유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

이 영상에서는 파라핀 임베딩된 조직 샘플에서 DNA를 추출하는 방법을 보여드립니다. 본 시연에 사용된 샘플은 직경 3 mm, 길이 6 mm의 조직 코어입니다. 시연에서는 단일 코어를 사용하지만, 직경 5 mm 및 길이 10 mm보다 큰 더 큰 샘플이나, 본 시연에 사용된 크기의 코어 2~3개를 단일 반응에서 처리할 수 있습니다.

하지만 파라핀의 완전한 제거와 조직 소화를 보장하기 위해 프로토콜의 조정이 필요할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 조직에 어떠한 처리도 하기 전에, 조직을 보존하고 있는 왁스성 파라핀을 먼저 용해시켜야 합니다. 이는 자일렌을 사용하여 수행하는데, 자일렌과 페놀은 독성이 있습니다. 이러한 화학 물질을 사용하는 모든 작업은 흄 후드 내에서 수행해야 하며, 샘플이 들어 있는 튜브에 800 µL의 자일렌을 추가합니다.

그런 다음 샘플을 로커(rocker)에 넣고 10분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 샘플을 펠렛화하기 위해 14,000 RPM에서 3분 동안 원심 분리한 후, 튜브에서 자일렌을 제거하고 파라핀을 녹입니다. 파라핀이 완전히 용해될 때까지 이 단계들을 2~3회 반복합니다.

조직은 젖어 있고 부드러운 상태여야 합니다. 최종 DNA 수득률을 높이기 위해서는 모든 파라핀을 제거하는 것이 중요합니다. 따라서 조직 샘플의 크기가 클수록 더 많은 세척 과정이 필요합니다.

샘플에서 파라핀을 제거했으므로, 조직 소화를 위해 조직을 다시 수화시켜야 합니다. 이는 에탄올 재수화 시리즈를 사용하여 수행합니다. 먼저, 샘플에 100% ethanol 800 µL를 넣고 볼텍싱한 후, 14,000 RPM에서 3분 동안 원심 분리합니다.

상층액을 제거합니다. 800 µL의 70% ethanol을 사용하여 이 단계들을 반복하고, 이어서 50% ethanol을 사용하여 반복합니다. 조직이 덜 견고해져 펠릿화하는 데 더 많은 힘이 필요하므로, 마지막 원심분리는 5분 동안 수행해야 합니다.

이제 세포에서 DNA를 방출시키기 위해 조직을 분해해야 합니다. 이는 SDS와 같은 단백질 변성제와 조직 분해를 담당하는 효소인 proteinase K로 구성된 용액인 용해 완충액(lysis buffer)을 사용하여 수행합니다.

시료에 200에서 500 µL의 용해 버퍼를 추가합니다. 시료의 크기에 따라 400 µL가 적절한 부피입니다. 당연히, 용해 버퍼의 성분과 56 °C의 배양 온도는 단백질의 활성을 최대화하는 역할을 합니다.

ACE K는 단백질이기 때문에, ACE K가 조직을 분해할 수 있는 시간은 제한적이며, 반응을 지속시키기 위해서는 정기적으로 더 많은 효소를 추가해야 합니다. 조직이 완전히 용해될 때까지 아침과 저녁으로 10 mg/mL 농도의 ACE K 단백질 20 µL를 샘플에 추가합니다.

더 이상 고체 조직이 보이지 않을 때, 세포 잔해 버퍼에서 DNA를 추출해야 합니다. 포화 페놀을 사용하여 시료를 수성층과 유기층으로 분리합니다. 수성층에 DNA가 포함되어 있습니다.

일반 페놀의 산성은 DNA를 분해할 뿐만 아니라 수층과 유기층의 층 분리를 역전시키므로, 완충액 포화 페놀(buffer saturated phenol)을 사용하는 것이 중요합니다. 완충액 포화 페놀은 두 층으로 분리되어 저장되며, 페놀이 아래층에 위치한다는 점에 유의하십시오.

샘플과 동일한 부피의 포화 페놀 완충액을 첨가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 섞습니다. 다음으로, 샘플을 원심분리기에 넣고 14,000 RPM에서 5분 동안 원심분리하여 층 분리를 유도합니다.

DNA와 RNA는 상층 수용액 층에서 발견되는 반면, 단백질, 지질 및 다당류는 중간층과 하층 유기 용매 층에서 발견됩니다. 중간층을 건드리지 않도록 주의하며 수용액 층을 제거하여 새 튜브에 옮깁니다. 흔히 1차 원심분리 후에는 중간층이 느슨하고 불분명하게 나타납니다.

소량의 물을 사용하여 추출을 수행해야 합니다. 역추출 프로토콜은 이 비디오와 함께 제공되는 텍스트에서 확인할 수 있습니다. DNA 샘플에 동일한 부피의 페놀 클로로포름, 이소아밀 알코올을 추가하여 진행하며, 계면이 깨끗해질 때까지 이 단계들을 반복합니다. 이는 보통 3~5회 반복 후 달성됩니다.

이는 페놀 단독 사용과 동일한 목적을 수행하지만, 계면을 더 뚜렷하게 만들어 DNA 수율을 극대화합니다. 계면이 투명하고 뚜렷해질 때까지 이 과정을 한두 번 더 반복하십시오. 이제 샘플에서 단백질이 제거되었으므로, 오염된 RNA를 제거해야 합니다.

이는 RNA에 의해 수행됩니다. RNA 분해 효소 A를 최종 농도가 100 µg/mL가 되도록 샘플에 첨가하고, 샘플을 37 °C에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. RNA가 분해되었으므로, 이제 RNAA 효소를 제거해야 합니다.

DNA 정제 절차를 이전과 동일하게 반복합니다. 먼저 완충액 포화 페놀(buffer saturated phenol)을 사용한 후 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(phenol chloroform isoamyl alcohol)로 진행하면, 현재 유일한 오염물질이 RNA A 효소와 분해된 RNA뿐이므로 정제 단계 횟수를 줄일 수 있습니다. 이제 샘플에 DNA만 포함되어 있으므로, 용액에서 DNA를 침전시켜야 합니다. sodium acetate를 전체 부피의 1/10만큼 추가하고 isopropanol 1부피를 추가합니다.

대신에 에탄올 2.5배 부피를 추가할 수도 있으나, 이 경우 더 큰 튜브가 필요합니다. 시료를 -20 °C에서 30분에서 1시간 동안, 또는 야간까지 작업하는 경우 하룻밤 동안 배양하십시오. 이제 DNA를 다루게 되므로, 분해되지 않도록 시료를 계속 얼음 위에 유지하십시오.

침전된 DNA를 펠렛으로 만들기 위해 샘플을 4 °C에서 14,000 RPM으로 10분 동안 원심 분리합니다. 이후 시퀀싱과 같이 후속 실험에 방해가 될 수 있는 과잉 염을 제거하기 위해, 펠렛이 떨어지지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다. 예를 들어, 차갑게 식힌 70% ethanol 1 mL를 가하고 부드럽게 재현탁합니다.

샘플을 4°C에서 14,000 RPM으로 10분 동안 다시 한 번 원심 분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 남은 에탄올이 최대 5분 동안 자연 건조되도록 둡니다. 샘플을 과하게 건조하지 않는 것이 중요합니다.

마지막으로, DNA를 정제하여 선택한 완충액에 재현탁할 준비를 합니다. 여기서는 고압 증기 멸균된 증류수를 사용합니다. 그것으로 완료되었습니다.

추후 사용을 위해 DNA 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오. 추출이 완료되면 DNA의 품질과 양을 평가해야 합니다. 이는 NanoDrop 2000 분광광도계를 사용하여 수행하며, 측정 유형을 핵산으로 설정하고 계산 방식을 DNA 50으로 선택한 후 1.5 µL의 증류수로 기기를 초기화하십시오.

페데스탈을 세척하고 희석액 1.5 µL를 사용하여 공백 측정을 수행합니다. 여기서는 증류수를 사용합니다. 페데스탈을 세척하고 샘플 1.5 µL를 로딩한 후 측정 버튼을 누릅니다. 네. 좋습니다.

이 단계에서는 260/280 비율이 1.8인 것이 이상적입니다. 이제 DNA를 어레이(array), 비교 게놈 하이브리드화(comparative genomic hybridization), 메틸화 DNA 면역침전(methylated DNA immunoprecipitation) 및 시퀀싱(sequencing)을 포함한 여러 후속 응용 분석에 사용할 수 있습니다.

지금 당장 필요하지 않은 경우, 이 프로토콜들에 대한 링크가 여기에 표시됩니다. 샘플은 추후 사용을 위해 -20 °C에서 보관하십시오.