Name: 설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 배우세요 설치류 및 인간의 후각 점막에서 다능성 성체 줄기 세포를 분리하는 방법을. 이 기술은 신경 질환의 분자 표지자를 식별하고 손상된 뇌를 복구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 재정적으로 ANR (회사 직원 nationale 드 라 물리), AFM (협회 프헝쎄스 contre 레 Myopathies), 파카와 가야해에서 페더 (인스티투트 데 물리 쉬르 라 Moelle épinière 동부 표준시 난 Encéphale)에 의해 지원되었다. 우리는 기꺼이 시간 경과 기록하는 동안 그녀의 효율적인 도움 마리 피에르 블랜차드 (진 로체 연구소)를 주셔서 감사합니다.

1. 쥐에 강한 점막 수집 <ol><li> 깨끗한 문화 모자 DMEM / 햄 F12 배지로 가득 세 35mm 페트리 요리를 준비하여 시작합니다. </li><li> 안락사의 방법은 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 사전 승인 및 자격을 갖춘 직원에 의해 수행되어야합니다. 쥐의 이러한 마취제 / xylazine으로 마취의 나트륨 pentobarbital 또는 기타 주사용 형태와 깊은 마취를 입력한 후, 참살하고 피부를 제거합니다. 흡입 anesthetics은 피해야한다. 마취의 타당성이 잘린하기 전에 발끝 핀치에 의해 평가됩니다. 가위로 아래턱을 제거하고 rongeur의 도움으로, 양쪽에있는 얼굴 근육을 제거합니다. </li><li> incisors의 뒷면에서 시작 rongeur 비강, 한 번에 하나의 측면을 덮고있는 뼈 제거합니다. 오렌지 / 브라운 기관은 코 뒤쪽에 위치한으로 후각 turbinates가 보이기 시작하다. </li><li> 정교한 포셉로 turbinates 폐기하십시오. 수직 판, 소공 질의 판과 비강의 천장의 아크 : 26 게이지 바늘을 사용하여 세 줄을 따라 조직을 절단하여 심장에 누워 후각 점막을 분리. </li><li> 양쪽에 biopsies를 수집하고 DMEM / 햄 F12 - 가득한 페트리 접시에서 그들을 전송합니다. 이 절차는 발병 안락사에서 10 분 이상 안 걸릴 것입니다. </li><li> 자, 가래를 제거하기 위해, 중간 가득한 배양 접시에 biopsies 두 번 전송합니다. </li></ol> 2. 인간의 강한 점막 수집 <ol><li> 이 절차는 해당 지역 윤리위원회 (S)에 따라, 귀 코 스로트 (ENT) 외과 의사에 의해 실시되어야하고, 모든 외래는 정보 동의서에 서명해야합니다. </li><li> 0 ° 또는 30 ° 단단한 내시경 (4mm 직경)를 사용, 코와 충치를 모두 검사하고 폴립이나 염증성 병변의 putative 존재를 평가. 계정에 심장의 편차를 복용, 최고의 비강을 선택합니다. </li><li> 면화 작은 주걱을 사용하여 10 분, 에피네프린과 같은 lidocaine과 같은 국소 마취제를 적용할 수 있습니다. </li><li> throughcut 사골 집게와 가운데 turbinate의 중간 부분의 루트 또는 dorsomedial 지역에서 심장에 중 두 평방 밀리미터 생검를 수집합니다. </li><li> 후각 생검은 다음 DMEM / 햄 F12 1 ML 가득 살균이 ML 관에, 멸균 바늘을 사용하여 전송됩니다. 생검이 문화 매체에 잠겨 있는지 확인하기 위해 거꾸로 튜브를 팁. </li><li> 냉장 컨테이너에 튜브를 삽입하고 연구실에 수송. 이 단계에서는 생검은 특정 뇌 질환에 초점을 맞춘 또는 줄기 세포 생성에 대한 처리 비교 분자 연구 글 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 인간과 쥐 점막에서 강한 줄기 세포의 분리 <ol><li> DMEM / 햄 F12에 biopsies 씻으십시오. 37 1 시간, dispase II 솔루션 (2.4 IU / ML) 1 ML 가득한 페트리 접시에 biopsies을 품어 ° C. </li><li> 다음 diffracted 거꾸로 조명과 해부 현미경, 후각 상피는 마이크로 주걱을 사용하여 기본 라미나의 propria에서 제거됩니다. </li><li> 후각 상피는 스트 라이프입니다 라미나의 propria에 비해 얇은이며 검은 배경 위에 반투명 보이는 주황색 / 갈색. 흰색 배경에 걸쳐 상피는 회색과 라미나의 propria, 갈색 보인다. </li><li> 일단 정화, DMEM / 햄 F12 가득한 페트리 접시에 얇은 판의 propria를 전송할 수 있습니다. </li><li> 조직은 설치류에서있다면,이 25 게이지 바늘로 작은 조각으로 라미나의 propria 잘라. 그런 다음, collagenase IA 1 ML 가득 15 ML 튜브에 조각을 전송합니다. </li><li> 튜브에서 멸균 플라스틱 피펫을 사용하여 조직을 떼어 놓다. 그렇다면, 37에서 10 분 동안 튜브를 품어 ° C. </li><li> 분리를 종료하려면, 부드럽게 튜브를 바위와 구 CA - 무료 MG - 무료 PBS의 ML과 5 분 200g에 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 플라스틱 문화 요리 10 % 태아 송아지 혈청, 항생제 및 플레이트와 함께 보충 DMEM / 햄 F12 배지에서 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 이제 조직 인간있다면, 그때 200-500 μm의 이르는 두께 3-4 조각으로 라미나의 propria를 슬라이스. </li><li> 자체 2cm 직경 문화 요리에 각 스트립을 삽입하고 무균 1.3 cm 직경의 유리 커버 풀렸는데로 조직을 커버. </li><li> 그런 다음, 각 문화 요리에 배지 500 μl (DMEM / 햄 F12 10% 소태아 혈청과 항생제로 보충)을 추가합니다. </li><li> 어느 조직 유형에 대한 모든 2-3일 문화 매체를 갱신. </li><li> 5 ~ 7 일 후에, 줄기 세포는 문화 접시를 침공하기 시작하고 2 주 후에 그들이 합류한다. , 통로에 도달하고 문화 flasks에 전지를 전송할 때 confluency. </li></ol> 4. 영역의 형성과의 연결 Differe강한 줄기 세포의 ntiation <ol><li> 줄기 세포 분야를 생성하려면, 37 두 시간 동안 flasks을 품어 ° 폴리 - L - 라이신과 C. (텍스트 : 5 g/cm2). </li><li> 취급 flasks에 cm2 당 16,000 세포의 밀도에 플레이트는 세포. </li><li> 이틀, 보충 매체 cm2 당 0.2ml (DMEM / 햄 F12 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 (ITS - X, 1 %), EGF (50 NG / ML)과 FGF2 (와 보충으로 세포를 공급 50 NG / ML)). </li><li> 2 ~ 5 일 후, 부유 세포 분야 및 중 다시 플레이트를 수집하거나, 세포 치료의 동물 모델에 이식하기 전에 그들을 떼어 놓다. </li><li> 신경 세포와 같은 세포에 후각 줄기 세포를 차별화하는 데, B - 27, 페니실린, 스트렙토 마이신, 글루타민 및 글루 탐 산염을 포함 Neurobasal 매체를 21 일 동안 그들을 육성. </li><li> 그렇다면 매 3 일마다 중간 변경합니다. 신경 세포와 같은 세포 두 시간 3 주 후에 나타납니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 비강 인간 explant - 뚫고 나올 때까 줄기 세포 것은 (그림 2A) 급속도로 나누어하고 confluency가 1-2주 이내에 도달할 수 있습니다. stemness 중 하나는 주요 기능 nestin 발현은 (그림 2B) 평가했습니다. EGF (50 NG / ML)과 FGF2 (50 NG / ML)로 보충 혈청이없는 배지와 폴리 - L - 라이신에 성장하면 후각 줄기 세포 분야 (그림 2C)을 일으키다. 혈청 함유 배지에서 재배하면 새로 도금 분야는 GFAP - 표현 세포 (~ 50 %), tubulin - 표현 전지 (~ 10-15%)과 O4 - 표현 세포 (~ 2~5%) 9 (그림을 일으키다 2D - F). 그러나, 구체 파생 세포의 운명을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, B27 및 글루 탐 산염, β - III의 tubulin (그림 2G)와 MAP2 (그림 2 시간)를 표현하는 신경 세포와 같은 세포로 비강 후각 줄기 세포의 대부분과 함께 보충 Neurobasal 배지 재배시. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 실험의 전체 계획. 후각 점막의 biopsies는 쥐 또는 인간의 비강에서 excised 수 있습니다. Explants는 뇌 질환의 생체를 식별하는 목표 비교 분자 연구 글 사용할 수 있습니다. 후각 줄기 세포를 분리 들어, 라미나의 propria 및 신경 상피 사이의 상호 작용 45 분 후에 상피가 마이크로 주걱과 제거, dispase II 효소를 방해하고 있습니다. 쥐 후각 줄기 세포는 더욱 collagenase 아이오와 라미나의 propria를 dissociating으로 선택됩니다. 뚫고 나올 때까 줄기 세포가 아니라 전체를 침략하기 전까지 인간의 조직을 위해, 후각 라미나의 propria 조각은 유리 coverslip 아래 양식입니다. 증식 후, 적절한 배지를 사용하여 후각 줄기 세포 분야를 생성할 수 있습니다 또는 신경 세포와 같은 세포로 구분. 후각 줄기 세포는 내가하는 데 사용할 수있는) 수리 뇌 질환이나 외상 또는 II)는 중추 신경계 질환의 분자 마커를 식별합니다. 삽화는 Servier 의료 예술의 도움으로 만들어집니다. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 문화와 비강 인간의 후각 줄기 세포의 분화. 혈청 함유 배지 재배시 라미나 propria explant (A) 밖으로 성장하는 인간의 줄기 세포가 빠른 속도로 나누어 있습니다. 줄기 세포는 stemness 마커 nestin (B)를 표현한다. 폴리 - L - 라이신 - 코팅 플라스틱에 도금 및 EGF와 FGF2와 보충 혈청이없는 배지에서 재배 때, 후각 줄기 세포 분야 (C)를 생성합니다. 영역 - 파생 세포, 혈청 함유 배지에서 도금 때 상승을주고 GFAP - 표현 세포 (~ 50 %), tubulin - 표현 전지 (~ 10~15%)과 O4 - 표현 세포 (~ 2~5%) 9 (DF). B27 및 글루 탐 산염과 보충 Neurobasal 문화 매체 재배 때, 그들은 β - III의 tubulin (G)와 MAP2 (H)를 표현하는 신경 세포와 같은 세포로 구분.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

기술 neurodevelopmental 및 neurodegenerative 질병뿐만 아니라 병적인이나 상처를 입었 머리를 수리하기위한 도구의 원인으로 설치류와 인간의 후각 점막 임상 연구에 유용한 모델을 만들고 제시. 프로토콜은 비교적 간단하고 쉽게 경험 세포 생물학에 의해 수행하실 수 있습니다. 생검과 문화 기술에 대한 성공률이 높습니다. 중요 단계 <ul><li> 쥐 후각 점막의 수집을 위해, 그것은 안락사와 후각 조직의 최종 절단 사이에 10 분 시간 제한을 초과하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 쥐 후각 라미나의 propria의 분리는 일반적으로 10 분 후에 이루어집니다. collagenase IA의 인큐베이션. 그렇지 않다면, 우리는 라미나의 propria 플로트의 undissociated 비트, 200g에 그것을 원심 분리기 및 기계식 잘 새에있는 세포를 replating 전에 파스퇴르 피펫을 사용하여 부동 라미나을 떼어 놓다있는 뜨는 다음날 수집하는 것이 좋습니다. 이미 첨부된 세포가 들어있는 첫 번째 잘은 신선한 문화 매체로 가득 차 있습니다. </li><li> 쥐 조직보다 작고있는 인간 라미나의 propria을 위해, 우리는 효소 분해를하지 않는 것이 좋습니다. 조직은 슬라이스하고 각 explant은 플라스틱 접시의 바닥과 유리 coverslip 사이에 삽입됩니다. 성공적인 문화 그의 두께 범위는 200에서 500 μm의에 explants를 포함합니다. </li></ul> 가능한 수정 <ul><li> 현재 프로토콜은 약간 체외에서 후각 신경을 생성하기 위해 수정할 수 있습니다. 그 목적은 신경 상피가 제거되지 않고 전체 후각 점막은 맥일웨인 헬기 (200 μm의 두께)와 슬라이스입니다. 각 explant는 접시에 도금 부분적으로 한 시간 만이라도 말린 후 FCS 함유 배지와 rehydrated 있습니다. 첫 번째 일 게시 도금 동안, 상피와 mesenchymal 세포는 explant 밖으로 성장. 그러면 신경 세포의 progenitors이 세포 레이어의 상단에있는 마이 그 레이션 및 신경으로 구분됩니다. </li><li> 후각 줄기 세포의 정화는 유동세포계측법를 사용하여 얻을 수 있습니다. 특정 표면 마커는 특성화 용지 11 출판 목록에서 검색할 수 있습니다. </li><li> 이식 실험을 위해, 그것은 후각 줄기 세포 GFP - 양성 쥐의 변형을 사용할 수 있습니다. 이 쥐의 스트레인 (스프 라그 돌리, eGFP PGK 프로 모터에 의해 구동)는 ITERT (낭트, 프랑스)에서 사용할 수 있습니다. 인간의 후각 줄기 세포에 GFP 유전자를 삽입을 위해, 우리는 lentivirus 감염을 기반으로 메서드를 사용합니다. </li><li> 본 논문은 후각 외의 뜻 mesenchymal 줄기 세포에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나,이자, 후각​​ ensheathing 세포의 다른 세포 유형은 동일한 조직에서 정화 수 있습니다. 우리는 그들의 수집 및 정화 1,17위한 방법을 설명하고 우리는 하반신 마비 환자 18 단계 I / IIa 임상 시험에 대한 인간의 비강 ensheathing 세포를 사용합니다. </li><li> mesenchymal 줄기 세포의 superfamily의 일원으로서, OE - MSCS는 adipocytes, osteocytes 및 myocytes 11로 차별화하는 데 적절한 문화 조건 하에서 수 있습니다. </li></ul> 미래 애플 리케이션 <ul><li> 우리는 이미 자폐증, 양극성 장애, 가족 dysautonomia, 파킨슨병, 알츠하이머 질환과 정신 분열증 환자의 2-7 세포와 분자 이상 현상을 연구하기 위해 인간의 후각 biopsies를 사용했습니다. 이론적으로, 모든 뇌 질환은 비강 biopsies 또는 주변 후각 줄기 세포를 사용하여 공부하실 수 있습니다. </li><li> 설치류와 인간의 비강 후각 줄기 세포는 이미 기억 상실증, 파킨슨병, 달팽이 손상 및 척수의 외상 12-16의 동물 모델에 이식할되었습니다. 그것은 알츠하이머 질환, 뇌 국소 빈혈, 다중 경화증의 동물 모델에 이들 세포를 이식하는 상상할 수있다. </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td colspan="3"> 쥐에서 후각 점막 수집 </td></tr><tr><td> DMEM / 햄 F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Pentobarbital 나트륨 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> 26 게이지 바늘 </td><td> Terumo </td><td> NN - 2613R </td></tr><tr><td> 집게 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> 인간의 후각 점막 수집 </td></tr><tr><td> 딱딱한 내시경 </td><td> 칼 Storz 또는 리차드 울프 의료 </td><td></td></tr><tr><td> Lidocaine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에피네프린 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut 사골 포셉 </td><td> 칼 Storz 또는 리차드 울프 의료 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> 후각 줄기 세포의 분리 </td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> 로체 </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 주걱 </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IA </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> 태아 송아지 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> 유리 coverslip </td><td> Knittel 글레이저 </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> 영역의 형성과 분화의 연결 </td></tr><tr><td> 폴리 - L - 리신 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P - 1274 </td></tr><tr><td> 인슐린 트랜스페린 셀레늄 (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 236 - EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 233 - FB </td></tr><tr><td> Neurobasal 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B - 27 세럼 - 무료 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> 글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> 글루 탐 산염 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td></td></tr></tbody></table>

설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

비강에있는 후각 점막은 감지 냄새 담당하고있다. 또한 외부 환경에 노출된 모든 살아있는 개인에 쉽게 액세스할 수있는 유일한 신경 조직이다. 결과적으로,이 조직은 병리 두뇌의 분자 변이를 식별하거나 세포 치료 성인 줄기 세포를 분리 목표로 사람에 대해 고유합니다. 뇌 질환의 분자 이상은 종종 사후 수집 신경 조직 샘플을 사용하여 연구하고 있습니다. 그러나,이 물질은 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 반면, 후각 점막이 쉽게 액세스할 수 있으며 냄새 1 감각의 손실없이 안전하게 biopsied 수 있습니다. 따라서, 후각 점막 하나 개발 공부를 할수있는 성인 인간 (예 : 자폐증, 정신 분열증) 2-4 또는 neurodegenerative (예 : 파킨슨병, 알츠하이머) 4,5 질병에 &#39;열린 창문&#39;을 제공합니다. 후각 점막은 neurogenesis 3,7에 비교 분자 연구 4,6 또는 체외 실험에서 중 사용할 수 있습니다. 후각 상피는 또한 바이러스성 감염의 세균 오염에 의해 손상되는 이들을 대체하기 위해 매일 새로운 뉴런을 생산하는 신경 조직이다. 이것은 영구적인 neurogenesis는 progenitors에 의해 지속뿐만 아니라 즉 점막, neuroepithelium 및 기본 라미나 propria의 80-10의 두 구획 내에 거주하는 세포를 줄기입니다. 우리는 최근 라미나의 propria에있는 성인 줄기 세포를 정화하는 방법을 개발하고, 그들이 밀접하게 골수 mesenchymal 줄기 세포 (BM - MSC)와 관련된 것을 증명하는 데 후, 우리는 (그들 후각 외의 뜻 mesenchymal 줄기 세포라는 OE - MSC) 11. 흥미롭게도, BM - MSCS 비교할 때, OE - MSCS는 높은 확산 속도, 고가 clonogenicity 및 신경 세포로 차별화하는 경향을 표시합니다. 우리는 정신 분열증과 파킨슨병 4의 새로운 후보 유전자를 공개하기 위해 전담 연구를 수행하는 이러한 특성을 이용했다. 우리와 다른 사람도 OE - MSCS는 척수의 외상 12,13, 달팽이 피해가 14 후 또는 파킨슨병 15 기억 상실 16 동물 모델에 세포 치료에 대한 후보자를 보증하는 것으로 나타났습니다. 본 연구에서는, 우리는 쥐가과 인간의 후각 점막을 생검하는 방법을 제시한다. 수집 후, 얇은 판의 propria은 효소 효소 또는 효소 이외의 방법을 사용하여 정화하는 상피와 줄기 세포를 분리합니다. 후각 줄기 세포를 정화하는 것은 다음 중 다수 재배하고 액체 질소에 틀었 또는 분야를 형성 유도 또는 신경 세포로 구분하실 수 있습니다. 이러한 줄기 세포는 또한 비교 omics (proteomic, 게놈 transcriptomic, epigenomic) 연구에 사용될 수 있습니다.

우리는 여기서 쥐, 인간의 비강 충치의 후각 점막 조직 검사로 연구를 해왔하는 방법을 설명합니다. 이러한 biopsies은 뇌 질환의 분자 변이를 식별하거나 뇌 손상 / 질병의 동물 모델에 세포 이식을 위해 활용할 수 multipotent 성인의 줄기 세포를 분리하거나 사용할 수 있습니다.

비강에 위치한 후각점막은 냄새를 감지하는 역할을 합니다. 또한, 이는 외부 환경에 직접 노출된 유일한 신경 조직으로...

본 절차의 전반적인 목적은 쥐 또는 사람으로부터 비강 후각 줄기세포를 분리하여 분자적 이상을 확인하거나 병리적 또는 외상을 입은 뇌를 복구하는 것입니다. 이는 먼저 비강에서 후각 점막 생검을 외과적으로 수집함으로써 수행됩니다. 다음으로, 하부 고유층(lamina propria)에 있는 외배엽 중간엽 줄기세포에 집중하기 위해 후각 상피와 그 상피 줄기세포를 제거한 후, 설치류 조직을 해리하거나 유리 커버슬립 아래에서 배양된 인간 이식물로부터 유출 세포를 수집하여 해당 세포들을 분리합니다.절차의 마지막 단계는 줄기세포 구체를 배양하여 뉴런 유사 세포로의 분화를 유도하는 것입니다. 최종적으로 비점막 전체를 분리하여 개별화된 줄기세포를 얻습니다. 부유 구체 또는 뉴런 유사 세포는 뇌 질환의 분자 마커를 식별하거나 신경계의 손상을 회복시키는 데 사용될 수 있습니다.본 연구에서는 후각 점막으로부터 인간 및 설치류의 비강 줄기세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 줄기세포가 신경 조직에 속하며, 모든 살아있는 개체에서 쉽게 접근 가능하며, 병리학적 뇌의 진단 또는 치료에 사용될 수 있다는 점입니다. 저는 이비인후과 외과 의사로서 수많은 임상 연구를 위해 수백 건의 비강 생검을 수행해 왔습니다.이 절차는 안전하며 수행 가능합니다. 그리고 국소 전신 마취를 시행합니다. 저는 인간 또는 rod, 비강 또는 factor 줄기세포 배양 분야의 전문성을 갖춘 주니어 과학자입니다.이는 높은 증식률과 신경 세포 유형으로 분화하려는 경향을 보입니다. 이들은 건망증 및 퇴행성 질환의 동물 모델에서 효율적인 것으로 입증되었습니다. 점막을 채취하기 전, 깨끗한 배양 후드 내에 DMEM Ham, F 12 배양액이 준비된 35 millimeter 페트리 접시 3개를 준비합니다.이제 발가락 꼬집기로 쥐가 sodium pentobarbital에 의해 깊은 마취 상태에 들어갔음을 확인한 후, 경추 탈구법(decapitation)으로 안락사시킵니다. 머리를 분리하고 피부를 제거합니다. 가위로 하악골을 제거하고, 핀셋을 사용하여 절치 뒷부분부터 시작하여 양측의 안면 근육을 제거합니다.Ron Jur를 사용하여 비강을 덮고 있는 뼈를 한쪽씩 제거합니다. 코 뒷부분에 주황색 또는 갈색 장기로 보이는 후각 비갑개가 나타나면, 포셉을 사용하여 비갑개를 조심스럽게 제거합니다.26 gauge 바늘을 사용하여 수직판의 호, cribriform plate, 그리고 비강 천장을 따라 조직을 세 개의 선으로 절개함으로써 비중격에 위치한 후각 점막을 분리합니다. 양측에서 생검 조직을 채취하여 A-D-M-E-M ham F 12가 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. 이 과정은 안락사 시작 후 10분 이내에 완료되어야 합니다.이제 점액을 제거하기 위해, 관련 지역 윤리 위원회의 지침에 따라 생검 조직을 배지가 채워진 페트리 접시에 두 번 옮겨줍니다. 이 절차는 이비인후과 전문의가 수행해야 하며, 모든 외래 환자는 0도 또는 30도 경성 내시경을 사용하기 전 고지된 동의서에 서명해야 합니다. 양쪽 비강을 검사하여 폴립 또는 염증성 병변의 존재 여부를 평가합니다.비중격 만곡을 고려하여 최적의 비강을 선택합니다. 면봉을 사용하여 에피네프린이 함유된 리도카인과 같은 국소 마취제를 도포하고 10분 동안 충분히 침투시킵니다. 에트모이드 포셉(Ethmoid forceps)을 사용하여 중비갑개의 내측 기저부 또는 비중격의 등쪽 내측 부위에서 2mm² 크기의 생검 조직을 채취합니다.여기서는 뿌리 영역의 생검 조직을 보여드립니다. 이후 후각 생검 조직을 멸균 바늘을 사용하여 1 mL의 DMEM hem F 12가 채워진 멸균 2 mL 튜브로 옮깁니다. 튜브를 거꾸로 기울여 생검 조직이 배양액에 완전히 잠겼는지 확인하십시오.튜브를 냉장 컨테이너에 넣고 연구 실험실로 운반합니다. 이 단계에서 생검 조직은 특정 뇌 질환에 초점을 맞춘 비교 분자 연구에 그대로 사용하거나, 줄기세포 생성을 위해 처리할 수 있습니다. 인간 또는 쥐의 생검 조직을 세척하고 DMEM ham F 12로 헹군 뒤, 1 mL의 페이스트가 채워진 페트리 접시에서 생검 조직을 배양합니다.37 °C에서 1시간 동안 두 용액으로 처리합니다. 다음으로, 굴절된 반전광이 있는 해부 현미경 하에서 마이크로 스패출러를 사용하여 하부의 고유층(lamina propria)으로부터 인간 또는 쥐의 후각 상피를 제거합니다. 후각 상피는 검은색 배경에서 반투명하게 보이며, 흰색 배경에서 줄무늬가 있는 오렌지색 갈색으로 보이는 고유층과 대조됩니다.정제 후 상피는 회색으로 보이고 고유층(lamina propria)은 갈색으로 보입니다. 고유층을 DMEM/F-12로 채운 페트리 접시에 옮깁니다. 조직이 설치류에서 유래한 경우, 25게이지 바늘 2개를 사용하여 고유층을 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음, 조직을 해리시키기 위해 멸균 플라스틱 피펫을 사용하여 해당 조각들을 collagenase 1A 1 mL가 담긴 15 mL 튜브로 옮깁니다.그 다음 튜브를 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 해리를 중단하려면 튜브를 부드럽게 흔들어 calcium-free 및 magnesium-free PBS 수 mL를 첨가하고 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠렛을 배양액에 재현탁하여 플라스틱 배양 접시에 접종합니다.이제 조직이 인간의 조직인 경우, 레몬을 적절하게 3~4조각으로 자릅니다. 각 조각을 4-웰 플레이트의 직경 2 cm 웰에 하나씩 넣고, 조직을 멸균된 직경 1.3 cm 유리 커버슬립으로 덮습니다.그 다음 두 조직 유형 모두에 대해 각 배양 접시에 500 µL의 배양액을 추가합니다. 2~3일마다 배양액을 교체해 줍니다. 5~7일 동안 배양하면 줄기세포가 배양 접시로 침습하기 시작합니다.그리고 2주 후에 세포들이 합류(confluent)되어야 합니다. 합류 상태에 도달하면, 세포를 계대 배양하여 배양 플라스크로 옮겨 줄기세포 구체(stem cell spheres)를 생성합니다.이틀마다 전처리된 플라스크에 $\text{cm}^2$당 16,000 cells의 밀도로 세포를 재배양하십시오. $\text{cm}^2$당 0.2 milliliters의 보충 배지를 세포에 공급하십시오. 2~5일 후, 부유하는 세포 구체를 수집하여 이식 전 재배양하거나 분해하십시오.후각 줄기세포를 신경세포 유사 세포로 분화시키기 위한 세포 치료 동물 모델입니다. B 27, 페니실린, 스트렙토마이신, 글루타민 및 글루탐산이 포함된 neuro basal 배지에서 세포를 21일 동안 배양하며, 3일마다 배지를 교체합니다. 신경세포 유사 세포는 플레이팅 후 5~7일이 지난 시점부터 2~3주 후에 나타나기 시작합니다.인간 비강 후각 줄기세포가 조직편(explan)에서 성장하여 빠르게 증식하였습니다. 1~2주 이내에 충분한 합류도(confluency)에 도달할 수 있었습니다. 줄기세포의 주요 특징인 둥지 형성(nesting) 및 발현은 EGF와 FGF2가 첨가된 무혈청 배양액을 사용하여 폴리라이신(polylysine) 상에서 배양했을 때 평가되었습니다. 후각 줄기세포는 구형체(spheres)를 형성하였으며, 이 구형체들을 혈청 함유 배양액에 도말했을 때 다시 성장하였습니다.배지에서, 이들은 약 50%의 GFAP 발현 세포, 최대 15%의 tubulin 발현 세포, 그리고 최대 5%의 oligo four 발현 세포를 포함하는 세포 집단을 형성했습니다. 구체(sphere) 유래 세포를 첨가물이 포함된 neuro basal 배양 배지에서 배양했을 때, 집단의 대부분은 beta three tubulin을 발현하는 뉴런 유사 세포가 되었습니다. 동일한 뉴런 유사 세포들은 map two 또한 발현했습니다.따라서 줄기세포의 운명을 한 학기 내에 변경할 수 있었습니다. 이 기술을 통해 4주 이내에 수백만 개의 줄기세포를 쉽게 생성하고 보존할 수 있으며, 이를 통해 임상의가 향후 자가 세포 이식을 수행할 수 있습니다. 비강 내 난치성 생검은 바이오마커 및 뇌 질환을 식별하는 데 매우 유용합니다.최근 저희는 자폐증의 새로운 후보 유전자를 발견하는 데 성공했습니다. 저희는 이미 자폐증 환자와 대조군 개인으로부터 유래한 후각 줄기세포 뱅크를 구축했으며, 이는 다른 인간 뇌 질환으로 확대 적용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스 침샘에서 줄기 세포의 격리를 위해 최적화된 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 효소와 소화 기계를 고용하고, 줄기 세포의 특징과 세포를 포함하는 salispheres의 절연을 수 있습니다.

마우스 침샘에 줄기 세포의 분리

이 비디오는 성체 쥐의 뇌에서 외측 심실 벽을 분리하고 효소 조직 해리를 수행하여 단일 세포를 얻기 위한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 그런 다음 이러한 세포는 신경 줄기 세포의 증식을 선택적으로 강화하고 희소돌기아교세포와 성상세포의 공동 배양으로의 분화를 촉진하는 특정 배양 조건에 적용됩니다.

성체 마우스 신경 줄기세포에서 혼합 희소돌기아교세포와 성상교세포 배양 획득

후각 ensheathing 세포 (OECs)는 기본 후각 신경 세포의 성장을 허용 신경 능선 세포입니다. 이 특정 속성은 세포 이식에 사용할 수 있습니다. 우리는 여기에서 후두 신경 손상 모델에서 OECs의 사용을 기반 셀룰러 이식 모델을 제시한다.

말초 신경 손상 후 기능 회복을 평가하기 위해 후각 Ensheathing 세포의 이식

성인의 뇌에서 수확 한 신경 줄기 세포는 신경 시스템 개발의 기초 연구에서 재생 의학의 잠재적 인 임상 응용 프로그램을 탐험에 이르기까지 다양한 애플리케이션에 활용 증가하고있다. 이 실험 결과를 소리를하는 것이 중요합니다 이러한 세포를 성장하는 데 사용되는 분리 및 배양 조건에서 엄격한 통제를한다.

성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

다 자란 포유류의 척수에는 배양에서 분리 및 확장될 수 있는 신경줄기세포/전구세포(NSPC)가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 쥐와 인간 장기 이식 기증자로부터 성인 척수의 뇌실 주위 영역에서 생성된 NSPC의 수확, 분리, 배양 및 전달을 설명합니다.

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

제2형 염증과 관련된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 주로 기생충 감염, 알레르기 질환, 대사 항상성 및 조직 복구에 대한 반응에 참여합니다. 이 연구에서는 쥐의 코 점막에서 ILC2를 분리하고 CD226의 발현을 감지하는 절차를 입증합니다.

CD226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리

살아있는 쥐의 뇌에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하는 방법이 여기에 실험적으로 자세히 제시되어 있습니다. 그것은 그들의 웰빙을 손상시키지 않고 동일한 동물로부터 이러한 세포를 여러 번 수집할 수 있습니다.

살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

여기에서는 성체 쥐 뇌실 영역에서 분리된 확장된 신경 줄기 세포(NSC)에서 유전자 전달 효율성을 향상시키도록 설계된 핵절충 시스템에 대해 설명합니다. 이 연구 결과는 이 방법이 NSC의 유전자 섭동을 크게 개선하여 기존 transfection 프로토콜의 효과를 능가하고 세포 생존율을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

이 기사는 단일 핵 RNA 시퀀싱을 목적으로 쥐 후각 상피의 해부 및 해리를 위한 간소화된 프로토콜을 제공합니다.

단일 핵 현탁액을 위한 마우스 후각 상피의 신속한 해부 및 해리

배우세요 설치류 및 인간의 후각 점막에서 다능성 성체 줄기 세포를 분리하는 방법을. 이 기술은 신경 질환의 분자 표지자를 식별하고 손상된 뇌를 복구하는 데 활용됩니다.

설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

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