C로 생체내 레이저 Axotomy에서 엘레간스

이 실험 절차의 전반적인 목표는 생체 내(in vivo)에서 레이저를 사용하여 CL 뉴런을 정밀하게 절단하는 것입니다. 이는 축삭 절단 시스템을 조립하고, 레이저의 초점을 정밀하게 맞추고 정렬하며 출력을 조정함으로써 달성됩니다. 벌레를 현미경 슬라이드 위에 고정시키면, 정밀한 공간적 및 시간적 제어를 통해 뉴런을 절단할 수 있습니다.

절단된 뉴런의 재생 정도는 성장 원추(growth cone)의 점수를 매기거나 뉴라이트(neurite)의 길이를 추적하여 측정합니다. 펨토초 레이저와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 마이크로 포인트 펄스 레이저가 설치와 유지 관리가 쉽고 경제적인 시스템이며, 다양한 응용 분야에 쉽게 적용 가능하다는 점입니다. 본 연구에서는 일반적으로 이 방법을 GABA 운동 뉴런의 재생 연구에 적용하지만, 이 시스템은 피부 근육이나 특정 뉴런 시냅스와 같은 다른 세포 유형을 절제하는 데에도 사용할 수 있습니다.

이 방법에는 마이크로 포인트 레이저 시스템이 필요합니다. 레이저는 복합 현미경의 에피 형광 포트에 장착되며, 절단할 세포 내 형광체와 일치하는 단일 다이크로익 미러, 펄스 발생기 및 레이저 작동을 위한 풋 페달을 포함합니다. 최소한 현미경에는 100배 1.4 NA 오일 렌즈와 4배 렌즈가 갖춰져 있어야 합니다.

조이스틱으로 작동하는 전동 스테이지를 준비하고, 조명을 위해 에어 테이블에 장착하십시오. 라이트 가이드와 셔터 메커니즘이 포함된 광원이 마이크로 포인트 레이저에 연결되어 있습니다. 셔터 메커니즘은 레이저와는 별개로 조명 강도를 낮추는 데 유용합니다.

컴퓨터에 연결된 카메라는 최소 16 Hz의 프레임 속도가 필요하며, 저조도 환경에서도 원활하게 작동해야 합니다. 컴퓨터에는 뉴런을 관찰하고, 카메라를 제어하며, 전동 스테이지를 조작하기 위한 Nikon elements와 같은 이미징 소프트웨어가 필요합니다. 조립이 완료되면, 사용자는 한 손으로 현미경의 초점을 맞추고 다른 손으로 스테이지를 이동시키며, 풋 페달로 레이저를 활성화하는 동시에 화면의 이미지를 명확하게 확인할 수 있습니다.

모래알 크기의 유기체 내에서 뉴런을 절단하는 것은 매우 까다로울 수 있습니다. 이를 수행하려면 레이저가 3차원 모든 방향으로 정밀하게 초점이 맞춰져야 합니다. 먼저 Z 평면의 초점을 맞추십시오.

더 정밀한 초점 조정을 위해 ND 16 중성 밀도 필터를 밀어 넣어 레이저를 감쇠시키고, ND 16과 ND 4 형광 필터를 모두 밀어 넣습니다. 다음으로, 스위치를 'select'로 돌려 마이크로 포인트 레이저를 단일 펄스로 설정한 후, 필터 휠을 적절한 롱패스 배리어 필터로 이동시킵니다. 이제 스테이지 위에 거울 슬라이드를 놓고, 4배 대물렌즈와 투과광을 사용하여 슬라이드 내의 핀홀에 초점을 맞춥니다.

초점이 잡히면 슬라이드에 이머전 오일을 한 방울 떨어뜨리고 100배 대물렌즈로 핀홀의 초점을 다시 맞춥니다. 그런 다음 광 경로 전환 레버를 사용하여 카메라 셔터를 열고 레이저 셔터를 엽니다. 정확한 초점을 맞추기 어렵다면, 투과광 강도를 낮추어 핀홀의 가장자리가 선명하게 보이도록 합니다.

초점을 테스트하려면 풋 페달을 사용하여 레이저를 조사하십시오. Z 평면의 초점이 제대로 맞았다면 거울에 작은 구멍이 나타나야 합니다. 이제 현미경의 초점을 거울 슬라이드 평면보다 약간 위에 맞추고 레이저를 다시 조사하십시오.

이렇게 하면 첫 번째 샷보다 더 작은 구멍이 생기거나 아예 자국이 남지 않아야 합니다. 미러 슬라이드 아래쪽에 초점을 맞췄을 때도 동일한 결과가 나타나야 합니다. 하지만 더 큰 구멍이 생긴다면, 어블레이션 헤드의 초점 링을 사용하여 레이저의 초점을 다시 맞추십시오.

마지막으로, 구멍이 접안렌즈의 십자선과 여전히 제대로 일치하는지 확인하십시오. 지속적으로 사용할 경우 Z평면 초점은 조정할 필요가 거의 없습니다. XY평면에서 레이저 초점을 맞추려면 거울에 다른 구멍을 뚫은 다음 Nikon elements 소프트웨어에 접속하십시오.

획득 메뉴에서 라이브 캡처 모드를 시작합니다. 측정 도구 모음에서 ROI 에디터를 선택하고, 이중 십자 도구를 선택한 다음 십자선을 드래그하여 새 구멍의 중심에 맞춥니다. ROI 저장을 클릭한 후 에디터를 종료하여 라이브 캡처로 돌아갑니다.

마우스로 스테이지를 조작하려면 마우스 XY 설정을 활성화하십시오. 이제 레이저가 초점을 맞췄습니다. 중성 밀도 필터를 원래 위치로 재설정하고, 향후 사용을 위해 레이저 펄스를 1에서 10으로 설정하십시오.

먼저, M9 용액에 3% molten agarose 용액을 준비하고 약 5 mL를 50 mL 튜브에 분주합니다. 해당 튜브를 55~65 °C 항온수조에 넣고, 남은 용액은 나중에 사용할 수 있도록 보관하십시오. 이제 라벨이 부착된 슬라이드 2개를 준비합니다.

깨끗한 슬라이드 글라스 한 쌍을 테이프로 고정하고 아가로스 한 방울을 떨어뜨려 벌레를 올릴 수 있는 패드를 만듭니다. 30초 후 아가로스가 응고되면, 0.05에서 0.1 µm 폴리스티렌 비즈 3~5 µL를 패드 위에 피펫으로 분주합니다. 10분 이내에 백금 픽을 사용하여 형질전환 벌레 5~10마리를 비즈 위에 빠르게 배치하여, 표지된 뉴런이 쉽게 관찰되도록 합니다. 벌레가 손상되지 않도록 표준 커버 슬립을 벌레 위에 조심스럽게 덮습니다.

슬라이드를 움직여 조절합니다. 이제 벌레 슬라이드는 분류학적 분석을 수행할 준비가 되었습니다. 접안렌즈를 사용하여 4배율에서 벌레의 위치를 찾은 후 100배 대물렌즈로 초점을 다시 맞추고, 투과광을 끈 다음 형광광을 켜고 광학 경로를 카메라로 전환합니다.

마우스를 사용하여 십자선 중앙에 뉴런을 맞춥니다. 이제 풋 페달을 이용해 레이저를 발사합니다. 적절한 레이저 출력이라면 한두 번의 펄스만으로 뉴런을 절단할 수 있습니다.

레이저 출력이 너무 강하면 주변 조직이 손상되거나 벌레에 구멍이 뚫릴 수 있으므로, 레이저 출력을 조절하려면 감쇠판을 이동시키십시오. 레이저 출력이 약해지면 감쇠판의 위치를 조정하여 절단을 계속할 수 있습니다. 하지만 이는 레이저의 D 셀에 있는 Kumar in four 40를 교체해야 한다는 신호일 가능성이 높으며, 올바르게 수행되어야 합니다.

레이저 절단술은 뉴런에 작은 절단부를 생성합니다. 특정 사례에서는 손상 부위 주변에 작은 흉터가 형성될 수 있습니다. 실제로는 동물당 1개에서 3개의 뉴런을 절단하지만, 이론적인 제한은 없습니다.

완료되면 커버 슬립을 수직 방향으로 들어 올려 벌레를 회수하되, 벌레가 아가로스 패드 위에 그대로 남아 있도록 주의하십시오. 커버 슬립을 밀어서 제거하지 마십시오. 니들 노즈 포셉(needle nose forceps)을 사용하여 벌레 주변의 패드를 잘라내십시오.

OP 50가 포함된 갓 배양한 NGM 플레이트 위에 패드를 놓고 10 µL의 멸균 M9 용액으로 벌레를 풀어줍니다. 절단 후 8~48시간 사이에 재생 여부를 평가할 수 있습니다. 이를 위해 건강한 벌레를 3~5 µL의 폴리스티렌 비드 위에 다시 고정하고 신경세포와 절단된 신경세포를 시각화합니다. 절단 부위보다 원위부에 있는 신경세포 그루터기가 남아 있을 것입니다. 절단 후 초기에는 원위부와 근위부 그루터기가 모두 수축하지만, 근위부 그루터기로부터 재생이 일어날 것으로 기대됩니다.

성장 원추(growth cone)의 형성 여부로 재생 정도를 측정할 수 있습니다. 또는 신경 돌기(neurite)의 길이를 추적하여 비교할 수도 있으며, 일반적으로 GABA 뉴런의 60~70%가 절단 후 24시간 이내에 성장 원추를 형성합니다. 레이저가 제대로 절단하지 못하는 경우에는 레이저의 초점이 맞지 않았거나 염료 셀의 염료를 교체해야 할 가능성이 높습니다.

또한, 벌레들이 움직이는 것이 관찰된다면 이는 아마도 agros 패드가 너무 습하기 때문일 것입니다. 이러한 문제를 방지하기 위해, 벌레를 패드 위에 올리기 전 약 30초 동안 패드를 그대로 두는 것이 좋다는 것을 확인했습니다. 아울러, 벌레를 고정시키기 위해 더 작은 크기의 마이크로비즈(microbeads)를 사용하는 방법을 시도해 볼 수 있습니다.

마지막으로, 축삭이 구슬 모양으로 보인다면 이는 아마도 agar 패드가 너무 건조하기 때문일 것입니다. 이 영상을 시청하신 후에는 마이크로 포인트 레이저 시스템을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이제 충동을 고정하여 축삭 절단을 수행하고, 개별 뉴런을 절단한 뒤 이후의 재생 과정을 평가하시기 바랍니다.