicroPoint 설명서에서 설명한 절차에 따라 한 일관성을 사용하여, Coumarin는 염료 셀에 440 최고의 레이저 기능이 변경됩니다 것을 발견했습니다. 필요한 경우, 감쇠 슬라이더는 전력을 증가하는 데 사용할 수 있지만, 이것은 오래된 염료 또는 레이저 misalignment의 표시 수 있습니다. 또한, 염료 전지는 제한된 수명을 가지고 있으며, 결국 (문제 해결 참조) 재건하거나 교체해야합니다. 그것은 동물이 불완전 마비 특히 경우, 레이저 초점을 표시 주목을 아래 대상 neurite를 기동하기 어려울 수 있습니다. 우리는 확실히 사용할 수 있지만 수동 무대,이 목적을 위해 최적되지 않습니다 것을 발견했습니다. 조이스틱 제어 전동 단계 더 정확하고, 우리는 전동 무대를 이동하려면 마우스로 드래그 이미지를 지원하는 소프트웨어를 사용하는 것이 가장 좋습니다 것을 발견했습니다. 니콘 요소는이 기능을 제공하며이 프로토콜의 설명이지만, 무료 마이크로 패키지뿐만 아니라 다른 이미징 소프트웨어는 비슷한 기능을 가지고 있습니다. 고급 타겟팅 다른 방법으로 오히려 동물보다 레이저 초점을 이동하는 것입니다. 검류계 빔 - 스티어링 메커니즘으로 사용할 수 있습니다 MicroPoint 레이저에 애드온 (add - on), 이러한 방식이 선호하는 경우. 의 연결을 중생의 연구에의 응용 게다가, 레이저는 다른 세포 유형 같은 피부, 근육, 또는 전문 세포로 ablate하거나 특정의 연결 시냅스에게 23-27를 중단하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 부상 또는 질병 함께 뉴런의 변성을 조절 경로는이 시스템 조사 수 있습니다. 이와 같이, 펄스 레이저의 사용은 중생의 연결 및 기타 관련 프로세스를 촉진 유전 요인과 세포 생물 학적 변화 모두에 대해 설명해 주실 것입니다. 문제 해결 : 몇 가지 일반적인 문제와 관련된 솔루션은 여기에 설명되어 있습니다. <ol type="a"><li> 레이저 커팅 제대로되지 않습니다. 중 레이저 (섹션 2 참조) 초점 밖으로 있기 때문에이 가능성이 높습니다, 또는 염료를 세포에 염료 (MicroPoint 설명서를 참조) 교체해야합니다. 또는, 염료 전지를 교체하거나 재건해야 할 수 있습니다. </li><li> 벌레는 아가로 오스 패드에 이동됩니다. 이것은 일반적으로 아가로 오스 패드가 너무 습한 것을 서명합니다. 우리는 패드는 벌레가이 문제를 회피하기 위해 그들에 배치되기 전에 약 30 초 동안 남아있을 필요가 찾으십시오. 당신은 또한 작은 크기의 (0.05 μm의) microbeads를 사용하여 시도할 수 있습니다. </li><li> 벌레의 복구는 어렵고 비효율적이다. 이것은 잘못된 coverslip 제거하거나 건조한 아가로 오스 패드로 인해 발생할 수 있습니다. 패드가 너무 건조하면 axons가 페르시 모양을 개발하는 것을 확인할 수 있습니다. 벌레가 곧 그것이 만들어진 후 패드에 배치되지 않았기 때문에 어떤 경우에는이됩니다. 또는 아가로 오스 솔루션의 오래된 재고가 반복 용해 후보다 높을 3 % 농도가있을 수 있습니다. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 0.05 μm의 폴리스티렌 비즈 </td><td> Polysciences 주식 회사 </td><td> 08,691 </td><td></td></tr><tr><td> 0.10 μm의 폴리스티렌 비즈 </td><td> Polysciences 주식 회사 </td><td> 00,876 </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 GPG / LE </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> 00,972 </td><td> 울트라 순수 </td></tr><tr><td> 팰컨 14 ML의 폴리스티렌은 라운드 - 하단 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> 17 X 100mm 스타일, nonpyrogenic </td></tr><tr><td> 써모 과학 일반 precleaned 현미경 슬라이드 </td><td> 에리 과학 회사 </td><td> 420 - 004T </td><td> 3 &quot;X 1&quot;X 1mm </td></tr><tr><td> 커버 버렸는데 </td><td> VWR </td><td> 48,366 205 </td><td> 18mm X 18mm 번호 1 1 / 2 </td></tr><tr><td> KIMTECH 과학 Kimwipes </td><td> 킴벌리 - 클라크 </td><td> 34,155 </td><td></td></tr><tr><td> BD 팰컨 100 X 15mm 스타일 페트리 접시 </td><td> BD Biosciences </td><td> 351029 </td><td></td></tr><tr><td> 테이프 빈 3/4w X 500L </td><td> TimeMed </td><td> T - 512 </td><td></td></tr><tr><td> 집중 오일 </td><td> 니콘 </td><td></td><td> , ND는 = 1.515를 입력하십시오 </td></tr><tr><td> EG1285 또는 CZ1200 </td><td> C. 엘레간스 유전 센터 </td><td> http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ </td><td></td></tr><tr><td> OptiScan II </td><td> 사전 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS - 요소 아르 또는 브랜치 도서관 </td><td> 니콘 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MicroPoint 박리 레이저 시스템 </td><td> 과학 광자 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 복합 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> 이클립스 80i </td><td></td></tr><tr><td> 하마 마츠 카메라 </td><td> 하마 마츠 Photonics </td><td> 모델 C8484 - 05G01 </td><td></td></tr><tr><td> 인텔 코어 2 듀오와 델 정밀 T3400 PC </td><td> 작은 골짜기 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 윈도우 XP 프로 페셔널 </td><td></td><td> 마이크로 소프트 </td><td> 버전 2002 시리즈 팩 3 </td></tr><tr><td> 듀얼 건식 목욕 보육 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td></td><td> 아날로그 제어 </td></tr><tr><td> 4X 계획 플루어 목적 </td><td> 니콘 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100X 계획 APO VC 오일 목적 </td><td> 니콘 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 더몬트 # 45분의 5 포셉 </td><td> 더몬트 </td><td> 11251-35 </td><td> Dumoxel 표준 조언도 # 7을 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> SMZ800 </td><td> NI - 150 고강도 조명기과 함께 </td></tr></tbody></table>

c로 생체내 레이저 axotomy에서 엘레간스

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

뉴런은 axons과 dendrites, 사전 또는 사후 신경 전문을 포함 슬림 멤브레인 확장을 통해 다른 세포와 통신합니다. 신경 세포가 부상 또는 질병에 의해 손상된 경우, 재생 수 있습니다. 셀 - 내장 및 외부 요인이 기능을 재생 및 복원하는 신경 세포의 능력에 영향을 미칩니다. 최근 선충류 C. 엘레간스은 유전자를 식별하는 훌륭한 모델 생물로서 등장과 뉴런 1-6의 재생에 영향을 미치는 경로를 신호했다. C로의 연결을 재생을 시작하는 주요 방법 엘레간스는 레이저 커팅 중재, 또는 axotomy입니다. axotomy 동안 찬란 - 라벨의 연결 과정은 높은 에너지 펄스를 사용하여 절단합니다. C로 처음의 연결 재생 엘레간스는 증폭 femtosecond 레이저 5를 사용하고 검사했다. 그러나, 이후의 재생 연구는 종래의 펄스 레이저가 정확하게 생체내에 신경을 도려하고 유사한 응답 재생 1,3,7을 이끌어하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 MicroPoint 펄스 레이저, 즉시 사용할 수 있고 그것이 널리 타겟 세포 절제에 사용되고 있습니다 턴키 시스템을 사용하여 웜에서 생체내 레이저 axotomy에서 수행하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 레이저를 정렬 벌레를 장착, 특정 신경을 절단하고, 후속 중생을 평가 설명합니다. 시스템은 한 실험 기간 동안 여러 벌레의 뉴런의 큰 숫자를 줄일 수있는 기능을 제공합니다. 따라서, 본 설명과 같은 레이저 axotomy은 중생의 과정을 시작하고 분석을위한 효율적인 시스템입니다.

에 신경을 절단하는 프로토콜<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; MicroPoint 펄스 레이저가 함께 제공됩니다. 우리는 벌레를 immobilizing, 시스템을 설정하고, 레이블 뉴런을 severing 설명합니다. 장점은 상대적으로 낮은 비용으로 시스템 및 프로세스의 연결 또는 ablate 세포를 도려 수있는 능력을 포함<em&gt; 생체내에</em&gt;.

C로 생체내 레이저 Axotomy에서 엘레간스

뉴런은 시냅스 전 또는 시냅스 후 특수 구조를 포함하는 가느다란 막 연장선인 축삭과 수지상돌기를 통해 다른 세포와 통신합니다. 만약 뉴런이...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 생체 내(in vivo)에서 레이저를 사용하여 CL 뉴런을 정밀하게 절단하는 것입니다. 이는 축삭 절단 시스템을 조립하고, 레이저의 초점을 정밀하게 맞추고 정렬하며 출력을 조정함으로써 달성됩니다. 벌레를 현미경 슬라이드 위에 고정시키면, 정밀한 공간적 및 시간적 제어를 통해 뉴런을 절단할 수 있습니다.절단된 뉴런의 재생 정도는 성장 원추(growth cone)의 점수를 매기거나 뉴라이트(neurite)의 길이를 추적하여 측정합니다. 펨토초 레이저와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 마이크로 포인트 펄스 레이저가 설치와 유지 관리가 쉽고 경제적인 시스템이며, 다양한 응용 분야에 쉽게 적용 가능하다는 점입니다. 본 연구에서는 일반적으로 이 방법을 GABA 운동 뉴런의 재생 연구에 적용하지만, 이 시스템은 피부 근육이나 특정 뉴런 시냅스와 같은 다른 세포 유형을 절제하는 데에도 사용할 수 있습니다.이 방법에는 마이크로 포인트 레이저 시스템이 필요합니다. 레이저는 복합 현미경의 에피 형광 포트에 장착되며, 절단할 세포 내 형광체와 일치하는 단일 다이크로익 미러, 펄스 발생기 및 레이저 작동을 위한 풋 페달을 포함합니다. 최소한 현미경에는 100배 1.4 NA 오일 렌즈와 4배 렌즈가 갖춰져 있어야 합니다.조이스틱으로 작동하는 전동 스테이지를 준비하고, 조명을 위해 에어 테이블에 장착하십시오. 라이트 가이드와 셔터 메커니즘이 포함된 광원이 마이크로 포인트 레이저에 연결되어 있습니다. 셔터 메커니즘은 레이저와는 별개로 조명 강도를 낮추는 데 유용합니다.컴퓨터에 연결된 카메라는 최소 16 Hz의 프레임 속도가 필요하며, 저조도 환경에서도 원활하게 작동해야 합니다. 컴퓨터에는 뉴런을 관찰하고, 카메라를 제어하며, 전동 스테이지를 조작하기 위한 Nikon elements와 같은 이미징 소프트웨어가 필요합니다. 조립이 완료되면, 사용자는 한 손으로 현미경의 초점을 맞추고 다른 손으로 스테이지를 이동시키며, 풋 페달로 레이저를 활성화하는 동시에 화면의 이미지를 명확하게 확인할 수 있습니다.모래알 크기의 유기체 내에서 뉴런을 절단하는 것은 매우 까다로울 수 있습니다. 이를 수행하려면 레이저가 3차원 모든 방향으로 정밀하게 초점이 맞춰져야 합니다. 먼저 Z 평면의 초점을 맞추십시오.더 정밀한 초점 조정을 위해 ND 16 중성 밀도 필터를 밀어 넣어 레이저를 감쇠시키고, ND 16과 ND 4 형광 필터를 모두 밀어 넣습니다. 다음으로, 스위치를 'select'로 돌려 마이크로 포인트 레이저를 단일 펄스로 설정한 후, 필터 휠을 적절한 롱패스 배리어 필터로 이동시킵니다. 이제 스테이지 위에 거울 슬라이드를 놓고, 4배 대물렌즈와 투과광을 사용하여 슬라이드 내의 핀홀에 초점을 맞춥니다.초점이 잡히면 슬라이드에 이머전 오일을 한 방울 떨어뜨리고 100배 대물렌즈로 핀홀의 초점을 다시 맞춥니다. 그런 다음 광 경로 전환 레버를 사용하여 카메라 셔터를 열고 레이저 셔터를 엽니다. 정확한 초점을 맞추기 어렵다면, 투과광 강도를 낮추어 핀홀의 가장자리가 선명하게 보이도록 합니다.초점을 테스트하려면 풋 페달을 사용하여 레이저를 조사하십시오. Z 평면의 초점이 제대로 맞았다면 거울에 작은 구멍이 나타나야 합니다. 이제 현미경의 초점을 거울 슬라이드 평면보다 약간 위에 맞추고 레이저를 다시 조사하십시오.이렇게 하면 첫 번째 샷보다 더 작은 구멍이 생기거나 아예 자국이 남지 않아야 합니다. 미러 슬라이드 아래쪽에 초점을 맞췄을 때도 동일한 결과가 나타나야 합니다. 하지만 더 큰 구멍이 생긴다면, 어블레이션 헤드의 초점 링을 사용하여 레이저의 초점을 다시 맞추십시오.마지막으로, 구멍이 접안렌즈의 십자선과 여전히 제대로 일치하는지 확인하십시오. 지속적으로 사용할 경우 Z평면 초점은 조정할 필요가 거의 없습니다. XY평면에서 레이저 초점을 맞추려면 거울에 다른 구멍을 뚫은 다음 Nikon elements 소프트웨어에 접속하십시오.획득 메뉴에서 라이브 캡처 모드를 시작합니다. 측정 도구 모음에서 ROI 에디터를 선택하고, 이중 십자 도구를 선택한 다음 십자선을 드래그하여 새 구멍의 중심에 맞춥니다. ROI 저장을 클릭한 후 에디터를 종료하여 라이브 캡처로 돌아갑니다.마우스로 스테이지를 조작하려면 마우스 XY 설정을 활성화하십시오. 이제 레이저가 초점을 맞췄습니다. 중성 밀도 필터를 원래 위치로 재설정하고, 향후 사용을 위해 레이저 펄스를 1에서 10으로 설정하십시오.먼저, M9 용액에 3% molten agarose 용액을 준비하고 약 5 mL를 50 mL 튜브에 분주합니다. 해당 튜브를 55~65 °C 항온수조에 넣고, 남은 용액은 나중에 사용할 수 있도록 보관하십시오. 이제 라벨이 부착된 슬라이드 2개를 준비합니다.깨끗한 슬라이드 글라스 한 쌍을 테이프로 고정하고 아가로스 한 방울을 떨어뜨려 벌레를 올릴 수 있는 패드를 만듭니다. 30초 후 아가로스가 응고되면, 0.05에서 0.1 µm 폴리스티렌 비즈 3~5 µL를 패드 위에 피펫으로 분주합니다. 10분 이내에 백금 픽을 사용하여 형질전환 벌레 5~10마리를 비즈 위에 빠르게 배치하여, 표지된 뉴런이 쉽게 관찰되도록 합니다. 벌레가 손상되지 않도록 표준 커버 슬립을 벌레 위에 조심스럽게 덮습니다.슬라이드를 움직여 조절합니다. 이제 벌레 슬라이드는 분류학적 분석을 수행할 준비가 되었습니다. 접안렌즈를 사용하여 4배율에서 벌레의 위치를 찾은 후 100배 대물렌즈로 초점을 다시 맞추고, 투과광을 끈 다음 형광광을 켜고 광학 경로를 카메라로 전환합니다.마우스를 사용하여 십자선 중앙에 뉴런을 맞춥니다. 이제 풋 페달을 이용해 레이저를 발사합니다. 적절한 레이저 출력이라면 한두 번의 펄스만으로 뉴런을 절단할 수 있습니다.레이저 출력이 너무 강하면 주변 조직이 손상되거나 벌레에 구멍이 뚫릴 수 있으므로, 레이저 출력을 조절하려면 감쇠판을 이동시키십시오. 레이저 출력이 약해지면 감쇠판의 위치를 조정하여 절단을 계속할 수 있습니다. 하지만 이는 레이저의 D 셀에 있는 Kumar in four 40를 교체해야 한다는 신호일 가능성이 높으며, 올바르게 수행되어야 합니다.레이저 절단술은 뉴런에 작은 절단부를 생성합니다. 특정 사례에서는 손상 부위 주변에 작은 흉터가 형성될 수 있습니다. 실제로는 동물당 1개에서 3개의 뉴런을 절단하지만, 이론적인 제한은 없습니다.완료되면 커버 슬립을 수직 방향으로 들어 올려 벌레를 회수하되, 벌레가 아가로스 패드 위에 그대로 남아 있도록 주의하십시오. 커버 슬립을 밀어서 제거하지 마십시오. 니들 노즈 포셉(needle nose forceps)을 사용하여 벌레 주변의 패드를 잘라내십시오.OP 50가 포함된 갓 배양한 NGM 플레이트 위에 패드를 놓고 10 µL의 멸균 M9 용액으로 벌레를 풀어줍니다. 절단 후 8~48시간 사이에 재생 여부를 평가할 수 있습니다. 이를 위해 건강한 벌레를 3~5 µL의 폴리스티렌 비드 위에 다시 고정하고 신경세포와 절단된 신경세포를 시각화합니다. 절단 부위보다 원위부에 있는 신경세포 그루터기가 남아 있을 것입니다. 절단 후 초기에는 원위부와 근위부 그루터기가 모두 수축하지만, 근위부 그루터기로부터 재생이 일어날 것으로 기대됩니다.성장 원추(growth cone)의 형성 여부로 재생 정도를 측정할 수 있습니다. 또는 신경 돌기(neurite)의 길이를 추적하여 비교할 수도 있으며, 일반적으로 GABA 뉴런의 60~70%가 절단 후 24시간 이내에 성장 원추를 형성합니다. 레이저가 제대로 절단하지 못하는 경우에는 레이저의 초점이 맞지 않았거나 염료 셀의 염료를 교체해야 할 가능성이 높습니다.또한, 벌레들이 움직이는 것이 관찰된다면 이는 아마도 agros 패드가 너무 습하기 때문일 것입니다. 이러한 문제를 방지하기 위해, 벌레를 패드 위에 올리기 전 약 30초 동안 패드를 그대로 두는 것이 좋다는 것을 확인했습니다. 아울러, 벌레를 고정시키기 위해 더 작은 크기의 마이크로비즈(microbeads)를 사용하는 방법을 시도해 볼 수 있습니다.마지막으로, 축삭이 구슬 모양으로 보인다면 이는 아마도 agar 패드가 너무 건조하기 때문일 것입니다. 이 영상을 시청하신 후에는 마이크로 포인트 레이저 시스템을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이제 충동을 고정하여 축삭 절단을 수행하고, 개별 뉴런을 절단한 뒤 이후의 재생 과정을 평가하시기 바랍니다.

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