형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

이 비디오는 화학 라이브러리의 고처리량 스크리닝 또는 환경 오염 물질 검출을 위해 CL gan의 형광 균주를 배양 및 분주하여 특정 단백질 활성에 대한 화학적 또는 환경 물질의 영향을 평가하는 방법을 보여줍니다. CL elgan에서는 박테리아 배양액을 먼저 벌레 및 GFP 형질전환의 먹이로 준비합니다. 동기화된 웜이 배양됩니다.

그런 다음 0.5에서 200만 마리의 벌레를 모아 세척하고 3 84로 분배합니다. 글쎄, 마이크로타이터 플레이트, 그런 다음 화학 라이브러리 또는 물, 음식 또는 토양과 같은 테스트 샘플의 작은 분자를 웜에 추가합니다. 마지막으로, 기생충의 형광은 마이크로플레이트 리더로 측정합니다.

형광 강도에 대한 데이터 분석을 통해 유도 가능한 전사 경로를 조절하거나 환경 오염 물질을 검출할 수 있는 작은 분자가 밝혀졌습니다. 시험관 내 및 세포 배양 기반 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 in vivo에서 독성 또는 비활성 화합물에 시간을 낭비하지 않는다는 것입니다. 이 고처리량 방법은 다양한 유도 경로를 조절하는 작은 분자를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

당사는 저분자 라이브러리의 고처리량 스크리닝을 위해 이 방법을 개발했지만, 식품 및 환경 시료의 오염 물질에 대한 바이오센싱에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Andrew Dine과 제 연구실의 박사후 연구원인 Q long입니다. 세균성 벌레 먹이를 미리 준비하십시오.

먼저 500ml의 훌륭한 육수에 1ml당 50마이크로그램의 스트렙토마이신과 5ml의 포화 대장균을 접종합니다. OP 50. 배양물을 셰이커에 놓고 섭씨 37도에서 밤새 자랍니다.

다음날, 배양액을 10 50 밀리리터 튜브로 나눕니다. 그런 다음 튜브를 냉장 원심분리기에 넣고 20분 동안 2, 500 RCF로 회전합니다. 스핀 Resus 후 각 박테리아 펠릿을 10ml의 액체 선충 성장 배지 또는 NGM에 현탁시킵니다.

서스펜션을 수평으로 흔듭니다. 박테리아를 다시 현탁시키기 위해 15분 동안 바닥 셰이커를 사용합니다. 다음으로, 박테리아 배양을 섭씨 4도에서 20분 동안 2, 500 RCF에서 원심분리합니다.

NGM의 디캔팅을 하고 박테리아 펠릿의 무게를 잰다. 그런 다음 동일한 부피의 NGM 완충액을 추가하고 와류로 펠릿을 재현탁합니다. 마지막으로, 재현탁된 박테리아 배양액 3ml를 15ml 튜브에 분취하고 필요할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.

이 데모에서는 스트레스 유발 Xeno Duke 대출이 전사 인자 Sskn one에 미치는 영향을 예로 측정합니다. Sskn one은 산화 및 이종(xenobi) 스트레스 동안 세포 보호 유전자를 활성화하는 것으로 알려져 있습니다. 두 개의 형광 구조체를 운반하는 Trenchgenic c gans line VP 5 96의 대규모 배양이 준비됩니다.

VP 5 96 웜은 전사 인자의 활성을 모니터링하는 데 사용되는 GFP를 구동하는 GST 4 프로모터를 모두 발현합니다. Sskn 1 및 DOP 3 발기인 운전. RFP는 웜 번호 정규화의 표준으로 사용됩니다.

DOP 3은 도파민 수용체의 촉진제이며 몸 전체의 뉴런에서 구성적으로 발현됩니다. 예를 들어, 제노비 lon이 sskn one을 강력하게 활성화하고 GS T 4 프로모터로부터 발현되는 GFP의 양을 증가시켜 배양을 준비하기 위해 150 밀리리터의 N NGM 버퍼, 1.5 밀리리터의 LB 150, 1 몰 콜레스테롤 및 75 마이크로리터의 100 밀리리터 당 100 밀리그램을 결합함으로써 배양을 준비하기 시작한다. 스트렙토마이신. LB를 추가하면 벌레가 유리 제품과 플라스틱 제품에 달라붙는 것을 방지하는 데 도움이 되지만 이 양은 박테리아 성장을 지원하기에 충분하지 않습니다.

여과하여 혼합물을 살균한 다음 멸균 1리터 플라스크에 옮기고 플라스크를 따로 보관하여 GR 성인 벌레의 알을 방출합니다. 기생충을 원심분리하고 supinate가 투명해질 때까지 NGM 배지를 교체하여 박테리아를 씻어냅니다. Resus를 사용하여 지렁이를 두 번째로 씻고 탈수 후 다시 멸균 물 원심 분리기에 매달아 놓습니다.

supinate를 제거하고 튜브에 3.75ml의 멸균수를 채웁니다. 가정용 표백제 1ml와 10 일반 수산화나트륨 250 마이크로 리터를 5-6 회 반전으로 즉시 혼합하십시오. 벌레가 표백제에 4분 동안 노출된 후 튜브를 회전기에 넣습니다.

튜브를 실체 현미경 아래에 놓습니다. 대부분의 어른들은 거짓말이어야 한다. 튜브를 15-20회 세게 흔들어 총 5분 동안 용해된 후 남아 있는 성충이 있는지 확인하고 튜브가 가득 찰 때까지 멸균수를 추가합니다.

알을 모으기 위해 5-6회 반전으로 혼합합니다. 500 RCF에서 1분 동안 튜브를 원심분리합니다. Resus로 계란을 세 번 씻고 10ml의 멸균 물에 구부린 다음 회전시켜 supinate를 제거합니다.

다음으로, 100ml의 NGM 완충액을 첨가하여 난자의 100μl 샘플을 100배로 희석합니다. 그런 다음 3개의 5마이크로리터 분취액을 현미경으로 페트리 접시 뚜껑에 피펫으로 넣습니다. 3개의 개별 5마이크로리터 분취량에 있는 난자의 수를 세십시오.

총 난자 수를 추정합니다. NGM 버퍼가 있는 플라스크에 200, 000에서 200만 개의 계란을 넣고 섭씨 20도에서 100RPM으로 배양물을 흔듭니다. 난자를 플라스크에 첨가한 후 최소 16시간 후에 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 약 0.5ml의 부유 기생충 배양액을 제거합니다.

피펫으로 5마이크로리터 3방울을 페트리 접시의 멸균 뚜껑에 떨어뜨립니다. 영하 20도의 냉동고에 뚜껑을 1-2분 동안 넣어 벌레가 마비되면 벌레를 마비시킵니다. 실체 현미경으로 5마이크로리터당 살아있는 부화한 벌레의 평균 수를 세어 총 수를 추정합니다.

앞서 준비한 냉동 OP 50 박테리아 배양액을 몇 분 동안 벤치에 올려 해동합니다. 그런 다음 500, 000 부화 된 웜 당 50 % OP 50의 3 밀리리터를 추가합니다. 플라스크를 섭씨 100도에서 20rpm으로 흔듭니다.

기생충은 약 51시간 안에 L 4마리의 유충과 성충 단계로 발달합니다. 육안 검사를 통해 배양 전반에 걸쳐 박테리아의 양을 모니터링합니다. 매체가 투명해지면 더 많은 박테리아를 추가하십시오.

멸균 혈청학 피펫을 사용하여 약 0.5ml의 부유 기생충 배양액을 표준 NGM 한천 플레이트로 옮깁니다. 실체 현미경으로 벌레를 관찰하여 대부분이 L 4 유충이고 명시야 현미경 검사에서 젊은 성인, L 4 유충은 몸 중앙에 복부 맑은 반점이 있는지 확인합니다. 젊은 성인은 약간 더 크고 명확한 반점이 없을 것입니다.

다음으로, 배양된 지렁이를 멸균된 50ml 튜브로 끌어당깁니다. 후드의 시험관 랙에 튜브를 놓고 발달하지 않은 부화하지 않은 알이나 벌레를 정착시키도록 합니다. 발달된 벌레보다 천천히 정착합니다.

10분 후, 각 펠릿에 약 10ml의 NGM 완충액을 흡인하여 부화하지 않고 발달하지 않은 벌레를 포함하는 supinate를 제거하고 튜브를 부드럽게 소용돌이쳐 벌레를 현탁시킵니다. 모든 벌레를 하나의 50ml 튜브에 모으십시오. 500 RCF의 속도로 스윙 버킷 원심분리기를 30초 동안 돌립니다.

그런 다음 50 %lb의 NGM에 1 %lb의 기생충을 다시 현탁시켜 씻습니다. 이것을 반복하고 세척 후 박테리아를 제거하기 위해 3-4 번 씻으십시오. 튜브에 NGM과 LB 버퍼를 50ml까지 채웁니다.

이것을 교반 막대의 맞춤형 웜 분배 플라스크에 붓고 교반 플레이트에 놓습니다. 최소 약 20 밀리리터 또는 60, 000 웜이 디스펜싱 플라스크 및 디스펜서 카세트의 데드 스페이스를 채우는 데 필요합니다. 앞서 보여진 것처럼 3 개의 5 마이크로 리터 방울에있는 벌레의 수를 세십시오.

NGM에서 LB를 5 마이크로 리터 방울 당 12-15 개의 웜 농도로 계산 한 후 각 3 84 웰 플레이트에는 약 35, 000 개의 웜 또는 11.5 밀리리터의 부유 웜이 필요합니다. 10마이크로리터 디스펜싱 카세트를 디스펜서에 넣고 70% 에탄올로 프라이밍하여 살균합니다. 멸균수로 프라이밍하여 에탄올을 헹굽니다.

디스펜싱 카세트의 끝을 플라스크에 삽입하여 움직임을 방해하지 않고 교반 막대 바로 위에 있도록 합니다. 벌레가 플라스크 전체에 매달려 있는지 확인하십시오. 두 개의 프리 펄스로 저속으로 웜을 분배하도록 디스펜서를 프로그래밍하고 최소 10밀리리터의 부유 웜을 실행합니다.

이미 테스트 화합물이 포함되어 있어야 하는 마이크로타이터 플레이트를 빠르게 채워 웜이 튜브에 침전되는 것을 방지합니다. 여기서 이전에 마이크로타이터 플레이트에 로드된 테스트 컴파운드가 준비되어야 합니다. 빛. 우물에 먼지가 쌓이지 않도록 통기성 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오.

플레이트를 분석에 적합한 온도의 인큐베이터의 진탕 플랫폼에 놓습니다. 공기의 흐름을 제한할 수 있으므로 플레이트를 쌓지 마십시오. 타겟 플레이트를 마이크로플레이트 리더에 배치하여 여기에서 적절한 방출 및 여기 파장으로 각 웰의 형광 강도를 측정합니다.

GFP에 사용되는 필터는 4 85에서 여기(excitation)이고 5 28에서 방출입니다. RFP용 필터는 5 40에서 여기이고 5 90에서 방출입니다. 플레이트를 판독한 후 GFP와 RFP의 비율을 계산하고 활성화 화합물을 포함하지 않는 제어 웰의 판독값으로 정규화하여 개별 처리에서 파생된 형광 강도의 정확한 접힘 차이를 결정합니다.

여기에 표시된 SSKN one 분석은 염색체로 통합된 이중 보고서를 사용하며, 이는 실체 현미경으로 웜을 수동으로 계수할 때의 균주입니다. R 제곱 값이 0.94이고 p 값이 0.0001 미만인 부피와 상관관계가 있는 웜의 수입니다. 이는 각 웰에 분배되는 웜의 수가 분배되는 부피를 조정하여 제어할 수 있음을 나타냅니다.

왼쪽에 표시된 웰당 총 GFP 형광과 오른쪽에 표시된 웰당 RFP 형광은 이 그림에서 3,84웰 플레이트에 걸쳐 웰에서 웰까지 재현성이 높습니다. XS는 각 웰에서 측정된 상대 형광을 나타냅니다. 실선은 평균을 나타내고 파선은 모든 웰의 평균 형광이 9% 미만의 변동 계수를 가짐 위 또는 아래의 3 표준 편차를 나타냅니다.이 그림에서 볼 수 있듯이, GST 4 프로모터로부터의 GFP 형광은 R 제곱 값이 0.62이고 p 값이 0.0001 미만인 3 84 웰에 걸쳐 DOP 3 프로모터로부터의 RFP 형광과 선형 상관 관계가 있습니다.

따라서, non inducible RFP reporter는 inducible을 정규화하는 데 사용될 수 있습니다. GFP 기자. RFP에 대한 GFP의 비율을 표현할 때 형광은 3 84 웰 플레이트에서 웰까지 재현성이 높습니다.

RFP에 대한 GFP의 비율을 계산하면 변동 계수가 6% 미만으로 감소하여 DOP 3 프로모터 RFP 리포터가 변동성을 줄이는 능력을 보여주었습니다. SK N one 활성화 xeno biotic을 사용한 RFP에 대한 GFP의 유도는 3 84 웰 플레이트에서 견고하고 재현성이 높으며, 모든 control well과 due GLO well의 평균 상대 형광 비율은 실선으로 표시됩니다. 제어 평균보다 높은 세 개의 표준 편차와 dlo 평균 아래는 점선으로 표시됩니다.

일단 숙달되면 벌레 배양을 시작하는 것은 첫날에 약 1시간 동안 수행하고 수집 및 분배할 수 있습니다. 웜은 제대로 수행하면 약 2 시간 동안 수행 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 것은 적어도 60, 000 웜으로 시작하고 분배하는 동안 매달려 유지하는 것을 기억하는 것이 중요하지만, 이 절차를 따르는 것은 다른 예를 들어, 다른 유도 가능한 경로에 대한 보고서 문자열을 수행하여 다른 경로에 대한 변조기를 개발하기 위해 수행할 수 있습니다.

이 기술은 고처리량 스크리닝 및 바이오센싱 분야의 연구자들이 소분자 경로 조절제를 신속하게 식별하거나 환경 오염 물질을 검출할 수 있는 길을 열 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 유도 가능한 전사 경로인 경우 고처리량 스크리닝을 위해 형광 엘레간 균주를 배양, 분배 및 측정하는 방법 또는 환경 오염 물질에 대한 여러 샘플을 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.