Name: 형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 배우세요 형광 C. elegans 균주를 대규모 배양하고 분배하여 고처리량 화합물 스크리닝 및 환경 생물감지를 수행하는 방법을. GFP/RFP 이중 리포터를 활용한 정규화 기법으로 유전자 발현 변화를 정량 분석합니다.

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C. 엘레간스 transgenes은 Caenorhabditis 유전학 센터 (미네소타, 미네 아 폴리스 대학, MN)에 의해 제공되었다. 이 작품은 NIH R21 부여 KS로 NS0667678 - 01에 의해 지원되었다. 모든 저자는 수집, 분석 및 데이터 해석에 참가했습니다. CKL, KS 및 KPC는 원고를 작성하고 수정에 참여했습니다.

1. 박테리아 웜 음식 준비 1 일 <ol><li> 포화 E. 5 ML 추가 대장균 박테리아 OP50 문화 500 ML 끝내주는 국물은 50 μg / ML 스트렙토 마이신과 보충 37에 떨고 인큐베이터 (225 RPM) 숙박 성장 ° C. </li></ol> 날 2 <ol start="2"><li> 20 분 동안 2,500 RCF에서 냉장 원심 분리기에서 만 50 ML 튜브 및 원심 분리기 박테리아에 하루 박테리아 문화를 분할. </li><li> LB의 국물에서 가만히 따르다 액체 선충류의 성장 미디어 (NGM)의 10 ML 각 박테리아 펠렛을 resuspend. 박테리아를 resuspend 15 분 동안 바닥 통에 수평으로 흔들어. NGM 버퍼를 만들려면, 1 패 탈이온수 및 압력솥에 3g NaCl를 추가합니다. 55 쿨 ° C 및 주문에 다음 멸균 솔루션을 추가 : 1 M CaCl 2, 1 M MgSO 4 개 중 1 개 ML, 1 M의 칼륨 나트륨, 산도 6.0의 25 ML 1 ML합니다. </li><li> 20 분 동안 2,500 RCF에서 냉장 원심 분리기에 박테리아 문화를 원심 분리기. </li><li> NGM 버퍼에서 가만히 따르다 및 박테리아 펠렛의 무게. </li><li> 산탄, 나누어지는 박테리아 3 ML -20 15 ML 튜브, 그리고 가게에 집중 ° C.를 resuspend하는 NGM 버퍼의 동일한 볼륨 추가 </li></ol> 2. 대규모 C. 엘레간스 액체 문화 우리는 유전자 변형 라인을 사용 VP596 (dvIs19 [pAF15 (GST - 4 : GFP : : NLS)]; vsIs33 [dop - 3 : RFP]) 2 형광 구성 운반 : SKN - 1을 모니터링하는 GFP 14 : Pgst -4를 : 활동 및 Pdop - 3 : RFP 17 웜 번호 정상화를위한 표준으로 제공합니다. 1 일 <ol><li> 150 ML NGM 버퍼, 1.5 ML의 LB의 국물, 5 MG / ML 콜레스테롤 150 μl (에탄올)을, 100 MG / ML 스트렙토 마이신의 75 μl를 섞는다. 혼합 필터 - 소독 및 멸균 1리터 플라스크에 추가할 수 있습니다. 참고 : NGM 버퍼에 1 % LB의 국물을 추가하는 것이 유리하고 plasticware에 고집에서 벌레를 방지하는 데 도움이 있지만,이 금액은 박테리아의 성장을 지원하기 위해 충분하지 않습니다. </li><li> 표준 염소산 절차 18 벌레를 동기화할 수 있습니다. 최대 gravid 웜 0.5 ML에이 염소산 솔루션 5 ML (3.75 ML 멸균 물 1 ML 가정용 표백제, 250 μl 10 N NaOH)과 하나의 15 ML 튜브에서 처리할 수 있습니다. 멸균 물 출시 달걀을 씻고 NGM 버퍼 10 ML 그들을 resuspend. </li><li> 계란 NGM 버퍼 100 배 (예, 10 ML 100 μl)의 샘플을 희석 세 별도 5 μl aliquots에 달걀의 개수를 계산합니다. 여러 200,000 (100 희석 요인이 X 2,000)의 평균 숫자는 계란의 총 수를 측정합니다. </li><li> NGM 버퍼와 술병에 200,000에 2,000,000 계란 추가 20 100 RPM에서 문화를 흔들 ° C. </li></ol> 날 2 <ol start="5"><li> 적어도 16 H 술병에 달걀을 추가한 후, 정지 웜 문화의 약 0.5 ML를 제거하는 살균 serological pipet을 사용합니다. 페트리 접시의 멸균 뚜껑에 Pipet 세 5 μl 방울. 벌레를 마비로 1~2분위한 -20 ° C의 냉장고에서 뚜껑을 놓습니다. 부화 웜의 총 수를 추정 30000 (150 ML / 5 μl) 5 μl를 여러 당 사는 부화 웜의 평균 개수를 계산합니다. </li><li> 냉동 OP50 세균성 문화 (프로토콜 1.6)의 튜브를 해동하고 500,000 부화 웜 당 웜 문화에 50% OP50 3 ML를 추가합니다. 20 100 RPM에서 술병을 흔들어 ° C. 웜이 대략 51 시간 L4 유충 젊은 성인으로 개발할 것입니다. 박테리아의 OD600 처음에 2.200에 대해해야합니다. 흡광도에 의해 박테리아의 양을 모니터링하여 OD 600 이하 0.900에 떨어뜨리면 더 추가합니다. </li></ol> 3. 웜 수집 및 분배 일 사 <ol><li> 표준 NGM의 한천 플레이트에 정지 웜 문화의 약 0.5 ML를 전송하는 살균 serological pipet을 사용합니다. 대부분의 L4 유충이나 젊은 성인되었는지 확인하기 위해 stereomicroscope있는 벌레를 볼 수 있습니다. L4 유충은 신체의 중앙에 복부 분명 자리를합니다. 청소년 약간 크고 분명 자리를 없을 것입니다. </li><li> 무균 50 ML 튜브에 웜 문화를 붓고하고 benchtop에서 테스트 튜브 랙에 튜브를 놓으십시오. 웜은 약 10 분 동안 정착을 허용합니다. 흡인이나 pipetting하여 표면에 뜨는를 제거합니다. 참고 : 그들이 느린보다 L4 유충 젊은 성인을 해결하기 때문에이 단계는 안깐 계란이나 개발하지 않았 웜을 제거하는 것이 중요합니다. </li><li> 1 % LB의 국물 (NGM + LB) 박테리아를 제거하는 3-4 회와 NGM 버퍼와 단일 50 ML 튜브 및 세척에 모든 벌레를 수집합니다. 참고 : 이것은 최고 30 초 500 RCF에서 벌레를 수집하고 신선한 NGM + LB 버퍼로 뜨는을 대체하여 스윙 - 양동이 원심 분리기에서 이루어집니다. </li><li> 세척 후, 50 ML에 + NGM와 LB 버퍼를 튜브를 작성 및 사용자 정의 벌레 분배 플라스크에 붓는다. 작은 저어 표시줄을 추가하고 벌레가 정지 계속 저어. 일 카운트세 5 μl 방울의 벌레의 전자 번호는 위에서 지적했다. 당신이 5 μl 드롭 (~ 2.5-3.0 웜 / μl) 당 12-15 벌레를 얻을 때까지 NGM + LB로 희석. 참고 : 20 ML (60,000 웜)의 최소 분배 술병과 디스펜서 카세트 죽음의 공간을 채우기 위해 필요합니다. 각 384 잘 플레이트는 약 35,000 웜 또는 중지 웜의 11.5 ML이 필요합니다. </li><li> 10 μl 분배 카세트를로드하고 70 % 에탄올과 프라이밍하여 소독. 멸균 물을 마중물하여 에탄올을 씻어. </li><li> 단지 그 움직임을 방해하지 않고 교도소 표시줄 위에 있도록 술병에 분배 카세트의 끝에 삽입합니다. 벌레가 전체 술병에 걸쳐 중단 남아 있는지 확인합니다. 프로그램 디스펜서 2 사전 펄스 낮은 속도로 분배합니다. 프라임 및 정지 웜 중 적어도 10 ML을 실행합니다. 튜브에 정착에서 벌레를 방지하기 위해 신속하게 필요한 번호판을 입력합니다. </li><li> 숨 테이프로 번호판을 밀봉합니다. </li><li> 귀하의 분석에 적합한 온도 인큐베이터에서 흔들림 플랫폼에서 접시를 놓습니다. 접시를 쌓아하지 마십시오. </li></ol> 4. 형광 분석 <ol><li> 적절한 방출 및 여기 파장 (; RFP 540/25ex 590/35em GFP 485/20ex 528/20em 우리의 분석을위한 필터)와 각 우물의 형광 강도를 측정하기위한 microplate 판독기에 대상 접시를 놓습니다. </li><li> GFP / RFP의 비율을 계산하고 개별 치료에서 파생 형광 강도의 정확한 배 차이를 결정하는 제어 우물 (활성화 화합물 제외)의 수치로 정상화. </li></ol> 5. 대표 결과 : 우리 SKN - 1 검정은 chromosomally 통합 듀얼 기자 변형 (VP596)를 사용합니다. 그림 1에서와 같이, 웜의 숫자가 잘 적절 볼륨에 상관 있습니다. 뿐만 아니라 당 그림 2A와 2B, 총 GFP 및 RFP 형광을 표시하는 것은 우물에서 384 잘 접시에 잘 걸쳐 매우 재현할 수 있습니다. 384 우물에 걸쳐 RFP : GFP 형광은 선형 Pdop - 3 상호는 :으로 취소 유발 Pgst - 4 그림 2C에 표시됩니다. : 다양성을 줄이기 위해 RFP 기자 : GFP / RFP의 비율로 표현하면, 형광은 Pdop - 3의 능력을 보여주는 384 잘 접시 (2A에 2D 그림에서 변이 계수를 비교)에 걸쳐 우물에서 잘 고도로 재현할됩니다. 그림 3과 RFP에 GFP의 상대의 유도에 표시된 SKN - 1 생체 이물 활성화가 (38 μm의 juglone) 강력하고 384 잘 접시에 걸쳐 고도로 재현할 수있다. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 볼륨 대 벌레 수시키지. 웜 약 2/μl로 희석하고 stereomicroscope와 함께 수동으로 계산을위한 24 잘 접시에 적절했다. N 볼륨 당 = 8 웰스. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 384 잘 접시에 적절 웜 총 형광 다시 재현할 수 있습니다. 웜가 약 2.5/μl 30 μl에 희석되었습니다 것은 384 자 판 매 자로 적절했다. 모든 웰스의 GFP (A)와 RFP (B) 형광 9 % 이하의 유사 계수를했다. (C) GFP 형광은 매우 RFP 형광을 서로 관련됩니다. (D) RFP에 GFP의 비율을 계산하면 6% 아래 편차의 계수를 감소 (A, B, 및 D) 고체 라인 수단을 표시하고 깨진 라인이 3 개의 표준 편차 평균 위 또는 아래를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> . Pgst - 4 그림 3 활성화 : GFP는 강력하고 일관성이다. 약 75 L4 벌레가 384 잘 접시와 38 μm의의 juglone의 모든 우물에 적절했다하는 것은 다른 모든 항목에 추가되었습니다. GFP 및 RFP 형광은 부화 21 H 후에 측정되었다. 말은 상대 형광 모든 컨트롤의 비율 (1.0)와 juglone 웰스 (8.9)은 고체 라인으로 표시됩니다. 컨트롤 위에 3 개의 표준 편차 뜻과 의미 juglone 아래 깨진 라인으로 표시됩니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 culturing위한 방법을 제시하고 유전자 변형 nematodes 많은 숫자를 분배. culturing 벌레에 사용되는 장비는 분자 복제를 수행 실험실을위한 표준이며, 액체 처리 및 형광 장비 microplates 많은 숫자를 처리 실험실에 대한 표준입니다. 라이브 C. 다수의 분배의 다른 방법 엘레간스 장비 19 정렬 비싼 입자가 필요합니다. Pgst - 4 : GFP 분석은 뚜껑 &#39;N&#39;칼라 전사 요소의 작은 분자 변조기를위한 화면으로, 환경 및 식품 시료 14,16의 생체 이물 및 산화제 오염 물질을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 강력한 inducible 유전자 변형 GFP 기자는 경로 및 환경 자극 4 넓은 범위에서 사용할 수 있으며, 따라서 우리의 방법은 여러 경로의 개발 모듈 레이터에 적용되어야하며 오염 물질의 광범위한 스펙트럼을 감지합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> LB의 수프 </td><td> 연구 제품 국제 주식 회사 </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> 끝내주는 국물 </td><td> 연구 제품 국제 주식 회사 </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> 시너지 ™ HT 멀티 모드 Microplate Reader를 </td><td> BioTek </td><td></td><td> 필터 : GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo 선택 디스펜서 </td><td> BioTek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 웜 분배 플라스크 </td><td> 남부 과학 주식 회사, 미캐노피, FL </td><td></td><td> 사용자는 (352) 284-2531를 조립 </td></tr><tr><td> 384 microplates </td><td> 그라 이너 바이오 원 </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> 통풍 씰링 테이프 </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5 - 히드록시 - P - naphthoqinone) Juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone은 DMSO에 녹아있다 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D - 5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. 엘레간스 형질 변형 </td><td> 저자의 연구실 </td><td> VP596 </td><td> Pgst - 4 : GFP 및 Pdop - 3 : RFP </td></tr></tbody></table>

형광등과 높은 처리량 검사 및 biosensing c. 엘레간스 레인스

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

하이 스루풋 스크리닝 (HTS)은 생물 학적 과정의 화학 변조기를 식별에 대한 강력한 접근 방식이다. 그러나, 세포 배양 모델을 사용하여 화면에서 확인된 많은 화합물은 종종 생체내 1-2에 독성이나 pharmacologically 비활성으로 볼 수 있습니다. 전체 동물 모델에서 상영하는 것은 이러한 함정을 피하는데 도움이 및 약물 개발에 대한 경로를 합리화 수 있습니다. C. 엘레간스 잘 HTS 적합 다세포 모델 생물이다. 그것은 작은 (&lt;1mm)과 경제적 교양과 액체에 적절하게 사용하실 수 있습니다. C.가 엘레간스 또한 약물 모드의 액션 3 신속하고 상세한 신분증을 허용 가장 실험적으로 다루기 쉬운 동물 모델 중 하나입니다. 우리는 culturing에 대한 프로토콜을 설명하고 C의 형광 변종을 분배 화학 라이브러리 또는 특정 유전자의 표현을 변경할 환경 오염 물질의 검출에 높은 처리량 검사 엘레간스. 발달 동기 웜의 큰 번호, 액체 문화에 재배 수확, 씻어, 그리고 정의 밀도에서 중단됩니다. 웜는 다음 연동 액체 디스펜서를 사용하여 검정, 평평한 바닥 384 잘 접시에 추가됩니다. 화학 라이브러리 또는 테스트 샘플 (예, 물, 음식, 또는 토양)에서 작은 분자는 벌레와 우물에 추가할 수 있습니다. 생체내에서 실시간 형광 강도가 형광 microplate 판독기로 측정됩니다. 이 방법은 C.에 inducible 유전자에 적용할 수 있습니다 적당한 기자 사용할 수있는 엘레간스. 많은 inducible의 스트레스와 발달 transcriptional 경로는 잘 C.에 정의되어 있습니다 엘레간스와 GFP 유전자 변형 기자의 종자는 이미 4 많은 존재합니다. 적절한 형질 기자와 함께하면, 우리의 방법은 경로의 모듈 레이터를위한 화면이나 환경 오염에 대한 강력한 바이오 센서 assays을 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 C를 증명 엘레간스 문화와 분배 프로토콜은 HTS 분석과 함께 우리는 C를 모니터하기 위해 개발된 엘레간스 모자 &#39;N&#39;칼라 전사 인자 SKN - 1. SKN - 1과 포유류의 homologue의 Nrf2 5-10 산화 스트레스와 생체 이물 중 cytoprotective 유전자를 활성화해야합니다. Nrf2는 암, neurodegeneration, 그리고 만성 염증과 같은 다양한 연령과 관련된 질환에서 포유류를 보호하고 주요 chemotherapeutic 대상 11-13되고있다. 우리의 분석은 -4 SKN - 1 대상 유전자 GST 14 GFP 유전자 변형 기자를 기반으로, 이것은 글루타티온 - S transferase 6 인코딩합니다. GST -4 기자도 SKN - 1을 활성화 및 아크릴 아미드와 메틸 수은과 같은 오염 물질의 15-16 낮은 수준을 감지하는 데 사용할 수있는 생체 이물 및 산화 화학 바이오 센서이다.

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한 절차<em&gt; C. 엘레간스</em형광 기자 단백질을 표현&gt; 종자는 고가의 정렬 장비를 필요로하지 않는다는 설명이다. 이 접근법은 많은 inducible에 적용할 수 있습니다<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; 오염 물질의 약물 발견을위한 유전자 또는 biosensing.

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

고처리량 스크리닝(High-throughput screening, HTS)은 생물학적 과정의 화학적 조절제를 식별하는 강력한 방법입니다. 하지만 ...에서 식별된 많은 화합물은...

이 영상에서는 특정 단백질 활성에 미치는 화학적 또는 환경적 요인의 영향을 평가하기 위해, 화학 라이브러리의 고처리량 스크리닝이나 환경 오염 물질 검출에 사용되는 형광 CL gans 균주의 배양 및 분주 방법을 보여줍니다. CL elgan의 경우, 먼저 웜의 먹이로 사용할 박테리아 배양물을 준비하고 GFP 형질전환된 동기화된 웜을 배양합니다.그 후 0.5~2백만 마리의 벌레를 수집하여 세척하고 3개의 84-well 마이크로타이터 플레이트에 분주한 다음, 화학 라이브러리의 소분자 또는 물, 식품, 토양과 같은 테스트 시료를 벌레에 첨가합니다. 마지막으로 마이크로플레이트 리더를 사용하여 벌레의 형광을 측정합니다.형광 강도의 데이터 분석을 통해 유도성 전사 경로를 조절하거나 환경 오염 물질의 검출을 가능하게 하는 소분자를 찾아낼 수 있습니다. in vitro 및 세포 배양 기반 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 in vivo에서 독성이 있거나 비활성 상태인 화합물에 시간을 낭비하지 않는다는 점입니다. 이러한 고처리량 방법은 다양한 유도성 경로를 조절하는 소분자를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.본 연구진은 소분자 라이브러리의 고처리량 스크리닝을 위해 이 방법을 개발하였으나, 식품 및 환경 시료 내 오염 물질의 바이오센싱에도 적용할 수 있습니다. 실험 절차의 시연은 본 연구실의 기술원인 Andrew Dine과 박사후 연구원인 Q long이 담당합니다. 박테리아 웜 푸드를 미리 준비하십시오.50 µg/mL의 streptomycin이 첨가된 500 mL의 terrific broth에 5 mL의 포화된 e coli OP 50을 접종하는 것으로 시작합니다. 배양액을 쉐이커에 넣고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 배양액을 50 mL 튜브 10개에 나누어 담습니다. 그런 다음 튜브를 냉장 원심분리기에 넣고 2,500 RCF에서 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 각 박테리아 펠릿을 10 mL의 액체 선충 성장 배지 또는 NGM에 재현탁합니다.현탁액을 수평으로 흔들어 줍니다. 바닥 진탕기를 사용하여 15분 동안 세균을 재현탁시키십시오. 다음으로, 세균 배양액을 4°C에서 2,500 RCF로 20분 동안 원심분리합니다.NGM을 따라내고 박테리아 펠렛의 무게를 측정합니다. 그 후 동일한 부피의 NGM 버퍼를 추가하고 볼텍싱하여 펠렛을 재현탁합니다. 마지막으로, 재현탁된 박테리아 배양액 3 mL를 15 mL 튜브에 분주하고 필요할 때까지 -20 °C에서 보관합니다.본 시연에서는 스트레스를 유도하는 Xeno Duke loan이 전사 인자인 Sskn one에 미치는 영향을 예시로 측정합니다. Sskn one은 산화 및 제노스(xenobi) 스트레스 상황에서 세포 보호 유전자를 활성화하는 것으로 알려져 있습니다. 두 개의 형광 컨스트럭트를 보유한 Trenchgenic c gans 라인 VP 5 96의 대량 배양액을 준비합니다.VP 5 96 벌레는 전사 인자의 활성을 모니터링하는 데 사용되는 GFP를 발현시키는 GST four 프로모터와, 벌레 수의 정규화를 위한 표준으로 사용되는 RFP를 발현시키는 Sskn one 및 DOP three 프로모터를 모두 발현합니다.DOP three는 도파민 수용체의 프로모터이며 신체 전반의 뉴런에서 구성적으로 발현됩니다. 예시에서 xenobi lon이 sskn one을 강력하게 활성화하고 GS T four 프로모터로부터 발현되는 GFP의 양을 증가시킨다는 점을 고려하여, 배양 준비를 위해 150 milliliters의 N NGM 완충액, 1.5 milliliters의 LB, 150 microliters의 1 molar 콜레스테롤 및 75 microliters의 100 milligrams per milliliter Streptomycin을 혼합하며 시작합니다. LB를 첨가하면 벌레가 유리 기구 및 플라스틱 기구에 달라붙는 것을 방지하는 데 도움이 되지만, 이 양으로는 박테리아의 성장을 지원하기에 충분하지 않습니다.혼합물을 여과하여 멸균한 후, 멸균된 1 L 플라스크로 옮기고 GR 성체 웜에서 알이 배출될 수 있도록 플라스크를 그대로 둡니다. 웜을 원심 분리하고 상층액이 투명해질 때까지 NGM 배지를 교체하여 웜으로부터 박테리아를 세척합니다. 웜을 멸균수에 다시 현탁하여 원심 분리한 후, 한 번 더 세척합니다.상층액을 제거하고 튜브에 3.75 milliliters의 멸균수를 채웁니다. 가정용 표백제 1 milliliter와 10 normal 수산화나트륨 250 microliters를 넣고 즉시 5~6회 도립 혼합합니다. 벌레들이 표백제에 4분 동안 노출된 후, 튜브를 로테이터에 놓습니다.튜브를 실체 현미경 아래에 둡니다. 대부분의 성충은 용해되어 있어야 합니다. 튜브를 15~20회 강하게 흔들어 남은 성충들의 용해를 돕습니다. 총 5분 동안 용해가 진행된 후, 튜브가 가득 찰 때까지 멸균수를 추가합니다.알을 수집하기 위해 5~6회 정도 전도 혼합합니다. 튜브를 500 RCF에서 1분 동안 원심분리합니다. 10 mL의 멸균수에 현탁하고 원심분리 후 상층액을 제거하는 방식으로 알을 3회 세척합니다.다음으로, 100 µL의 알 샘플에 10 mL의 NGM 완충액을 첨가하여 100배 희석합니다. 그런 다음, 현미경 하에서 페트리 접시 뚜껑 위에 5 µL씩 세 번 분주합니다. 세 개의 별도 5 µL 분주액에 포함된 알의 수를 측정합니다.전체 알의 수를 추정하기 위해, NGM 버퍼가 담긴 플라스크에 200,000개에서 200만 개의 알을 넣고 20°C에서 100 RPM으로 배양액을 흔들어 줍니다. 알을 플라스크에 넣은 후 최소 16시간이 지나면, 멸균된 세롤로지컬 피펫을 사용하여 현탁된 벌레 배양액 약 0.5 mL를 취합니다.멸균된 페트리 접시 뚜껑 위에 5 µL 드롭을 세 번 피펫팅합니다. 벌레를 마비시키기 위해 뚜껑을 -20 °C 냉동고에 1~2분 동안 둡니다. 벌레가 마비되면 입체 현미경을 사용하여 5 µL당 부화한 살아있는 벌레의 평균 수를 세어 전체 수를 추정합니다.이전에 준비한 냉동 OP 50 박테리아 배양액을 벤치 위에 몇 분간 두어 해동합니다. 그런 다음 부화한 벌레 500, 000마리당 50% OP 50 3 mL를 첨가합니다. 플라스크를 20 °C에서 100 RPM으로 흔들어 줍니다.웜은 약 51시간 후에 L4 유충 및 청년 성체 단계로 발달합니다. 배양 기간 동안 육안 검사를 통해 박테리아 양을 모니터링하십시오. 배지가 투명해지면 박테리아를 더 추가하십시오.멸균된 혈청 피펫을 사용하여 현탁된 벌레 배양액 약 0.5 milliliters를 표준 NGM 한천 배지에 옮깁니다. 실체 현미경으로 벌레를 관찰하여 대부분이 L4 유충 및 어린 성충인지 확인합니다. 명시야 현미경 하에서 L4 유충은 몸 중앙의 복부에 투명한 점이 보입니다. 어린 성충은 크기가 약간 더 크며 투명한 점이 없습니다.다음으로, 벌레 배양액을 멸균된 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 튜브를 후드 내 시험관 랙에 놓고 부화하지 않은 알이나 발달하지 않은 벌레들이 가라앉도록 둡니다. 이들은 발달한 벌레보다 더 천천히 가라앉습니다.10분 후, 부상액에 포함된 부화하지 않았거나 발달되지 않은 벌레들을 흡입 제거하고, 각 펠릿에 약 10 milliliters의 NGM buffer를 가한 뒤 튜브를 부드럽게 돌려 벌레들을 현탁시킵니다. 모든 벌레를 하나의 50 milliliter 튜브에 모읍니다. 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 500 RCF에서 30초 동안 원심분리합니다.그 후 벌레를 1% LB가 함유된 NGM 50 milliliters에 다시 현탁하여 세척합니다. 세척 후 박테리아를 제거하기 위해 이 과정을 3~4회 반복합니다. 튜브에 LB 버퍼가 포함된 NGM을 50 milliliters까지 채웁니다.이를 마그네틱 바가 들어있는 맞춤형 벌레 분주 플라스크에 붓고 교반기에 올립니다. 분주 플라스크와 분주 카세트의 데드 스페이스를 채우기 위해서는 최소 약 20 milliliters 또는 60,000마리의 벌레가 필요합니다. 이전에 설명한 대로 5 µL 방울 세 개의 벌레 수를 측정합니다.5 µL 방울당 12~15마리의 농도가 되도록 NGM 및 LB에서 계수한 후, 84-웰 플레이트 한 장당 약 35,000마리의 벌레 또는 11.5 mL의 벌레 현탁액이 필요합니다. 10 µL 분주 카세트를 분주기에 장착하고 70% ethanol로 프라이밍하여 멸균합니다. 멸균수로 프라이밍하여 ethanol을 헹구어 냅니다.분주 카세트의 끝부분을 플라스크에 넣어 교반자의 움직임을 방해하지 않으면서 바로 위에 위치하도록 합니다. 벌레들이 플라스크 전체에 계속 부유 상태로 유지되는지 확인하십시오. 분주기를 낮은 속도로 분주하도록 설정하고, 두 번의 프리 펄스 프라임(pre pulses prime) 후 최소 10 milliliters의 부유 벌레를 분주하도록 설정하십시오.벌레가 튜브 내에 가라앉는 것을 방지하기 위해, 테스트 화합물이 이미 들어 있는 마이크로타이터 플레이트를 빠르게 채웁니다. 이때 이전에 마이크로타이터 플레이트에 로딩한 테스트 화합물이 필요합니다. 플레이트를 통기성 테이프로 밀봉하여 웰에 먼지가 쌓이는 것을 방지합니다.분석에 적합한 온도로 설정된 인큐베이터 내의 쉐이킹 플랫폼 위에 플레이트를 놓습니다. 공기 흐름이 제한될 수 있으므로 플레이트를 겹쳐 쌓지 마십시오. 대상 플레이트를 마이크로플레이트 리더에 넣고, 여기에 적절한 방출 및 들뜸 파장을 사용하여 각 웰의 형광 강도를 측정합니다.GFP에 사용되는 필터는 들뜸 파장 485 nm 및 방출 파장 528 nm입니다. RFP에 사용되는 필터는 들뜸 파장 540 nm 및 방출 파장 590 nm입니다. 플레이트를 판독한 후, GFP와 RFP의 비율을 계산하고 활성 화합물이 포함되지 않은 대조군 웰의 판독값으로 정규화하여 각 처리군에서 유래한 형광 강도의 정확한 배수 차이를 결정합니다.여기에서 보여주는 SSKN one 분석법은 염색체 통합 듀얼 리포터를 사용하며, 스테레오 현미경으로 벌레의 수를 수동으로 측정하였습니다. 벌레의 수는 분주된 부피와 R 제곱 값 0.94 및 p 값 0.0001 미만으로 상관관계가 있었습니다. 이는 각 웰에 분주되는 벌레의 수를 분주 부피를 조절함으로써 제어할 수 있음을 나타냅니다.이 그림들에서 384웰 플레이트 전체의 웰 간 GFP 형광 총합(왼쪽)과 RFP 형광 총합(오른쪽)은 재현성이 매우 높게 나타납니다. X축은 각 웰에서 측정된 상대 형광값을 나타냅니다. 실선은 평균값을, 점선은 모든 웰의 평균 형광값에서 상하 3표준편차 범위를 나타내며, 변동 계수는 9% 미만이었습니다. 이 그림에 나타난 바와 같이, 384개 웰 전체에서 GST4 프로모터의 GFP 형광은 DOP3 프로모터의 RFP 형광과 선형 상관관계를 보이며, R² 값은 0.62, p값은 0.0001 미만입니다.따라서, 비유도성 RFP 리포터를 사용하여 유도성 GFP 리포터를 표준화할 수 있습니다. 이렇게 하면 384-웰 플레이트의 웰 간 GFP 대 RFP 형광 비율이 매우 높은 재현성을 갖게 됩니다.GFP와 RFP의 비율을 계산하면 변동 계수가 6% 미만으로 감소하여, 여기에서 보여주는 것과 같이 DOP three promoter RFP 리포터가 변동성을 줄일 수 있는 능력이 있음이 입증되었습니다. SK N one 활성 제노바이오틱(xenobiotic)에 의한 RFP 대비 GFP의 유도는 384-웰 플레이트 전반에 걸쳐 강력하고 재현성이 매우 높으며, 모든 대조군 및 due GLO 웰의 평균 상대 형광 비율은 실선으로 표시되어 있습니다. 대조군 평균의 +3 표준 편차와 dlo 평균의 -3 표준 편차는 점선으로 표시되어 있습니다.일단 숙달되면, 웜 배양 시작은 1일 차에 약 1시간 정도 소요되며, 웜 수집 및 분배는 적절히 수행할 경우 약 2시간 정도 소요될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 최소 60,000마리의 웜으로 시작하고 분배하는 동안 웜이 부유 상태를 유지하도록 하는 것이 중요합니다. 본 절차에 따라 스크리닝을 진행하면, 예를 들어 다른 유도 경로에 대한 리포터 스트링(report strings) 분석을 수행하여 개발 이후 다른 경로의 조절제를 개발할 수 있습니다.이 기술은 고속 스크리닝 및 바이오센싱 분야의 연구자들이 소분자 경로 조절제를 신속하게 식별하거나 환경 오염 물질을 검출하는 길을 열어줄 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 유도 가능한 전사 경로의 고속 스크리닝을 위해 형광 *E. coli* 균주를 배양, 분주 및 측정하는 방법이나 환경 오염 물질 검출을 위해 여러 샘플을 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을...

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

우리가 사용하는 프로토콜을...

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans</em

출처: Anderson, Q. L. et al. 고처리량, 고함량, 액체 기반 C. elegans 병리 시스템. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 숙주-병원체 상호 작용 중 유전자 녹다운을 연구하기 위해 Caenorhabditis elegans 를 사용하는 고처리량 스크리닝 방법을 보여줍니다. 녹다운 웜을 준비하고 이를 분석 플레이트로 옮겨 병원체 유발 웜 사멸의 효과를 평가하는 절차를 간략하게 설명합니다.

C. elegans 녹다운 스크리닝을 위한 멀티웰 액체 기반 분석

출처: 알리, I. 외. 세골부리아티 스 엘레간 스 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 장내 세균이 Caenorhabditis elegans 에서 스트레스 회복력에 미치는 영향을 평가하는 고처리량 형광 검사를 시연합니다. 파열된 장 과립에서 나오는 청색 형광을 추적함으로써, 검사 박테리아에 노출된 벌레의 초기 사망 신호를 밝혀냅니다.

미생물-벌레 상호작용을 연구하기 위한 고처리량 형광 분석법

정량의 화학 주성 반응을 평가하는...

C. elegans의 주 화성 분석

모델 유기체인 Caenorhabditis elegans에서 미토콘드리아 억제제의 효과를 생체 내에서 검출하고 잠재적인 강화 화합물을 식별하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 미토콘드리아 기능을 조절하는 화합물에 대한 약물 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

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여기 우리는 적응, 전체 호스트, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 고 신약 사용을 활용할 수 있는 도구를 높은 콘텐츠 심사 하는 프로토콜을 설명 합니다.

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장내 미생물은 특정 또는 보존 메커니즘을 통해 숙주의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. Caenorhabditis elegans 는 그러한 미생물을 스크리닝하는 편리한 플랫폼입니다. 본 프로토콜은 웜 건강의 대용으로 사용되는 선충 스트레스 저항성에 미치는 영향에 대한 48개의 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

여기에서는 ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어에서 후속 사용을 위해 광시야 현미경 이미지에서 개별 웜의 자동 분할을 위해 개발한 딥 러닝 시스템인 SegElegans를 효과적으로 활용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 온라인과 오프라인 모두에서 시스템을 사용할 수 있는 방법을 제공합니다.

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