설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

본 절차의 전반적인 목적은 쥐 또는 사람으로부터 비강 후각 줄기세포를 분리하여 분자적 이상을 확인하거나 병리적 또는 외상을 입은 뇌를 복구하는 것입니다. 이는 먼저 비강에서 후각 점막 생검을 외과적으로 수집함으로써 수행됩니다. 다음으로, 하부 고유층(lamina propria)에 있는 외배엽 중간엽 줄기세포에 집중하기 위해 후각 상피와 그 상피 줄기세포를 제거한 후, 설치류 조직을 해리하거나 유리 커버슬립 아래에서 배양된 인간 이식물로부터 유출 세포를 수집하여 해당 세포들을 분리합니다.

절차의 마지막 단계는 줄기세포 구체를 배양하여 뉴런 유사 세포로의 분화를 유도하는 것입니다. 최종적으로 비점막 전체를 분리하여 개별화된 줄기세포를 얻습니다. 부유 구체 또는 뉴런 유사 세포는 뇌 질환의 분자 마커를 식별하거나 신경계의 손상을 회복시키는 데 사용될 수 있습니다.

본 연구에서는 후각 점막으로부터 인간 및 설치류의 비강 줄기세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 줄기세포가 신경 조직에 속하며, 모든 살아있는 개체에서 쉽게 접근 가능하며, 병리학적 뇌의 진단 또는 치료에 사용될 수 있다는 점입니다. 저는 이비인후과 외과 의사로서 수많은 임상 연구를 위해 수백 건의 비강 생검을 수행해 왔습니다.

이 절차는 안전하며 수행 가능합니다. 그리고 국소 전신 마취를 시행합니다. 저는 인간 또는 rod, 비강 또는 factor 줄기세포 배양 분야의 전문성을 갖춘 주니어 과학자입니다.

이는 높은 증식률과 신경 세포 유형으로 분화하려는 경향을 보입니다. 이들은 건망증 및 퇴행성 질환의 동물 모델에서 효율적인 것으로 입증되었습니다. 점막을 채취하기 전, 깨끗한 배양 후드 내에 DMEM Ham, F 12 배양액이 준비된 35 millimeter 페트리 접시 3개를 준비합니다.

이제 발가락 꼬집기로 쥐가 sodium pentobarbital에 의해 깊은 마취 상태에 들어갔음을 확인한 후, 경추 탈구법(decapitation)으로 안락사시킵니다. 머리를 분리하고 피부를 제거합니다. 가위로 하악골을 제거하고, 핀셋을 사용하여 절치 뒷부분부터 시작하여 양측의 안면 근육을 제거합니다.

Ron Jur를 사용하여 비강을 덮고 있는 뼈를 한쪽씩 제거합니다. 코 뒷부분에 주황색 또는 갈색 장기로 보이는 후각 비갑개가 나타나면, 포셉을 사용하여 비갑개를 조심스럽게 제거합니다.

26 gauge 바늘을 사용하여 수직판의 호, cribriform plate, 그리고 비강 천장을 따라 조직을 세 개의 선으로 절개함으로써 비중격에 위치한 후각 점막을 분리합니다. 양측에서 생검 조직을 채취하여 A-D-M-E-M ham F 12가 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. 이 과정은 안락사 시작 후 10분 이내에 완료되어야 합니다.

이제 점액을 제거하기 위해, 관련 지역 윤리 위원회의 지침에 따라 생검 조직을 배지가 채워진 페트리 접시에 두 번 옮겨줍니다. 이 절차는 이비인후과 전문의가 수행해야 하며, 모든 외래 환자는 0도 또는 30도 경성 내시경을 사용하기 전 고지된 동의서에 서명해야 합니다. 양쪽 비강을 검사하여 폴립 또는 염증성 병변의 존재 여부를 평가합니다.

비중격 만곡을 고려하여 최적의 비강을 선택합니다. 면봉을 사용하여 에피네프린이 함유된 리도카인과 같은 국소 마취제를 도포하고 10분 동안 충분히 침투시킵니다. 에트모이드 포셉(Ethmoid forceps)을 사용하여 중비갑개의 내측 기저부 또는 비중격의 등쪽 내측 부위에서 2mm² 크기의 생검 조직을 채취합니다.

여기서는 뿌리 영역의 생검 조직을 보여드립니다. 이후 후각 생검 조직을 멸균 바늘을 사용하여 1 mL의 DMEM hem F 12가 채워진 멸균 2 mL 튜브로 옮깁니다. 튜브를 거꾸로 기울여 생검 조직이 배양액에 완전히 잠겼는지 확인하십시오.

튜브를 냉장 컨테이너에 넣고 연구 실험실로 운반합니다. 이 단계에서 생검 조직은 특정 뇌 질환에 초점을 맞춘 비교 분자 연구에 그대로 사용하거나, 줄기세포 생성을 위해 처리할 수 있습니다. 인간 또는 쥐의 생검 조직을 세척하고 DMEM ham F 12로 헹군 뒤, 1 mL의 페이스트가 채워진 페트리 접시에서 생검 조직을 배양합니다.

37 °C에서 1시간 동안 두 용액으로 처리합니다. 다음으로, 굴절된 반전광이 있는 해부 현미경 하에서 마이크로 스패출러를 사용하여 하부의 고유층(lamina propria)으로부터 인간 또는 쥐의 후각 상피를 제거합니다. 후각 상피는 검은색 배경에서 반투명하게 보이며, 흰색 배경에서 줄무늬가 있는 오렌지색 갈색으로 보이는 고유층과 대조됩니다.

정제 후 상피는 회색으로 보이고 고유층(lamina propria)은 갈색으로 보입니다. 고유층을 DMEM/F-12로 채운 페트리 접시에 옮깁니다. 조직이 설치류에서 유래한 경우, 25게이지 바늘 2개를 사용하여 고유층을 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음, 조직을 해리시키기 위해 멸균 플라스틱 피펫을 사용하여 해당 조각들을 collagenase 1A 1 mL가 담긴 15 mL 튜브로 옮깁니다.

그 다음 튜브를 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 해리를 중단하려면 튜브를 부드럽게 흔들어 calcium-free 및 magnesium-free PBS 수 mL를 첨가하고 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠렛을 배양액에 재현탁하여 플라스틱 배양 접시에 접종합니다.

이제 조직이 인간의 조직인 경우, 레몬을 적절하게 3~4조각으로 자릅니다. 각 조각을 4-웰 플레이트의 직경 2 cm 웰에 하나씩 넣고, 조직을 멸균된 직경 1.3 cm 유리 커버슬립으로 덮습니다.

그 다음 두 조직 유형 모두에 대해 각 배양 접시에 500 µL의 배양액을 추가합니다. 2~3일마다 배양액을 교체해 줍니다. 5~7일 동안 배양하면 줄기세포가 배양 접시로 침습하기 시작합니다.

그리고 2주 후에 세포들이 합류(confluent)되어야 합니다. 합류 상태에 도달하면, 세포를 계대 배양하여 배양 플라스크로 옮겨 줄기세포 구체(stem cell spheres)를 생성합니다.

이틀마다 전처리된 플라스크에 $\text{cm}^2$당 16,000 cells의 밀도로 세포를 재배양하십시오. $\text{cm}^2$당 0.2 milliliters의 보충 배지를 세포에 공급하십시오. 2~5일 후, 부유하는 세포 구체를 수집하여 이식 전 재배양하거나 분해하십시오.

후각 줄기세포를 신경세포 유사 세포로 분화시키기 위한 세포 치료 동물 모델입니다. B 27, 페니실린, 스트렙토마이신, 글루타민 및 글루탐산이 포함된 neuro basal 배지에서 세포를 21일 동안 배양하며, 3일마다 배지를 교체합니다. 신경세포 유사 세포는 플레이팅 후 5~7일이 지난 시점부터 2~3주 후에 나타나기 시작합니다.

인간 비강 후각 줄기세포가 조직편(explan)에서 성장하여 빠르게 증식하였습니다. 1~2주 이내에 충분한 합류도(confluency)에 도달할 수 있었습니다. 줄기세포의 주요 특징인 둥지 형성(nesting) 및 발현은 EGF와 FGF2가 첨가된 무혈청 배양액을 사용하여 폴리라이신(polylysine) 상에서 배양했을 때 평가되었습니다. 후각 줄기세포는 구형체(spheres)를 형성하였으며, 이 구형체들을 혈청 함유 배양액에 도말했을 때 다시 성장하였습니다.

배지에서, 이들은 약 50%의 GFAP 발현 세포, 최대 15%의 tubulin 발현 세포, 그리고 최대 5%의 oligo four 발현 세포를 포함하는 세포 집단을 형성했습니다. 구체(sphere) 유래 세포를 첨가물이 포함된 neuro basal 배양 배지에서 배양했을 때, 집단의 대부분은 beta three tubulin을 발현하는 뉴런 유사 세포가 되었습니다. 동일한 뉴런 유사 세포들은 map two 또한 발현했습니다.

따라서 줄기세포의 운명을 한 학기 내에 변경할 수 있었습니다. 이 기술을 통해 4주 이내에 수백만 개의 줄기세포를 쉽게 생성하고 보존할 수 있으며, 이를 통해 임상의가 향후 자가 세포 이식을 수행할 수 있습니다. 비강 내 난치성 생검은 바이오마커 및 뇌 질환을 식별하는 데 매우 유용합니다.

최근 저희는 자폐증의 새로운 후보 유전자를 발견하는 데 성공했습니다. 저희는 이미 자폐증 환자와 대조군 개인으로부터 유래한 후각 줄기세포 뱅크를 구축했으며, 이는 다른 인간 뇌 질환으로 확대 적용될 수 있습니다.