Name: siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다 2 + ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: 배우세요 siRNA 매개 유전자 침묵과 라이브 세포 칼슘 영상을 이용하여 내소체 막의 Ca²⁺ 누출 채널과 조절 메커니즘을 특성화하는 방법을. 이 기술은 막 단백질을 천연 환경에서 분석할 수 있어 칼슘 신호 연구에 기여합니다.

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SL은 DFG (대학원 연구 학교 845)에서 화목에 의해 지원되었다. 이 작품은 DFG (SFB 530/C1 및 967의 경우)에서 부여로와 HOMFOR 지원했다.

1. 재고 솔루션의 준비 <ol><li> 준비 칼슘을 무료로 버퍼 (140 MM NaCl, 5 KCl MM, 1 MM MgCl 2, 0.5 MM EGTA, 10 HEPES MM - 코 10 MM 포도당 (산도 7.35)). </li><li> Solubilize FURA - 2 1 ㎜ 주식 솔루션을 얻기 위해 DMSO에 오전. 솔루션 homogenously 밝은 노란색까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. 빛과 컵을 보호. 희석 FURA - 2 주식 솔루션 1 ML Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)는 헬라 세포의 로딩 4 μm의의 최종 농도 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는으로 AM. </li><li> 증류수 (산도 7.0)에서 12.5 MM의 puromycin 주식 솔루션을 준비합니다. -20 ° C.에 저장 aliquots 500 μm의 제품 puromycin의 최종 농도에 칼슘 무료로 버퍼에 12.5 MM의 puromycin 주식 솔루션을 희석. </li><li> 1 MM 주식 솔루션을 얻기 위해 DMSO에 thapsigargin을 디졸브. </li><li> 1 MG ophiobolin 20 μl 클로로포름에 A와이 이후, 25 μl DMSO와 혼합 Solubilize. 클로로포름이 증발 때까지 microcentrifuge 관이 열려 있습니다. 따라서 최종 ophiobolin는 농도 100 MM입니다. -20 ° C.에 저장 aliquots 이전 100 μm의의 최종 농도 칼슘 무료 버퍼로 주식 솔루션을 희석, 사용할 수 있습니다. 따라서, 라이브 셀 이미징에 대한 최종 DMSO의 농도는 0.1 %를 초과하지 않습니다. </li><li> -20 ° C. 10 MM 및 매장 aliquots의 농도로 DMSO에 trifluoperazine을 풀다 사용하기 전에 10 μm의의 최종 농도 칼슘 무료 버퍼로 주식 솔루션을 희석. 라이브 셀 이미징에 대한 그러므로 최종 DMSO 농도는 ophiobolin 위해 같은 0.1 %를 초과하지 않습니다. </li><li> 20 μm의 주식 솔루션을 준비하는 RNase 무료로 물속에 siRNAs을 (SEC61A1 siRNA, SEC61A1 - UTR의 siRNA 및 제어 siRNA) 디졸브. 소용돌이를 사용하여 혼합하고 눈으로 solubilization을 관찰. -20 ° C.에 상점 50 μl aliquots </li></ol> 2. 헬라 세포의 유전자 입을 ER 칼슘 2 + 유출하는 특정 단백질의 공헌을 연구하기 위해, 각각의 유전자가 효과적으로 두 개의 다른 siRNAs (그림 1)과 함께 입을 수 있습니다. 또한, 입을의 효과는 해당 야생 유형 유전자의 표현에 의해 극복되어야한다. 일반적으로 우리가 관심있는 유전자의 각각 코딩 및 비 - 코딩 (UTR) 지역,에 대한 이동합니다 siRNAs을 사용합니다. UTR - 감독의 siRNA를 채용하는 것은 complementation위한 편리한 방법을 제공합니다. <ol><li> 시드 5.2 25mm 커버 슬립 (1 H에 대한 폴리 - L - 라이신 (1 MG / ML) 200 μl와 함께 예약 처리)와 6cm ​​문화 접시에있는 X 10 5 헬라 세포 (ATCC 안돼. CCL - 2) Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)는 5 % CO 2 (최종 볼륨 3.9 ML)로 humidified 환경에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 37 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신과 부화는 ° C를 포함 인치 </li><li> SEC61A1 siRNA, SEC61A1 - UTR의 siRNA 또는 제조 업체의 지침 (20 NM siRNA의 최종 농도)에 따라 HiPerFect 시약을 사용하여 부정적인 제어 siRNA와 세포 Transfect. 간단히, 전에 실제 transfection 절차에 별도의 microcentrifuge 관에서 갓 siRNAs 준비 : OptiMEM 80 μl에 녹아있는 각 siRNA 4 μl (20 μm의) 20 μl HiPerFect transfection 시약을 추가합니다. 이 혼합은 부드럽게 vortexed 10 분 실온에서 incubated입니다. 씨앗 5.2 X 10 5 헬라 세포 (3.9 ML)에 dropwise siRNA 믹스를 (104 μl) 추가합니다. </li><li> 24 H 후, 매체를 변경 (3.9 ML)과 같은 siRNA 믹스 (104 μl)와 두 번째 시간 동안 세포를 transfect. </li><li> 서양 얼룩 분석하여 입을을 평가해보십시오. 그것이 80 % 이상이어야합니다. 의 세포 배양 접시에서 세포를 씻어 염분 (PBS)는 인산염 버퍼와 DMEM에서 그들을 수확. 카운테스 자동 셀 카운터를 채용하여 전지를 계산합니다. 단백 분해 효소 - 억제제 칵테일 (3 μg / ML의 Pepstatin 3 μg /과 보충 (10 MM NaCl, 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 3 MM MgCl 2, 0,5 % NP40) 세포 용해 완충액으로 세포를 Lyse ML 류펩틴, 3 μg / ML Antipain 3 μg / ML의 Chymastatin)와 SDS - 샘플 버퍼 (함께 혼합 60 MM 트리스 - HCL, pH를 6.8, 2% SDS, 10 % 글리세롤, 5 % β - 메르 캅 토 에탄올, 0.01 % 블루 bromphenol ) 10.000 셀 / μl의 최종 농도를 얻을 수 있습니다. 열 샘플 56 ° 15 분 C하고, 이후, 단편 DNA 일부 글라스 비즈 20 분 와동를 추가합니다. Laemmli 유형 SDS - PAGE (일반적으로 분리 젤에 대한 polyacrylamid 15 %) 각 샘플 별도의 20 μl. 전송 버퍼에서 3 H 또는 야간 (100 MM Glycin, 12.5 MM 트리스 - HCL)에 대한 지속적인 400mA에서 ( "젖어 얼룩") electroblotting하여 PVDF 막에 분리된 단백질을 전송합니다. 이후 다음 5 % (W / V) 실온에서 30 분 PBS에 저지방 탈지 우유와 함께 블록은 토끼에서 Sec61α의 C - 말단에 대한 감독 차 항체에 얼룩을 폭로하고 반대 β - 굴지 - 마우스 항체. PBS - TritonX - 100에 얼룩 (0.05 %)를 씻고 t각각 5 분 PBS에 와이스. ECL 플렉스 염소 - 안티 토끼를 사용하여 기본 항체를 떠올 IgG - Cy5 또는 ECL 플렉스 염소 - 안티 - 마우스 IgG - Cy3 - 공액 및 이미지 퀀트 TL 소프트웨어 7.0와 함께 태풍 - 트리오 이미징 시스템입니다. SEC61A1 유전자의 경우, 최대 입을 효과는 일반적으로 첫 번째 transfection 후 96 H를 볼 수 있습니다. 대표 실험은 그림에 표시됩니다. 2. </li></ol> 3. 헬라 세포의 Complementation SEC61A1 입을의 표현형를 구출하기 위해 SEC61A1 cDNA는 pCDNA3 - 내부 ribosomal 항목 사이트의 여러 복제 사이트 (MCS) (IRES) - GFP - 벡터 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 발기인, MCS를 포함에 삽입되었다 IRES, 플러스 녹색 fluoresecent 단백질 (GFP) 코딩 순서. <ol><li> 최초의 siRNA의 transfection 후 48 H, 교환 두 번째 시간 매체 (3.9 ML)과 제조 업체의 프로토콜 (Fugene HD 벡터의 최종 비율 4 μg에 따라 Fugene HD를 사용하여 빈 벡터 또는 플라스미드 SEC61A1 표현 중 하나와 함께 세포 변환 16 μl Fugene HD 벡터). 간단히 사전 변환 절차를 별도 microcentrifuge 관에서 갓 plasmids 준비 : OptiMEM 80 μl에 녹아있는 것을 각 플라스미드 4 μg 16 μl Fugene HD 변환 시약을 추가합니다. 10 분 실온에서 부드럽게 와동이 믹스와 부화. 씨앗 5.2 dropwise 플라스미드 믹스 (0.1 ML) × 10 5 헬라 세포를 (3.9 ML) 추가합니다. </li><li> 플라스미드 표현, 칼슘 이미징 및 수확하기 전에 형광 현미경에 따라 문화 요리 48 H 후. 필요한 경우하는 것이 더 나은 형광 신호를 PBS로 DMEM를 교체하십시오. 냉각 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경에 형광 이미지를 기록합니다. 변환 효율은 브라이트 모드에서 계산 80 % 이상되어야 세포 GFP 형광을 표시하는 세포의 수를 나눔으로써 결정하실 수 있습니다. 전형 결과는 그림에 표시됩니다. 3. </li></ol> 4. 라이브 세포 칼슘 이미징 <ol><li> 이전 측정하기 위해 별도의 3.5 ㎝ 문화 접시에있는 헬라 transfected 세포와 코팅 커버 슬립을 전송할 수 있습니다. FURA - 2 25 ° 어둠 11,12에 C에서 45 분 1 ML DMEM에서 오전 4 μm의와 세포를로드합니다. </li><li> iMIC 금속 챔버에서 25mm 커버 슬립을 수정하고 두 번 세포를 씻어과 칼슘 무료 버퍼 (각 시간을 300 μl)에 품어. </li><li> 340 NM 및 380 nm의에서 번갈아 흥분에 의해 색채 V와 iMIC 현미경에 대한 데이터를 수집하고 510 nm의 (; 에미터, 70분의 605 NM beamsplitter, 565 nm의 필터 설정)에서 배출 형광 측정을 시작합니다. 매 3 S. 20-50 세포 / 프레임을 포함하는 샘플 이미지 F340과 F380은 각각, 340과 380 nm의의 배경 - 빼서 형광 강도에 해당하는 비율 F340/F380로 기록 FURA - 2 신호. </li><li> 1 분 후, 칼슘 무료로 버퍼에 또는 동일한 버퍼와 puromycin와 세포 (500 μm의) 취급. 또는 작은 분자 억제제 (예 : 10 μm의의 trifluoperazine 또는 100 μm의 ophibolin 등) 또는 칼슘 무료 버퍼로 세포를 처리합니다. </li><li> ratiometric 측정은 2 또는 10 분 실시 후, thapsigargin을 추가 (1 μm의)와 측정을 계속합니다. </li><li> 결국 cytoslic [칼슘 2 +] 설립 보정 방법으로 비율 측정에서 추정된다. 2 엑셀 2007 오리진 6.1으로 데이터를 분석합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 지금까지 우리는 SEC61A1 유전자의 입을은 칼슘에 영향을 여부 질문 (CA 2 +) 응급실 (그림 1)에서 누수를 해결. SEC61A1 유전자는 96시간에 대한 헬라 세포에 두 개의 서로 다른 siRNAs로 침묵했다. 거의 아무런 영향이 없으며, 세포 성장과 생존을 입을 있지만, 세미 permeabilized 세포의 응급실에 단백질 수송은 거의 완전히 저해되었다. 또한, SEC61A1 침묵 세포가 심각하게 응급실에서 칼슘 2 + 유출과 관련하여 영향을 받았다고. 유전자 입을의 효과는 SEC61A1 유전자 표현에 의해 반대되었다. 따라서, 모든 nucleated 세포의 응급실 막에 존재 Sec61 단지는 칼슘 2 + 항상성에 중요한 역할을 할 것으로 기대 수있는 칼슘 2 + 누출 채널을 형성합니다. 그러나, 같은 ER 막에 Sec61 단지로 형성 억제 이온 투과성 대형, 물이 가득한 모공의 존재, 진지하게 + ER의 루멘에서 cytosol, 세포에 필수적인 메커니즘에 칼슘 2의 규제 릴리스를 방해 할 꺼야 신호. 우리는 포유 동물 Sec61α의 cytosolic N - 말단에 calmodulin (CAM) 바인딩 모티브를 확인한 바운드 캠 아니라 칼슘이 nanomolar 친화 및 시퀀스 특이성과 + 무료 apocalmodulin. 세포 수준에서, 두 개의 서로 다른 캠 antagonists는 CA를 자극 (4와 5 무화과)의 부재에있는 존재의 응급실에서 + 릴리스. Sec61 채널 Sec61α의 IQ의 모티브에 변이를 포함하는 현재했을 때 후자는 관찰되지 않았습니다. 따라서, CA 2 + - CAM은 칼슘이 제한 + 응급실 (그림 6)에서 누출에 관한 일을하고있다. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 플로우 차트. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 효율성을 입을위한 데이터 분석. 입을는 (로딩 제어) Sec61α 및 β - 굴지에 대한 감독했다 항체를 사용하여 서양 얼룩 분석에 의해 평가되었다. 기본 항체는 ECL 플렉스 차 항체 및 형광 이미징을 사용하여 시각되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. transfection 효율을위한 데이터 분석. 이미지가 냉각 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경에 기록되었다. 변환 효율은 브라이트 모드에서 계산 세포 GFP 형광을 표시하는 세포의 수를 나눔으로써 결정하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 제어 또는 SEC61A1 - siRNA와 CAM - 길항제 ophiobolin A. 헬라 세포의 존재 또는 부재의 존재에 헬라 세포의 라이브 세포 칼슘 이미징에서 그림 4. 스크린샷은 SEC61A1 (B) 또는 향한 siRNA로 치료했다 부정적인 제어 siRNA는 (A) 96에 대한 H가로 지적했다. 이러한 세포는 칼슘 표시기 FURA - 2이라서로드 및 칼슘 2 incubated되었습니다 + 버퍼에 다음 0.5 MM EGTA, 버퍼 또는 ophiobolin (Ophio)을 포함 무료로 버퍼가 추가되고 부화가 재개되었습니다. 10 분 후에, CA 2 + 릴리스는 외부 칼슘 2의 부재에서 thapsigargin (TG)를 적용하여 시작했습니다 +와 부화가 계속되었다. 지속적인 칼슘 이미징에서 화면 캡처는 지정된 시간에 찍은. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 라이브 세포 칼슘 이미징 실험을위한 데이터 분석. 로 그림에 묘사된 실험 일련의 (A) 운동 및 정량 분석. 4A. Cytoslic [칼슘 2 +] 설립 보정 방법 2 비율 측정에서 추정되었다. thapsigargin의 효과가 막대 도표로 표시됩니다. (BD) 셀은 48 H에 대한 제어 siRNA 또는 SEC61A1 - siRNA 표시로 취급하고 제어 벡터 (C), 또는 플라스미드 SEC61A1 표현 (C), 또는 표시 플라스미드 돌연변이 SEC61A1 표현 (D) 중 하나와 함께 변형되었다. 4 5A의 오른팔에서와 같이 48 후 H는 칼슘 이미징 실험이 수행되었다. cytosolic 칼슘 2의 변화 통계 분석 + 등이 표시됩니다 소개하고 같이 실험에 thapsigargin의 추가 이후 농도. P 값 &lt;0.001는 unpaired t 검사로 중요한로 정의되었다 세 별표 (***), NS, 중요하지으로 표시됩니다. 분석되었습니다 세포의 번호가 표시됩니다. 평균 값이 주어진, 오류 막대 수단 (SEM)의 표준 오류를 나타냅니다. 우리는 이러한 사례가 심판 적응다고합니다. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 이러한 데이터가 Sec61 복잡한에서 초기 체인의 출시 실제로 응급실과 Sec61 복합 cytosolic 입 주위에 칼슘 nanodomain의 형성에서 칼슘 릴리스로 연결되었음을 나타냅니다. 이 칼슘은 calmodulin에 의해 바운드 및 칼슘 calmodulin는 Sec61 복잡한을 닫습니다. "

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

포유 동물 세포에서, endoplasmic reticulum (ER)은 단백질 biogenesis뿐만 아니라 칼슘 신호에 중요한 역할을합니다. 여기, 우리는 직접 한 잠재적인 칼슘 2 + 누설 채널의 역할을 주소로하고 putative 규제 메커니즘 13 성격 수있는 실험 시스템을 설명합니다. 이 실험 시스템이 수동 칼슘 2 + 유출을 제한 단백질과 구조를 특징 짓는 여러 가지 세포 유형 II의 응급실에서 수동 칼슘 2 + 유출 다른 ER 막 단백질의 기여를) 평가) 나는 우리에게 독특한 기회를 제공하고, 3) 관련 부품에 연결된 질병 돌연변이의 효과를 연구. 우리는 오직 가능한 세포 분석해야 유의하고 전반적인 생존은 80 % 이상되어야합니다. 따라서, 세포 생존 능력은 정기적으로 제조 업체의 프로토콜에 따라 핵 ID 녹색 / 청색 세포 생존 시약을 채용 평가됩니다. 또한, cytosolic 칼슘 2의 변화 통계 분석 + 농도는 필수입니다. 따라서 실험은 최소한 20 세포가 하나의 실험에서 각 조건에 대해 분석해야과 함께 세포의 네 가지 일괄적으로 두 coverslips을 위해 실시해야합니다. 우리는 다양한 실험 커버 전표에 시딩 후 동시에 실시해야합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> DMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 31,966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 51,985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> PAA </td><td> P11 - 010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> 로체 진단 </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> 원자력 - ID 블루 / 그린 세포 생존 시약 </td><td> 엔조 생명 과학 </td><td> ENZ - 53004 </td></tr><tr><td> FURA - 오전 2시 </td><td> Invitrogen </td><td> F - 1221 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> 시그마 </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T - 7459 </td></tr><tr><td> Ophiobolin </td><td> 엔조 생명 과학 </td><td> ALX - 270-109 </td></tr><tr><td> Trifluoperazine </td><td> 시그마 </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> 카운테스 ® 자동 셀 카운터 </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> 태풍 - 트리오 이미징 시스템 </td><td> GE 헬스케어 </td><td></td></tr><tr><td> DS - 5Mc 카메라와 함께 TE2000 - S 현미경 </td><td> 니콘 </td><td></td></tr><tr><td> 색채 V와 iMIC 현미경 </td><td> Photonics 틸 </td><td></td></tr></tbody></table>

sirna의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 ca를 나타냅니다 2 + er 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

포유 동물 세포에서, endoplasmic reticulum (ER)은 단백질 biogenesis뿐만 아니라 칼슘 1 신호에서 핵심적인 역할을 담당하고 있습니다. ER 막의 heterotrimeric Sec61 단지는 응급실의 루멘에 새로 합성된 polypeptides에 대한 수성 경로를 제공합니다. 다양한 연구소에서 최근 작업이 heterotrimeric 복잡한 또한 일시적인 칼슘 2 + 누설 채널 2-8을 형성 수도 것을 제안했습니다. 이 개념에 대한 핵심 관찰 puromycin가 + 응급실에서 칼슘 2 과도 릴리스로 연결하여 ribosome과 Sec61 복잡한에서 초기 polypeptides의 릴리스되었습니다. 또한, 그것은 응급실 luminal 단백질 bip (빨리)이 Sec61 복잡한 9,10 수준에서 이온 투과성 방지에 관여 것을 체외에서 관찰했다. 우리는 바로 잠재적인 칼슘 2 + 누설 채널로 Sec61 단지의 역할을 주소로하고 putative 규제 메커니즘 11-13 특성을 수있는 실험적인 체제를 구축했습니다. 이 시스템은 siRNA의 중재 유전자 입을 라이브 세포 칼슘 2 + 영상 13 결합되어 있습니다. 세포는 코딩 및 번역되지 않은 지역 (UTR), 각각 SEC61A1 유전자이나 부정적인 제어 siRNA에 대한 이동합니다 siRNAs로 취급됩니다. complementation 분석에서 세포는 wildtype SEC61A1 유전자의 siRNA 방지 표현이 가능 IRES - GFP 벡터와 공동 transfected 있습니다. 그러면 세포는 cytosolic 칼슘 2 동시에 변경 + 형광 현미경을 통해 세포의 여러 농도를 모니터링하기 위해 ratiometric 칼슘 2 + - 표시기 FURA - 2와 함께로드됩니다. cytosolic 칼슘 2 연속 측정 +도 허용 칼슘 2 + 누설에 같은 puromycin, 작은 분자 억제제 및 thapsigargin 등 다양한 대리인의 영향의 평가. 이 실험 시스템이 수동 칼슘 2 + 유출을 제한 단백질과 구조를 특징 짓는 여러 가지 세포 유형 II의 응급실에서 수동 칼슘 2 + 유출 다른 ER 막 단백질의 기여를) 평가) 나는 우리에게 독특한 기회를 제공하고, 3) 관련 부품에 연결된 질병 돌연변이의 효과를 연구.

endoplasmic reticulum은 단백질 biogenesis과 칼슘 항상성에 중요한 역할을합니다. 우리는 우리 Ca2 + 누출 채널의 역할을 주소로하고 putative 규제 메커니즘을 특징 수있는 실험적인 체제를 구축했습니다. 이 시스템은 siRNA 중재 유전자 입을 라이브 세포 Ca2 + 이미징을 포함한다.

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다 2 + ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

포유류 세포에서 소포체(ER)는 단백질 생합성과 칼슘 신호 전달 모두에서 핵심적인 역할을 합니다1. 헤테로삼합체 Sec61...

포유류 세포에서 소포체(endoplasmic reticulum, ER)는 단백질 생합성과 칼슘 신호 전달에 중요한 역할을 합니다. ER 막에 존재하는 이종삼량체 Sec61 복합체는 새로 합성된 폴리펩타이드가 ER 루멘으로 들어갈 수 있도록 수성 통로를 제공합니다. 최근 데이터에 따르면 Sec61이 일시적인 칼슘 누출 채널을 형성할 수 있음을 시사하며, 이에 따라 잠재적인 칼슘 누출 채널로서의 Sec61 복합체의 역할을 직접적으로 다루고자 합니다.또한 가설로 세워진 조절 기전을 규명하기 위해, 먼저 sex 61 A one 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 세포에 처리합니다. 상보성 분석에서는 야생형 sex 61 A one 유전자가 siRNA에 저항하여 발현될 수 있도록 하는 iris GFP 벡터를 세포에 공동 형질전환합니다. 그 다음, 비례 측정용 칼슘 지시약인 RO two를 세포에 로딩하고, 형광 현미경을 통해 세포질 내 칼슘 농도의 변화를 관찰합니다.칼슘 농도를 측정함에 따라, calmodulin 길항제 및 fabs argon과 같은 다양한 약제의 영향을 평가하기 위해 용액 교환을 수행합니다. 결과 이미지의 정량 분석을 통해 Sec61$\alpha$1의 침묵화(silencing)로 인해 유도된 칼슘 플럭스(calcium flux)의 변화를 확인합니다. 본 영상에서는 실험 절차 시연 및 결과 제시 이후, 칼슘 플럭스에서 Sec61$\alpha$1의 역할에 대한 모델을 제시하겠습니다.이 기술이 평면 지질 바이오 실험이나 단일 채널 측정과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 후보 막 단백질을 천연 환경에서 분석할 수 있으며, 번거로운 정제 과정과 일반적으로 효율이 낮은 기능적 재구성 과정 없이도 분석이 가능하다는 점입니다. 이 방법은 예를 들어, 서로 다른 세포 유형에서 특정 ER 막 단백질이 ER로부터의 칼슘 유출에 어떻게 기여하는지, 그리고 이들이 어떻게 조절되는지와 같은 칼슘 신호 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 실험 절차의 시연은 저희 연구실의 재능 있는 두 대학원생이 수행할 것입니다. 우선, 사용할 용액과 시약을 준비하여 이 절차를 시작하십시오. 먼저, 동봉된 서면 프로토콜의 지침에 따라 칼슘 제거 완충액을 준비하십시오.다음으로, 칼슘 지표의 스톡 용액을 희석합니다. 10% FBS와 1% penicillin streptomycin이 포함된 DMEM 1mL에 최종 농도가 4 µM이 되도록 희석합니다. 1 mM Apso Garin 스톡 용액을 칼슘 제거 버퍼(calcium free buffer)로 희석하여 최종 농도를 3 µM로 맞춥니다. 또한, 특정 siRNA의 오프타겟 효과(off-target effects) 연구 위험을 줄이기 위해 200 µM olein A와 20 µM를 준비합니다. transfection 과정의 잠재적인 부작용을 평가하기 위해 각 유전자를 억제하는 데 두 종류의 서로 다른 siRNA를 사용합니다.무작위 뉴클레오타이드 서열로 구성된 음성 대조군 siRNA를 실험군 siRNA와 병행하여 트랜스펙션합니다. siRNA 매개 침묵 효과가 야생형 cDNA의 발현에 의해 회복될 수 있음을 확인하는 것이 중요합니다. 따라서 실험에 사용되는 siRNA는 구조 플라스미드가 해당 siRNA의 영향을 받지 않도록 특별히 선택합니다. 본 실험에서 siRNA는 표적 유전자의 코딩 영역과 비코딩 영역 또는 UTR로 약칭되는 비번역 영역 모두를 대상으로 합니다.siRNA가 UTR rescue를 표적으로 하는 경우, 내인성 UTR이 없는 플라스미드를 사용하여 HeLa 세포에 transfection을 수행할 수 있습니다. 각 transfection당 25 mm poly-L-lysine 코팅 커버슬립을 6 cm 세포 배양 접시에 하나씩 배치하여 transfection을 위한 세포를 준비합니다. 1시간 후, 각 접시에 5.2 × 10⁵ HeLa 세포와 보충제(supplemented)가 포함된 DMEM을 첨가합니다. 세포를 transfection 하기 위해 마이크로 원심분리 튜브 하나에 라벨을 부착합니다.각 튜브의 형질전환 반응당, 80 µL의 Opti-MEM에 용해된 20 µM siRNA 4 µL를 첨가합니다. SEC61A1, SEC61A1 UTR 및 음성 대조군 siRNA를 각각의 튜브에 준비합니다. Hyperfect 형질전환 시약 20 µL를 추가하고 부드럽게 볼텍싱한 후, 실온에서 10분 동안 반응물을 배양합니다. 세포에 형질전환시키기 위해, 총 104 µL의 siRNA 혼합액을 부착된 HeLa 세포에 한 방울씩 떨어뜨리고 디쉬를 부드럽게 회전시켜 형질전환 복합체가 균일하게 분포되도록 합니다.5% 이산화탄소가 포함된 습윤 환경의 37°C에서 배양합니다. 24시간 후, 배지를 3.9 mL의 신선한 배지로 교체합니다. 그다음, transfection 효율을 높이기 위해 동일한 irna mix를 사용하여 transfection을 두 번째로 수행하고, silencing 효과를 평가하기 위해 western blot 분석을 실시합니다.여기 sex 61 A one에 대해 나타난 것처럼, 사이런싱 효율은 80% 이상이어야 합니다. 최대 사이런싱 효과는 일반적으로 첫 번째 트랜스펙션 후 96시간에 나타나며, sex 61 사이런싱으로 인한 표현형을 복구하기 위한 준비는 첫 번째 트랜스펙션 후 48시간에 이루어집니다. 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 라벨을 붙이는 것으로 시작하십시오.이제 각 반응에 대해 세포에 공벡터 또는 야생형 sex. 61 A one 발현 플라스미드를 형질전환합니다. 여기서 사용된 야생형 발현 플라스미드는 pcd의 다중 클로닝 부위에 sex 61 A one cDNA를 삽입하여 제작되었습니다.cytomegalovirus 프로모터, iris 및 녹색 형광 단백질 코팅 서열을 포함하는 3가지 내부 리보솜 진입 GFP 벡터입니다. 각 튜브에 optimum 80 µL에 용해된 각 플라스미드 4 µg을 첨가하여 형질전환 시약을 준비합니다. 그런 다음 여기에 FU gene HD 형질전환 시약 16 µL를 첨가하고, 이 용액을 부드럽게 볼텍싱한 후 상온에서 10분 동안 배양합니다.그 후 배지를 교체하고, 분주된 5.2 × 10⁵ 개의 HeLa 세포에 플라스미드 혼합물을 한 방울씩 첨가한 뒤 디쉬를 부드럽게 흔들어 트랜스펙션 복합체가 균일하게 분포되도록 합니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 추가로 배양합니다. 트랜스펙션 효율을 결정하기 위해 형광 현미경으로 GFP 발현을 평가합니다.48시간 후, 세포의 최소 80%가 형질전환되어야 합니다. 이미징 전, 핀셋을 사용하여 형질전환된 hela 세포가 부착된 커버슬립을 새로운 3.5 centimeter 세포 배양 접시로 옮기고, 4 micromolar가 포함된 DMEM 1 milliliter를 추가합니다.만약 2:00 AM라면, 암실에서 25 °C로 45분 동안 배양하십시오. 이미징을 수행하려면, 세포가 2개 이하로 로드된 커버슬립을 금속 기록 챔버로 옮기고 챔버의 두 부분을 나사로 조여 고정하십시오. 피펫을 사용하여 세포에 300 µL의 칼슘 제거 버퍼를 첨가하고 제거하여 세척하십시오.반복한 후, polychrome five cremator가 장착된 I MIC 현미경에 기록 챔버를 설치하십시오. URA two용 필터 세트를 사용하여, FU A two의 칼슘 독립적 형광을 추정하기 위해 최소 20개의 세포가 포함된 시야를 찾으십시오. 이 단계에서 사용되는 들뜸 파장은 360 nanometers입니다.적절한 시야를 선택한 후, 이미징 소프트웨어가 340 nanometers 및 380 nanometers에서 여기시키고 510 nanometers에서 방출되는 형광을 3초마다 측정하도록 설정하십시오. 여기에 제시된 설정의 경우 형광 강도가 약 1000 arbitrary units가 되도록 노출 시간을 설정합니다. 노출 시간은 5 millisecond로 설정합니다. 또한, 세포가 없는 배경 영역과 최대 20개의 세포 윤곽에 대해 관심 영역(ROI)을 지정하십시오.실험이 진행되는 동안 살아있는 세포 이미징을 시작하면, 시스템은 두 개 이상의 신호에 대한 비율 측정 이미지와 더불어, 각 표시된 ROI에 대한 실시간 F340/F380 비율을 선 그래프로 표시합니다. 여기서 F340과 F380은 각각 340nm와 380nm에서 ROI 내의 형광 강도에 해당합니다. 1분 후, 다양한 실험 매개변수를 테스트하기 위해 이미징 챔버에 테스트 용액을 추가합니다. 본 실험에서는 10분 동안 추가로 비율 측정을 수행한 후, Calmodulin 길항제인 trifluorine 및 bollin A를 테스트합니다.CAL 모듈형 길항제의 경우, DSA gargan을 추가하고 측정을 계속합니다. 실험당 400쌍의 이미지를 기록하십시오. 이미지 수집이 완료되면, 이미지를 검토하고 각 시야(field of view)당 최소 20개 세포의 ROI를 표시하십시오.그 후, 소프트웨어의 kinetic analysis 옵션을 사용하여 배경이 감쇄된 ratio 이미지 시퀀스와 배경이 감쇄된 칼슘 ratio kinetics 그래프를 생성합니다. 마지막으로 각 ROI의 데이터를 확립된 검정 방법을 사용하여 excel 및 origin으로 내보냅니다. cytosol 칼슘 농도는 ratio 측정값으로부터 계산할 수 있으며, 이를 통해 sex 61 A one 유전자가 er의 칼슘 누출에 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다.두 종류의 서로 다른 RNA를 사용하여 HeLa 세포에서 sex 61 A one 유전자를 96시간 동안 억제하였습니다. 동일한 수의 세포를 3회 반복 측정하여 Western blot 분석으로 억제 정도를 평가한 결과, 여기에서 보시는 바와 같이 1~3번 레인에서는 강한 6 61 alpha 신호가 나타났으며, 6 61 A one 억제 세포에 해당하는 4~6번 및 7~9번 레인에서는 신호가 현저히 약하게 나타났습니다. 결과를 정량화하기 위해 sex 61 alpha 신호를 beta actin 신호로 표준화하였으며, ER calcium F flux에서 calmodulin의 역할을 테스트하기 위해 80% 이상의 억제 효율을 달성하였습니다.Calmodulin 길항제인 Bollin A의 존재 또는 부재 하에서 sex 61 A one sir A 처리된 helo 세포의 URA two 이미징을 수행하였습니다. 이 영상은 Bollin A 처리 10분 후의 대조군 세포를 보여줍니다. 여기서 볼 수 있듯이, 외부 칼슘이 없는 상태에서 ER로부터의 칼슘 방출을 유도하는 sirca 억제제인 FSO Gargan을 처리하여 칼슘 방출을 개시하였습니다.FSA argon을 첨가하자 일시적이지만 상당한 형광 증가가 나타났으며, 이는 er로부터의 칼슘 F flux를 나타냅니다. 이와 대조적으로, PHE 골의 A 처리된 sex 61 A one silent 세포에 FSO garin을 첨가한 후의 칼슘 F flux는 여기에서 볼 수 있듯이 훨씬 덜 뚜렷하게 나타납니다. 이러한 차이는 일련의 동영상에서 시간에 따른 추정 세포질 칼슘을 보여주는 이 도표에서 명확하게 확인할 수 있으며, 여기의 정량적 결과는 이 막대 도표에서 볼 수 있듯이 offi bolin A가 존재하는 상태에서 thic argon에 반응하여 대조군 세포의 칼슘 flx가 증가했음을 확인해 줍니다.두 번째 cam 길항제인 triazine에서도 동일한 현상이 관찰되었습니다. 그러나 두 가지 sex 61 A siRNA 중 하나를 사용하여 세포에서 sex 61 complex를 고갈시켰을 때 cam 길항제의 효과는 나타나지 않았습니다. sex 61 A one silent 세포에 sex를 트랜스펙션했을 때 이러한 표현형의 부분적인 회복을 확인할 수 있습니다.여기에 나타난 바와 같이 61 a 원발현 플라스미드입니다. Cal Modin 작용제에 반응하는 칼슘 유출은 irna 비민감성 야생형 플라스미드의 형질전환으로 부분적으로 복구되었습니다. 이러한 결과는 세포 내의 sex 61 복합체 수준에서 ER 칼슘 유출을 제한하는 데 Cal Modlin이 관여함을 시사합니다.만약 그렇다면, Calmodulin 결합 부위에 이중 돌연변이가 있는 Sec61$\alpha$1 유전자를 형질전환시키더라도 siRNA로 유도된 표현형이 회복되지 않아야 합니다. 실제로 IQ 모티프에 이중 돌연변이가 있는 Sec61$\alpha$1 발현 플라스미드를 사용하여 세포를 형질전환시켰을 때, 표현형의 회복은 나타나지 않았습니다. 이러한 데이터는 Sec61 복합체로부터 신생 사슬이 방출되는 것이 실제로 ER로부터의 칼슘 방출과 Sec61 복합체의 세포질 입구 주변에 칼슘 나노 도메인 형성을 유도한다는 것을 나타냅니다.이 칼슘은 Calmodulin에 의해 결합되며, 칼슘 Calmodulin은 sex 61 복합체를 폐쇄합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 본 절차에 따라 인간 세포에서 siRNA 매개 유전자 침묵법을 라이브 셀 칼슘 이미징과 결합하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 관련 구성 요소에서 질병 연관 돌연변이의 잠재적 영향을 확인하는 것과 같이 추가적인 질문에 답하기 위해, 질병 연관 돌연변이가 포함된 cDNA의 발현과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.또한 TAP과 같은 약물을 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 따라서 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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연구

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라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

대상 - 에스테르 가수 분해 효소 유도 염료로드 (TED)는 형광 이미징에 의해 세포 내 칼슘 저장소 역학의 분석을 지원합니다. 방법은 합성 낮은 친화력 CA의 로컬 폭로을 향상 소포체 (ER)로 재조합 Carboxylesterase의 대상에...

대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 ER 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (TED)

여기에서는 Ca2+ 지표가 로드된 온전한 포유류 세포에서 형광 현미경을 사용하여 로컬 IP3 매개 Ca2+ 이벤트를 이미징하는 기술과 이러한 이벤트의 식별 및 분석을 자동화하는 알고리즘을 제시합니다.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

소포체 칼슘 항상성은 다양한 병리학에서 파괴됩니다.  분비된 ER 칼슘 모니터링 단백질(SERCaMP) 리포터를 사용하여 ER 칼슘 저장소의 중단을 감지할 수 있습니다.   이 프로토콜은 가우시아 루시페라아제 SERCaMP를 사용하여 ER 칼슘 항상성을 in vitro 및 in vivo에서 검사하는 방법을 설명합니다.

사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링<em&gt; Gaussia</em&gt; 루시 페라 제 SERCaMP

현재 사용 가능한 대부분의 칼슘 지표는 배양된 평활근 세포의 근 소포체에서 방출된 칼슘의 간접적인 측정으로 세포질 칼슘 과도 현상을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 sarcoplasmic reticulum lum lumen 내에서 칼슘 신호를 직접 측정할 수 있는 특정 FRET 기반 지표의 사용을 설명합니다.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

우리는 실시간 형광 현미경을 사용하여 HEK293 및 골격근 C2C12 세포의 소포체 / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)에서 빠른 칼슘 과도 현상을 모니터링하기위한 우리의 표적 유전자 코딩 칼슘 지시약 (GECI) CatchER +의 적용 을위한 프로토콜을 제시합니다. 현장 K d 측정 및 교정을위한 프로토콜도 논의됩니다.

표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링<sup&gt; 2+</sup&gt; 센서 캐쳐<sup&gt; +</sup

이 방법은 모델 유기체 C. elegans의신체 벽 근육에서 발동 된 칼슘 과도 의 변화와 이미지 기준선 세포질 칼슘 수준에 광유전학 및 유전적으로 코딩 된 칼슘 센서를 결합하는 방법을 제공합니다.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

여기 우리는 캘리포니아2 + 이미징 신경 그리고 glial 세포, 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 해 부를 수 있게 하는 프로토콜을 제시. 이 프로세스는 유전자 인코딩된 Ca2 + 지표의 식을 허용 하는 모든 셀 형식에 적용 됩니다.

로컬 Ca2 + 신호 막 대상 Ca2 + 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

이 프로토콜은 바이러스에 감염된 인간 장 오가노이드에서 칼슘 이미징을 수행하기 위한 접근 방식을 설명하고 분석에 대한 접근 방식을 제공합니다.

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

이 논문에서는 Fura-2/AM 염료를 사용한 단일 세포 Ca2+ 이미징을 사용하여 세포 내 칼슘 이온(Ca2+) 농도를 실시간으로 정량적으로 모니터링하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 효율적인 염료 로딩과 형광 강도 비율을 통한 Ca2+ 수준의 정확한 계산을 가능하게 하여 연구 응용 분야를 위한 간단하고 빠른 접근 방식을 제공합니다.

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

배우세요 siRNA 매개 유전자 침묵과 라이브 세포 칼슘 영상을 이용하여 내소체 막의 Ca²⁺ 누출 채널과 조절 메커니즘을 특성화하는 방법을. 이 기술은 막 단백질을 천연 환경에서 분석할 수 있어 칼슘 신호 연구에 기여합니다.

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다^{2 +} ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

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