Name: 유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: 학습하세요 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 DNA 추출 방법을. 자일렌 탈파라핀화, 에탄올 재수화, 프로테이나제 K 소화를 통해 고품질 DNA를 분리하는 신뢰할 수 있는 프로토콜입니다.

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우리는 그들의 평가 및 본 동영상과 문서의 critiques에 대한 람 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 건강 연구에 대한 캐나다 연구소에서 자금을 지원했다.

<p class="jove_title"&gt; 1. 절차 노트</p&gt;<ul&gt;<li&gt; 크실렌과 페놀은 독성 화학 물질 있으며 fumehood에서 처리되어야합니다. 사용하기 전에 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조하십시오.</li&gt;<li&gt; 크실렌 특정 플라스틱을 녹이고, 그들은이 화합물을 용납 같은 폴리 프로필렌 튜브를 사용해야합니다.</li&gt;<li&gt; 특별 팁는 내부 숯불 스토퍼를 포함하는 것을 구입하실 수 있습니다. 이것은 피펫에 고무 구성 요소를 해소에서 크실렌을 방지합니다. 또는 필터 팁을 사용할 수 있습니다.</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. 파라핀 제거</p&gt;<ol&gt;<li&gt; fumehood에서 파라핀을 해산 5 ~ 15 분 정도 부드럽게 잡고 락커에 표본과 장소를 포함하는 레이블 튜브에 크실렌 800 μl (VWR, CABDH6216 - 4)을 추가합니다.</li&gt;<li&gt; 펠렛 3 분 microcentrifuge에서 최대 속도 (14,000 RPM 또는 16 000 XG)에서 회전하여 샘플. 조심스럽게 크실렌 뜨는을 철회하고 크실렌 폐기물의 폐기를위한 폴리 프로필렌 튜브에 폐기. 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오.</li&gt;<li&gt; 크실렌 세척 단계 1을 반복하고 2until 파라핀이 완전히 녹아있다. 이것은 일반적으로 조직 표본의 크기에 따라 2-3 세척이 필요합니다. 완전히 녹아 샘플 부드러운 나타납니다, 그리고 때로는 그 구조적 무결성을 잃게됩니다. 샘플의 무결성은 부드럽게 피펫 팁로 평가하실 수 있습니다.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. 에탄올 rehydration</p&gt;<ol&gt;<li&gt; 100 % 에탄올 (V / V) 분자 생물학 등급 에탄올, 소용돌이 800 μl를 추가 후 microcentrifuge에서 14,000 rpm으로 3 분 돌린다. 펠렛을 방해하지 않도록주의하고, 에탄올 뜨는을 제거합니다.</li&gt;<li&gt; 70 % 에탄올 800 μl (100 % (V / V) 증류수에 희석 에탄올을 (DH 추가<sub&gt; 2</sub&gt; O)), 소용돌이, 그리고 14,000 RPM에서 3 분간 돌린다. 조심스럽게 에탄올 뜨는을 제거합니다.</li&gt;<li&gt; 50 % 에탄올 800 μl (100 % (V / V) 증류수에 희석 에탄올을 (DH 추가<sub&gt; 2</sub&gt; O)), 소용돌이, 그리고 14,000 rpm으로 5 분간 돌린다. 조심스럽게 pipetting하여 가능한 한 많은 에탄올로 제거합니다. 완전히 rehydrated 조직하지 않습니다 펠렛뿐만 아니라 탈수 조직으로이 시점에서 펠렛을 방해 매우주의하십시오.</li&gt;<li&gt;하고 5 분 동안 에탄올 뜨는, 공기 건조 펠렛을 제거한 후 조심하지여 건조합니다.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. 조직 소화</p&gt;<ol&gt;<li&gt; 용해 버퍼의 200-500 μl (아래 수식)을 추가합니다. 펠렛은 피펫 팁 또는 소용돌이를 사용하여 다시 일시 중지합니다. 이 시점에서 추가적인 노력 완전히 다시 중단 조직 샘플을보다 완벽하게 소화하고 DNA의 좋은 수율로 얻을 수 있습니다.</li&gt;<li&gt; 56 샘플을 품어 ° 물 목욕이나 가열 블록에서 C.</li&gt;<li&gt; 조직 코어의 경우, 스파이크 proteinase K (20 MG / ML 주식 솔루션, Invitrogen, AM2548) 아침과 저녁에 20 μl.</li&gt;<li조직이 완전히 해소 될 때까지&gt; 2~5일에 대한 소화 위의 단계를 반복합니다.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_step"&gt; 용해 완충액</p<ul&gt;<li&gt; 10 MM 트리스 - HCL의 산도 8.0</li&gt;<li&gt; 100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 산도 8.0</li&gt;<li&gt; 50 MM NaCl</li&gt;<li&gt; 0.5 % SDS</li&gt;<li&gt; 200 μg / ML proteinase K는 (바로 사용하기 전에 추가)</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 5. DNA는 청소</p&gt;<ol&gt;<li&gt; 페놀 포화 (피셔, BP1750I - 400)과 역전의 혼합 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다. microcentrifuge에서 14,000 rpm으로 적어도 5 분간 스핀.</li&gt;<li&gt; 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송합니다. 계면 참고 : 흰색 소재의 많은 있나요?</li&gt;<li계면은 (일반적으로 3 번 이상) 명확 때까지&gt; 수성 분율에서 1 단계와 2 단계를 반복합니다. extractions 다시 수행 * 계면이 최종 수율을 높이기 위해 퍼지 때.</li&gt;<li샘플의 추출 수성 분율에 isoamyl 알코올 (25:24:1) (피셔, BP1752I - 400) : 클로로포름 : 계면이 분명하다&gt; 일단, 페놀의 동일한 볼륨을 추가합니다. 5 분 혼합 후 14,000 rpm으로 5 분간 돌린다. 잔여은 페놀 및 추가 수성 층의 추출을 촉진, 계면을 선명 Thisreduces</li&gt;<li&gt; 37에서 1 시간 동안 100 μg / ML에 새로운 튜브로 수성 레이어를 제거하고 treatwith RNase ° C.</li&gt;<li&gt; 남아있는 RNase를 제거하고 수성 분수를 수집하기 위해 4 단계를 반복합니다. 초기 lysate에서보다 훨씬 덜 제거하는 단백질이 있어야로 당신은 단지 1 개 또는 2 버퍼 포화 페놀 단계가 필요합니다.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_content"&gt; * extractions는 DH의 50-100 μl를 추가 다시 수행하려면<sub&gt; 2</sub계면 유기 부분을 포함하고있는 샘플 튜브에&gt; 0. 믹스, 그리고 5 분 microcentrifuge에서 14,000 rpm으로 샘플을 회전하기 위해 튜브를 반전. 수성 단계를 수집하고 이전에 취득한 수성 추출에 추가합니다. 계면 분명히 때까지 extractions 다시 계속합니다.</p&gt;<p class="jove_title"&gt; 6. DNA 침전</p&gt;<ol&gt;<li&gt; 귀하의 수집 수성 층의 볼륨을 예상하고있다.</li&gt;<li&gt; 10분의 1 3 M의 아세트산 나트륨의 산도 5.2의 볼륨을 100 % 이소프로판올 (V / V) 분자 생물학 등급 (또는 100 % 에탄올 2.5 권) 1 볼륨을 추가합니다.</li&gt;<li&gt; 잘 믹스 30 분 또는 숙박에 대해 얼음 또는 -20 ° C의 냉동고에 넣어.</li&gt;<li4 최대 속도&gt; 스핀 (14,000 RPM) ° C 10 분 microcentrifuge로</li&gt;<li&gt; 뜨는 폐기하십시오.</li&gt;<li&gt; 원치 않는 소금을 제거하는 70 %의 얼음 차가운 에탄올과 펠릿 씻으십시오.</li&gt;<li선택의 버퍼에&gt; 다시 중단 펠릿 (보통 DH<sub&gt; 2</sub&gt; O).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 7. DNA의 양을 정함</p&gt;<ol&gt;<li&gt; DNA의 농도를 정량. A260 : A280 비율 ~ 1.8하여야한다. DNA의 소량 들어, NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 측정하는 것이 좋습니다.</li&gt;<li&gt; 다음 부량, 젤 전기 영동은 DNA 샘플의 품질을 테스트하고 오염 RNA가 완전히 저하되었는지 여부를 확인하기 위해 수행되어야합니다.</li&gt;<li&gt; 고품질 추출한 DNA는 이제 스트림 애플 리케이션에 적합하거나 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. RNA가 아직 샘플에있는 경우, DNA가 깨끗하고 석출 단계 반복하고 다시 계량 및 샘플의 품질을 한정.</li&gt;</ol&gt;

<ol><li>Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+paraffin-embedded+tissue+sections+of+human+fetuses+fixed+and+stored+in+formalin+for+long+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods.</a> Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).</li>
<li>Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proteinase+K+action+by+denaturing+agents%3A+application+to+the+isolation+of+nucleic+acids+and+the+degradation+of+%27masked%27+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins.</a> Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).</li>
<li>Sambrook, J. oseph, R, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+Joseph+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+demonstration+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Thu, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+DNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methylated DNA immunoprecipitation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2009).</li>
<li>Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues.</a> Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

histopathologic 분석과 진단을 위해 Biopsied 또는 수술 excised 조직은 장기 저장을 위해 자주 포르말린 고정과 파라핀 임베디드 (FFPE)입니다. 질병의 유전 기초를 이해 증가 흥미를 가지고,이 샘플에서 DNA를 추출하는 능력은 게놈 분석과 translational 연구에 사용할 수있는 진단 자료의 귀중한 소스를 나타냅니다. 핵산은 크게 6 연결 단백질 핵산 및 단백질 - 단백질 상호 수정할 수 있습니다와 같은 역사적 FFPE 샘플은 분자 분석을 위해 가능한 원본으로 간주되지 않았습니다. 그러나, 테아제 소화가 PCR, 배열 CGH, 시퀀싱 및 methylation 프로 파일링 포함하여 하류 분석에 적합합니다 조각난 핵산을 출시하는 발견은 유전자 분석 6이 귀중한 표본의 사용이 가능합니다. 파라핀 - 임베디드 조직에서 DNA를 추출 DNA를 정화 차동 용해도에 의존 강력한 절차입니다. 추출된 DNA 품질 및 수량과 이후의 DNA를 증폭의 성공은 추출 과정과 전후의 매개 변수의 수에 따라 다릅니다. 이들을 포함 하나 이에 국한되지 않습니다 조직의 종류와 금액은, 조직 보존에 사용되는 정착액의 종류, 고정 기간, 파라핀 블록 및 스토리지 조건의 나이뿐만 아니라 원하는 DNA 세그먼트의 길이는 수 1,7를 증폭. 소화 되 다만 파라핀이 좋지 샘플의 품질과 PCR 증폭의 억제로 연결 같은 조직에서 파라핀 제거가 성공적으로 추출을위한 가장 중요한 단계입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 크실렌 </td><td> VWR </td><td> CABDH6216 - 4 </td><td> - </td></tr><tr><td> 1.7 ML SafeSeal Microcentrifuge 튜브 </td><td> BioScience 소렌손 </td><td> 11,510 </td><td> - </td></tr><tr><td> Spectrafuge 약 16m Microcentrifuge </td><td> Labnet </td><td> C0160 - B </td><td> - </td></tr><tr><td> 용해 완충액 </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 MM 트리스 - HCL pH8, 100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8 50 MM NaCl, 0.5 % SDS, 200 μg / ML Proteinase K </td></tr><tr><td> Proteinase K 스톡 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> AM2548 </td><td> 20 MG / ML </td></tr><tr><td> Proteinase K 스톡 솔루션 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 버퍼 페놀 산도 6.6/7.9을 포화 </td><td> 어부 </td><td> BP1750I - 400 </td><td> - </td></tr><tr><td> 페놀 : 클로로포름 : Isoamylalcohol (25:24:1, 산도 6.7/8.0) </td><td> 어부 </td><td> BP1752I - 400 </td><td> - </td></tr><tr><td> RNase </td><td> 로체 </td><td> 10109169001 </td><td> 100mg </td></tr><tr><td> 3M의 아세트산 나트륨의 산도 5.2 </td><td> - </td><td> - </td><td> 80ml에 40.81g NaOAc 빙초산과 산도 5.2 조정 100ml에 DH 2 O 추가 압력솥 </td></tr><tr><td> ND 3300 분광 </td><td> NanoDrop </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table>

유전과 epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 dna 추출

 DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

질병 개발 및 진행은 염색체 rearrangements, 복사 번호 이득과 손실과 DNA의 methylation을 포함하여 자주 유전 및 epigenetic aberrations 특징으로하고 있습니다. 같은 microarrays으로 높은 처리량, 게놈 - 광범위한 프로 파일링 기술, 발전이 크게 이러한 특정 변경을 파악하고 감지하는 능력을 향상. 기술 향상을 위해 계속하지만 같은 제한 요인은 샘플의 품질 및 가용성 유지됩니다. 또한, 후속 임상 정보와 질병 결과는 종종 년 초기 표본 수집 후에 수집하고 있습니다. 표본은, 일반적으로 포르말린 고정과 파라핀 - 임베디드 (FFPE)는 수십 년 동안 병원에 아카이브에 저장됩니다. 추출의 적절한 방법이 적용되는 경우에는 DNA가 효과적이고 효율적으로 파라핀 - 임베디드 표본에서 복구할 수 있습니다. 제대로 보존 및 저장 표본에서 추출한 고품질의 DNA는 유전 및 epigenetic 서명 1 정상과 질병 조직과 세대의 비교에 대한 양적 assays을 지원할 수 있습니다. 파라핀 - 임베디드 샘플, 조직 코어 또는 microdissected 조직에서 DNA를 추출하려면 조직에서 파라핀을 녹이고 크실렌 치료에 받게 다음 에탄올 세척 일련의를 사용하여 rehydrated 있습니다. 단백질과 같은 nucleases와 같은 유해 효소 이후 proteinase K. 같은 나트륨 dodecyl 황산 (SDS)로 denaturing 요원을 포함하고 소화 2 용이하게 용해 버퍼의 또한으로 소화하고 있습니다. 핵산은 biphasic 솔루션을 생성 버퍼 포화 페놀 및 고속 원심 분리를 사용하여 조직 lysate에서 정화 수 있습니다. 단백질, lipids과 다당류가 간 및 유기 - 단계 각각에 분리된있는 동안 DNA와 RNA는 위 수성 단계에 남아 있습니다. 수성 단계 반복 페놀 extractions의 보존 깨끗한 샘플을 생성합니다. 페놀 extractions 후, RNase가 오염 RNA를 제거하는 추가됩니다. 추가 페놀 extractions는 RNase와 부화 다음은 남아있는 효소를 제거하는 데 사용됩니다. 아세트산 나트륨과 이소프로판올 precipitates DNA, 그리고 고속 원심 분리의 추가는 펠렛으로 DNA를 사용하고 이소프로판올 제거를 용이하게합니다. 강수량에서 이월된 초과 소금은 이후 효소 assays를 방해할 수 있지만, 다시 펠렛으로 DNA 세 원심 분리 다음에, 70 % 에탄올로 세척하여 DNA에서 제거할 수 있습니다. DNA는 증류수 또는 선택의 버퍼에 다시 정지 계량 및 -20 ° C.에 저장됩니다 정화의 DNA가 이후에 포함할 스트림 응용 프로그램에서 사용할 수 있지만 여기에 국한되지 않습니다, PCR, 배열 비교 게놈의 하이브리드화 4 (배열 CGH), methylated DNA를 Immunoprecipitation (MeDIP)과 조직 / 종양 샘플의 통합 분석 있도록 시퀀싱.

이 동영상은 포르말린 고정 파라핀 - - 임베디드 물질로부터 DNA 추출을위한 프로토콜을 보여줍니다. 이것은 조직 섹션 크실렌과 deparaffinized하는 멀티 일 절차, 에탄올과 rehydrated 이후 유전자의 특정 또는 게놈 차원의 분석을 위해 DNA를 정화하고 분리 proteinase K로 처리됩니다.

유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

질환의 발생과 진행은 염색체 재배열, 복제 수 변이 등을 포함한 빈번한 유전적 및 후성유전적 변이가 특징입니다.

이 영상에서는 파라핀 임베딩된 조직 샘플에서 DNA를 추출하는 방법을 보여드립니다. 본 시연에 사용된 샘플은 직경 3 mm, 길이 6 mm의 조직 코어입니다. 시연에서는 단일 코어를 사용하지만, 직경 5 mm 및 길이 10 mm보다 큰 더 큰 샘플이나, 본 시연에 사용된 크기의 코어 2~3개를 단일 반응에서 처리할 수 있습니다.하지만 파라핀의 완전한 제거와 조직 소화를 보장하기 위해 프로토콜의 조정이 필요할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 조직에 어떠한 처리도 하기 전에, 조직을 보존하고 있는 왁스성 파라핀을 먼저 용해시켜야 합니다. 이는 자일렌을 사용하여 수행하는데, 자일렌과 페놀은 독성이 있습니다. 이러한 화학 물질을 사용하는 모든 작업은 흄 후드 내에서 수행해야 하며, 샘플이 들어 있는 튜브에 800 µL의 자일렌을 추가합니다.그런 다음 샘플을 로커(rocker)에 넣고 10분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 샘플을 펠렛화하기 위해 14,000 RPM에서 3분 동안 원심 분리한 후, 튜브에서 자일렌을 제거하고 파라핀을 녹입니다. 파라핀이 완전히 용해될 때까지 이 단계들을 2~3회 반복합니다.조직은 젖어 있고 부드러운 상태여야 합니다. 최종 DNA 수득률을 높이기 위해서는 모든 파라핀을 제거하는 것이 중요합니다. 따라서 조직 샘플의 크기가 클수록 더 많은 세척 과정이 필요합니다.샘플에서 파라핀을 제거했으므로, 조직 소화를 위해 조직을 다시 수화시켜야 합니다. 이는 에탄올 재수화 시리즈를 사용하여 수행합니다. 먼저, 샘플에 100% ethanol 800 µL를 넣고 볼텍싱한 후, 14,000 RPM에서 3분 동안 원심 분리합니다.상층액을 제거합니다. 800 µL의 70% ethanol을 사용하여 이 단계들을 반복하고, 이어서 50% ethanol을 사용하여 반복합니다. 조직이 덜 견고해져 펠릿화하는 데 더 많은 힘이 필요하므로, 마지막 원심분리는 5분 동안 수행해야 합니다.이제 세포에서 DNA를 방출시키기 위해 조직을 분해해야 합니다. 이는 SDS와 같은 단백질 변성제와 조직 분해를 담당하는 효소인 proteinase K로 구성된 용액인 용해 완충액(lysis buffer)을 사용하여 수행합니다.시료에 200에서 500 µL의 용해 버퍼를 추가합니다. 시료의 크기에 따라 400 µL가 적절한 부피입니다. 당연히, 용해 버퍼의 성분과 56 °C의 배양 온도는 단백질의 활성을 최대화하는 역할을 합니다.ACE K는 단백질이기 때문에, ACE K가 조직을 분해할 수 있는 시간은 제한적이며, 반응을 지속시키기 위해서는 정기적으로 더 많은 효소를 추가해야 합니다. 조직이 완전히 용해될 때까지 아침과 저녁으로 10 mg/mL 농도의 ACE K 단백질 20 µL를 샘플에 추가합니다.더 이상 고체 조직이 보이지 않을 때, 세포 잔해 버퍼에서 DNA를 추출해야 합니다. 포화 페놀을 사용하여 시료를 수성층과 유기층으로 분리합니다. 수성층에 DNA가 포함되어 있습니다.일반 페놀의 산성은 DNA를 분해할 뿐만 아니라 수층과 유기층의 층 분리를 역전시키므로, 완충액 포화 페놀(buffer saturated phenol)을 사용하는 것이 중요합니다. 완충액 포화 페놀은 두 층으로 분리되어 저장되며, 페놀이 아래층에 위치한다는 점에 유의하십시오.샘플과 동일한 부피의 포화 페놀 완충액을 첨가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 섞습니다. 다음으로, 샘플을 원심분리기에 넣고 14,000 RPM에서 5분 동안 원심분리하여 층 분리를 유도합니다.DNA와 RNA는 상층 수용액 층에서 발견되는 반면, 단백질, 지질 및 다당류는 중간층과 하층 유기 용매 층에서 발견됩니다. 중간층을 건드리지 않도록 주의하며 수용액 층을 제거하여 새 튜브에 옮깁니다. 흔히 1차 원심분리 후에는 중간층이 느슨하고 불분명하게 나타납니다.소량의 물을 사용하여 추출을 수행해야 합니다. 역추출 프로토콜은 이 비디오와 함께 제공되는 텍스트에서 확인할 수 있습니다. DNA 샘플에 동일한 부피의 페놀 클로로포름, 이소아밀 알코올을 추가하여 진행하며, 계면이 깨끗해질 때까지 이 단계들을 반복합니다. 이는 보통 3~5회 반복 후 달성됩니다.이는 페놀 단독 사용과 동일한 목적을 수행하지만, 계면을 더 뚜렷하게 만들어 DNA 수율을 극대화합니다. 계면이 투명하고 뚜렷해질 때까지 이 과정을 한두 번 더 반복하십시오. 이제 샘플에서 단백질이 제거되었으므로, 오염된 RNA를 제거해야 합니다.이는 RNA에 의해 수행됩니다. RNA 분해 효소 A를 최종 농도가 100 µg/mL가 되도록 샘플에 첨가하고, 샘플을 37 °C에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. RNA가 분해되었으므로, 이제 RNAA 효소를 제거해야 합니다.DNA 정제 절차를 이전과 동일하게 반복합니다. 먼저 완충액 포화 페놀(buffer saturated phenol)을 사용한 후 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(phenol chloroform isoamyl alcohol)로 진행하면, 현재 유일한 오염물질이 RNA A 효소와 분해된 RNA뿐이므로 정제 단계 횟수를 줄일 수 있습니다. 이제 샘플에 DNA만 포함되어 있으므로, 용액에서 DNA를 침전시켜야 합니다. sodium acetate를 전체 부피의 1/10만큼 추가하고 isopropanol 1부피를 추가합니다.대신에 에탄올 2.5배 부피를 추가할 수도 있으나, 이 경우 더 큰 튜브가 필요합니다. 시료를 -20 °C에서 30분에서 1시간 동안, 또는 야간까지 작업하는 경우 하룻밤 동안 배양하십시오. 이제 DNA를 다루게 되므로, 분해되지 않도록 시료를 계속 얼음 위에 유지하십시오.침전된 DNA를 펠렛으로 만들기 위해 샘플을 4 °C에서 14,000 RPM으로 10분 동안 원심 분리합니다. 이후 시퀀싱과 같이 후속 실험에 방해가 될 수 있는 과잉 염을 제거하기 위해, 펠렛이 떨어지지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다. 예를 들어, 차갑게 식힌 70% ethanol 1 mL를 가하고 부드럽게 재현탁합니다.샘플을 4°C에서 14,000 RPM으로 10분 동안 다시 한 번 원심 분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 남은 에탄올이 최대 5분 동안 자연 건조되도록 둡니다. 샘플을 과하게 건조하지 않는 것이 중요합니다.마지막으로, DNA를 정제하여 선택한 완충액에 재현탁할 준비를 합니다. 여기서는 고압 증기 멸균된 증류수를 사용합니다. 그것으로 완료되었습니다.추후 사용을 위해 DNA 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오. 추출이 완료되면 DNA의 품질과 양을 평가해야 합니다. 이는 NanoDrop 2000 분광광도계를 사용하여 수행하며, 측정 유형을 핵산으로 설정하고 계산 방식을 DNA 50으로 선택한 후 1.5 µL의 증류수로 기기를 초기화하십시오.페데스탈을 세척하고 희석액 1.5 µL를 사용하여 공백 측정을 수행합니다. 여기서는 증류수를 사용합니다. 페데스탈을 세척하고 샘플 1.5 µL를 로딩한 후 측정 버튼을 누릅니다. 네. 좋습니다.이 단계에서는 260/280 비율이 1.8인 것이 이상적입니다. 이제 DNA를 어레이(array), 비교 게놈 하이브리드화(comparative genomic hybridization), 메틸화 DNA 면역침전(methylated DNA immunoprecipitation) 및 시퀀싱(sequencing)을 포함한 여러 후속 응용 분석에 사용할 수 있습니다.지금 당장 필요하지 않은 경우, 이 프로토콜들에 대한 링크가 여기에 표시됩니다. 샘플은 추후 사용을 위해 -20 °C에서 보관하십시오.

dna-extraction-from-paraffin-embedded-material-for-genetic-epigenetic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 methylated DNA의 immunoprecipitation (MeDIP)에 대한 프로토콜을 보여줍니다. MeDIP가 선택 (안티 - 5 MC) 5 methylcytosine에 대한 특이성과 항체를 사용하여 게놈 DNA 샘플에서 methylated DNA 조각을 추출 두 하루 절차입니다.

Methylated DNA의 Immunoprecipitation

이 비디오에서는 위장관 종양 조직에서 얻은 FFPE 또는 포르말린 고정 파라핀 삽입 절편의 처리를 보여줍니다. 탈파라핀화(deparaffinization) 및 재수화(rehydration) 단계를 통해 후속 분석 응용 분야를 위해 조직 표본을 처리할 수 있습니다.

조직 절편의 탈파라핀화 및 재수화: FFPE 조직 슬라이드에서 파라핀 왁스를 제거한 후 조직 재수화를 하는 2단계 절차

빙권은 과거 환경 조건에서 유지 보존 생물에 대한 액세스를 제공합니다. 프로토콜은 수집하고 토양과 얼음의 영구 동토층 코어 오염을 제거하기 위해 제공됩니다. 외인성 DNA와 콜로니의 부재가 검출 된 미생물 또는 드릴링 처리에서 재료보다는 오염을 나타낸다는 것을 시사한다.

고대 생물 커뮤니티 숨겨 내부를 조사하기 위해 냉동 코어의 바깥 부분에서 외인성 물질의 제거

이 수정 추출 프로토콜은 조직 병리학 적 조직 블록에 대한 관심이 더 정확하게 대상 지역의 RNA 및 DNA 수율을 향상시킨다.

RNA 및 DNA 추출 모두 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 코어의 제조

이 프로토콜은 림프절 조직 식별 하 고 가축과 야생 동물, 샘플링 방법에서 림프절의 절단 단계를 포함 하 여 큰 동물에서의 프로 파일링 transcriptomic RNA의 격리에 대 한 절차의 개요를 제공 사후 수집 보존 및 RNA 분석 처리에 대 한 여러 동물, 그리고 고려 사항 플러스 대표 결과 걸쳐 일관성을 제공 합니다.

수집 및 RNA 분석에 대 한 큰 동물에서 림프절의 처리: 큰 동물 종의 림프 노드 Transcriptomic 연구에 대 한 준비

수다디형 두더지(Hydatidiform moles)는 어금니 게놈에 대한 부모의 기여와 형태학적 특징에 따라 분류될 수 있는 이기종 빈치학을 가진 비정상적인 인간 임신입니다. 여기서, 멀티플렉스 마이크로위성 DNA 의전성 및 포르말린 파라핀 내장 어금니 조직의 유동 세포분석프로토콜은 결과의 해석 및 통합과 함께 상세히 기술된다.

마이크로위성 DNA 게노티핑 및 유동 세포분석분석분석포르민고정파라핀내장화증모금조직

이 프로토콜은 포르말린-고정된 파라핀-포매된 조직 샘플의 퍼센트 종양 함량을 증가시키는 방법을 제시한다.

종양 거대 해부를 통한 종양 내용 향상

본 프로토콜은 재사용 가능한 단일 세포를 사용하여 반복적인 후성유전체 분석을 위한 단일 세포 방법을 설명합니다. 재사용 가능한 단일 세포를 통해 동일한 단일 세포에서 여러 후성유전학적 마크를 분석하고 결과를 통계적으로 검증할 수 있습니다.

반복적인 후성유전체학 분석을 위한 재사용 가능한 단일 세포

이 프로토콜은 다양한 임상 샘플에서 효율적인 히스톤 추출을 가능하게 하여 LC-MS/MS를 통한 후속 번역 변형 분석에 활용합니다. 주요 히스톤 변형의 견고한 검출을 촉진함으로써, 대규모 임상 코호트에서 포괄적인 후생유전학적 프로파일링을 위한 귀중한 도구로 활용됩니다.

질량분석법을 이용한 후생유전학적 프로파일링을 위한 임상 표본에서 히스톤 추출

우리는 정화를 위해 세슘 염화물 밀도 기울기 원심 분리 다음 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출을위한 방법을 설명합니다.

0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀​​도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출

학습하세요 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 DNA 추출 방법을. 자일렌 탈파라핀화, 에탄올 재수화, 프로테이나제 K 소화를 통해 고품질 DNA를 분리하는 신뢰할 수 있는 프로토콜입니다.

유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

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