Name: Trichuris muris 감염 : 굿에서 2 형 내성 및 염증의 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 학습하세요 Trichuris muris 감염 모델을 통해 내성 및 민감성 마우스의 Th2 면역 반응을 분석하는 방법을 배우세요. 이 기법은 기생충 면역학 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 (MSH - 95368, 청소 - 89,773 및 CZ하는 걸레 - 106623)과 혁신에 대한 캐나다 재단에 의해 지원되었다. SCM은 위장 박사 교제의 CIHR / 캐나다 협회의받는 사람입니다. CZ는 CIHR 새로운 탐정이다.

1. Trichuris muris 달걀을 전파 <ol><li> (또는 유전자 취약 마우스 Trichuris muris 달걀의 새로운 배치를 생성하려면, 20-30 immunodeficient 생쥐를 감염 () 예 NOD.Cg - Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) 또는 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - - /) 예. 경구 gavage으로 약 300 Trichuris muris 달걀과 6~8주 된 AKR / J). </li><li> 32-35일 후 CO 2 질식하여 쥐를 희생. </li><li> 마우스의 복부 측면을 폭로하고 70 %의 에탄올과 함께 복부가 젖었어. </li><li> 사용 포셉은 복부 피부를 파악하고 가위를 사용하여 작은 절개를합니다. 복부 내용을 노출 피부를 잘라. </li><li> 이게 맹장과 근위 대장을 식별하고 그들을 제거합니다. </li><li> 500 U / ML 페니실린, 500 μg / ML 스트렙토 마이신 (P / S)와 Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM)을 포함 10cm 배양 접시에있는 맹장과 근위 대장를 놓습니다. 루멘과 벌레를 노출 열어이게 맹장을 잘라. 인산염의 비커에 포셉 플레이스이게 맹장을 사용하면 호수 (PBS)를 버퍼 및 배설물을 제거 부드럽게 발라줍니다. </li><li> 페트리 접시에이게 맹장을 반환하고 부드럽게 벌레를 꺼내와 DMEM + P / S. 5 MLS를 포함하는 6 자 접시의 우물에 넣어 부드러운 곡선 포셉 (Roboz RS - 5047)을 사용하여 </li><li> 생쥐의 모든에 대해이 과정을 반복합니다. </li><li> 37 습도와 부화를 유지하기 위해 젖은 종이 타월 ° 4 시간을위한 C와 유리 섬유 복합 컨테이너 6 잘 접시를 넣어. </li><li> 4 시간은 부드러운 곡선 집게를 사용하여 웜을 제거하고 5mL DMEM을 포함하는 6 자 접시 중 2 개의 새 우물로 그들을 분할 후 + P / S. 15 ML 팔콘 튜브의 원래 잘 장소의 내용을 수확. 4 시간의 항원 (일반 단백질 수율 20 생쥐 10-20 MG 아르 PBS 투석 후 세포 restimulation에 사용할 수있는)과 resuspend로 3,000 RPM 및 제거하고 예비 뜨는에서 튜브를 회전 달걀이 포함된 autoclaved 수돗물에 펠릿합니다. </li><li> ° C 야간 37 위로 여섯 잘 접시를 넣어. 제거 및 웜 처분. 팔콘 튜브 5 분 3,000 rpm으로 회전에 우물의 내용을 수확. 하룻밤 항원 (일반 단백질 수율 20 생쥐 10-20 MG 아르 PBS 투석 후, Trichuris 자세 특정 항체 isotype의 ELISAs에 사용할 수있는)과 resuspend 달걀 함유 autoclaved 수돗물에서 펠렛을 같이 뜨는하고 예약을 제거합니다. </li><li> 4 시간과 야간 계란을 결합하고 75cm 2 플라스크에 전송 후 어떤 남은 웜을 제거하는 70μm 스트레이너를 통해 계란을 필터링합니다. 실온 (RT) 6 주 호일로 덮여 어두운 장소에 술병 보관하십시오. </li><li> autoclaved 수돗물에 달걀을 씻어 50 μl 50 가능한 계란에서 resuspend. 이렇게하려면 ~ 50ml 멸균 수돗물에 5 분 및 resuspend을 위해 3000 RPM의 계란을 원심 분리기. 유리 슬라이드 50 μl 계란과 장소를 제거합니다. 40x 배율을 사용하면 50 μl에 가능한 embryonated 달걀의 개수를 계산합니다. 50 μl 50 가능한 알을주고 달걀을 희석. 가능한 계란의 이미지에 대한 Kopper와 맨스필드 16 연구를 참조하시기 바랍니다. </li></ol> 2. Trichuris muris 달걀 (200 알 / 마우스)의 실험 생쥐의 급성 감염 <ol><li> 철저하게 resuspend 계란은 생쥐의 수를 치료 정도로 볼륨을 제거 X 2 (예 : 10 쥐 200 μl x를 받아 10 쥐 X 2 = 4 알을 MLS)와 14 ML 스냅 캡 튜브에서 그들을 놓으십시오. </li><li> 섞어 14 ML 스냅 캡 튜브를 반전. 적절한 크기의 먹이를 바늘 1 ML 주사기 (우리는 18 게이지 1 1 / 2 "바늘을 사용 25g 무게 쥐)에 계란 200 μl를 가져와. 한손으로 아저씨에서 마우스와 다른 손을 사용은 경구 gavage으로 달걀을 관리 . </li><li> 21일 만요. </li></ol> 3. 실험 수확 <ol><li> 일 21 CO 2를 사용하여 쥐를 희생. </li><li> 심장 관통하여 생쥐에서 혈액을 수집이 아닌 heparinized 주사기에 4에서 저장 ° C. 그 다음날은 -20 ° C.에서 혈청 및 동결을 분리 혈청은 엘리사에 의해 Trichuris 특정 IgGs 및 IGE의 검출에 사용될 수 있습니다. </li><li> 마우스의 복부 측면을 폭로하고 70 %의 에탄올과 함께 복부가 젖었어. </li><li> 사용 포셉은 복부 피부를 파악하고 가위를 사용하여 작은 절개를합니다. 피부 및 복부 내용을 폭로 기본 멤브레인 컷. </li><li> 소장, 맹장 및 결장을 확인합니다. 포셉과 맹장를 잡고 복강 밖으로 당기십시오. 포셉 또 한 쌍의와 mesenteric 림프절 (mLNs)를 노출 오른쪽으로 작은 창자를 밀어. 미디어 2 MLS를 포함한 15 ML 팔콘의 내장과 장소로 절단되지 않도록주의되는 mLNs를 제거합니다. 원하는 경우 이러한 엘리사와 세포내 F로 시토킨 분석 72 시간을위한 처리 및 체외 (1 μg / ML αCD3/CD28 또는 50μg/ml 4h Trichuris 자세 24 잘 접시 1 ML에 4x10 6 / ML)에서 restimulated 수 있습니다낮은 cytometry. </li><li> 이게 맹장과 결장을 잘라 버릴거야. </li><li> 포셉을 사용하여 2 ML Axygen 튜브의 말초 콜론과 장소에서 배설물로 알약을 밖으로 밀어. -20 ° C.에 프리즈 방패 알약은 분자 β (RELM - β) resistin와 같은 표현을위한 서양 얼룩으로 분석하실 수 있습니다. </li><li> 이게 맹장 (~ 0.5 cm)의 끝부분을 제거합니다. 배설물이 집게와 맹장의 끝부분을 잡고 제거하고 PBS는 배양 접시에있는 3 ML의 주사기와 22 게이지 바늘을 사용하여 함께 플러시하려면 다음과 같이하십시오. 5 ML 팰컨 스냅 캡 튜브에 신선한 4 % paraformaldehyde에 놓습니다. 4 스토어 ° C. 이들은 파라핀 - 임베디드, sectioned 및 histological 분석을위한 슬라이드에 장착할 수 있습니다. </li><li> RNA에 대한 근위 대장 (~ 1cm)의 조각을 제거합니다. 500 μl RNAlater 2 ML Axygen 튜브에 샘플을 넣어. 4 스토어 ° C. 이 샘플은 qPCR에 의해 mRNA의 표현에 대해 분석하실 수 있습니다. </li><li> -20 ° C.에 표시 페트리 접시와 동결에이게 맹장의 나머지 부분을 플레이스 </li></ol> 4. 이게 맹장에서 Trichuris muris 벌레의 열거 <ol><li> ~ 5 ML 물이 들어있는 배양 접시에있는 냉장고와 장소에서이게 맹장을 제거합니다. </li><li> 가위를 사용하여 루멘을 폭로이게 맹장을 잘라 냈어. </li><li> 포셉과 맹장을 보유하고 적극적으로 대변의 대부분을 제거하는 맹장를 흔들. </li><li> 물을 포함하고 부드럽게 IECs에게 기본 조직을 긁어 부드러운 곡선 집게를 사용하여 다른 배양 접시에이게 맹장을 전송. </li><li> 물을 포함하는 새로운 배양 접시에이게 맹장을 전송하고 적극적으로 작은 조각으로 조직을 추출, 집게로 남아있는 조직을 다쳤어요. </li><li> 배양 접시의 모든 3에있는 벌레의 모든 통계를 해부 현미경을 사용합니다. 당신이 벌레 같은 벌레를 위해 접시에서 제거 찾아서 두 번 계산되지 않습니다. 웜이 손상된 경우 (예 : 반으로 깨진) 정확한 숫자는 파악에만 두꺼운 또는 얇은 끝이 계산합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 Trichuris muris 감염 모델 연구가 기생충이 부담하고 체계적인 면역 반응뿐만 아니라, histologically 검사 말초이게 맹장 내의 염증 반응을 계량 할 수 있습니다. 수확이게 맹장의 루멘가 노출되면, Trichuris 벌레는 해부 현미경 (그림 1A - B)를 사용하여 열거 수 있습니다. Trichuris에 면책의 매개 변수는 항체 모성 동물 IgG1로 전환 isotype (Th2 타입 면역과 관련된), 그리고 민감한 동물 IgG2a (Th1 타입의 면역과 관련된) (그림 1C)을 포함합니다. 잔 세포 특정 단백질 resistin 같은 분자 β (RELM - β)의 표현은 Trichuris의 통관과 관련된과 서양 얼룩 분석 (그림 2)에 의해 감지입니다. 이게 맹장의 말초 부분은 고블렛 셀 반응 및 감염에 대한 응답으로 장의 염증의 범위 (그림 3)을 평가하기 위해주기적인 산성 - 쉬프 (PAS) 물들일 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Trichuris muris에 면책의 부량. (A) 저항 (B6) 쥐가 하루 21 이후의 감염에 의해 Trichuris의 muris을 추방. 반대로, 민감한 (AKR / J) 생쥐는 만성 기생충 ​​설립에 결과 Trichuris에 감염된다. 각 막대는 평균 ± 그룹당 4-8의 SEM 동물을 나타냅니다. (B) 웜은 해부 현미경을 사용하여 계산됩니다. 톱 패널 격리 벌레를 보여줍니다, 하단 패널은 IECs과 대소변의 존재에 벌레를 보여줍니다. (C) Trichuris 특정 IgG2a의 titres는 배설 Trichuris의 항원 (O / N 자세, 5 μg / 코팅 접시에 희석 혈청 엘리사 (1시 2분 희석, 희석 1시 20분에서 시작하고 1:2560에 종료)에 의해 결정됩니다 ML). 민감한 AKR / J 마우스는 모성 B6 생쥐보다 Trichuris 특정 혈청 IgG2a의 특히 높은 수준의 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Trichuris muris의 통관은 잔 세포 특정 단백질 RELM - β 7 표현과 연결됩니다. RELM - β 생산 Trichuris - 감염 방지 (B6)에서 배설물 여럿 발견하지만, 서양 얼룩 분석하여 쥐 (AKR / J) 감염될 수는 없습니다. 각 레인, (N) = 나이브 (TM) = 21 일 Trichuris 감염된 쥐 한 동물의 대표입니다. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 말초이게 맹장 다음 Trichuris 감염의 Histological 시험. 말초이게 맹장의 5-7 μm의 섹션은 PAS 물들다. 고블렛 셀 증식 및 점액 생산 방지 (B6)에서 분명하지만, Trichuris 감염 다음 쥐 (AKR / J) 취약하지 않습니다.

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</ol>

동물 실험은 브리티시 컬럼비아 대학교에서 정한 지침과 규정에 따라 수행되었다.

이 프로토콜은 자세한 조사가 필요에 따라 수정할 수있는 표준 고용량 급성 Trichuris muris 감염합니다. 예를 들어, 마우스가 희생될 수 있으며, 조직은 다른 일 수확. 생쥐가 성공적으로 가득 벌레 부담을 설립한다는 결정하기 위해 그들은 모두 쥐가 약 200 벌레의 부담을 가지고해야하는 시점에서, 하루 14 희생하실 수 있습니다. 생쥐도 감지하는 웜이 성숙에 도달하고 그 삶의 기간 동안 호스트와 남아 것이 32일에 대한 감염 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 만성 Trichuris muris 감염을 모델로 적용할 수 있습니다. 이렇게하려면 관리 계란 선량은 저용량 감염 (약 30 알)을 조정할 수 있습니다. 이 약을에서 정상적으로 모성 마우스는 보호 Th2 반응을 유도하지 않는 것이 아니라 Th1 반응을 생성하고 약 20 웜 17 부담을 유지합니다. 다른 감염 모델을 통해 Trichuris muris 감염</e...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 동물 먹이 니들스 (18 × 1 ½ &quot;) </td><td> 포퍼 </td><td> 7912 </td><td></td></tr><tr><td> 부드러운 곡선 집게 </td><td> Roboz </td><td> RS - 5047 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11,965 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - Prkdc scid Il2r gtm1Wjl / SzJ (NSG) </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 005557 </td><td> 이들은 우리가 사용 생쥐되며, 단, immunodeficient 마우스 또는 민감한 긴장이 작동합니다. </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Qiagen </td><td> 76,104 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ML 튜브 </td><td> Axygen </td><td> MCT - 200 - C </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 튜브 </td><td> 매 </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 6 웰 플레이트 </td><td> 매 </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,710 </td><td></td></tr><tr><td> α - RELMβ 항체 </td><td> PeproTech 부동산 </td><td> 0694270Rb </td><td></td></tr></tbody></table>

trichuris muris 감염 : 굿에서 2 형 내성 및 염증의 모델

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris은 생쥐의 자연 병원체이며 인간과 가축 1 감염 Trichuris의 수종에 생물학과 antigenically 비슷합니다. Infective 달걀이 구두 gavage, 말초 소장에서 부화에 의해 부여됩니다, 라인 -이게 맹장과 근위 결장과 성숙시 crypts이 웜은 환경 1에 달걀을 풀어 그 창자 상피 세포 (IECs)를 침공. 이 모델은 요소를 검토하는 강력한 도구입니다 컨트롤 CD4 + T는 헬퍼 (TH) 세포 활성화뿐 아니라 창자 상피의 변화. 이러한 C57BL / 6 BALB / C와 같은 저항 근친 직전에 발생하는 면역 반응이 Th2 편광 크린 시토킨 (IL - 4, IL - 5, IL - 13)과 Th1 - 관련 크린 시토킨 동안 (IL 웜의 퇴학이 특징입니다 -12, IL - 18, IFN - γ) 유전자 취약 AKR / J 마우스 2-6에서 만성 감염을 추진하고 있습니다. Th2 크린 시토킨 신속 IECs의 매출, 고블렛 셀 차별화, 모집 및 상피 투과성 및 웜 퇴학 7-15에 연루되어 모든있는 평활근의 수축에 변화를 포함한 창자 microenvironment의 생리 변화를 추진하고 있습니다. 여기 자세히 후속 실험에서 사용할 수 Trichuris muris 달걀을 전파를위한 프로토콜을. 우리는 또한 이후의 감염 분석을위한 제안 샘플 실험의 수확을 제공합니다. 전반적으로,이 프로토콜은 위장관뿐만 아니라 IECs의 면역 이펙터 기능에 목 proclivity에 관한 질문을 해결하기 위해 사용할 수있는 Trichuris muris 마우스 감염 모델을 수행할 수있는 기본 도구와 연구자를 제공할 것입니다.

Trichuris muris 감염은 모성 쥐가 보호 Th2 반응을 생성하고 민감한 쥐가 병적인 Th1 반응을 생성하는 Th2 면역의 창자 모델입니다.

Trichuris muris 감염 : 굿에서 2 형 내성 및 염증의 모델

Trichuris muris는 생쥐의 자연 병원체이며, 인간과 가축을 감염시키는 Trichuris 종들과 생물학적 및 항원적으로 유사합니다1. ...

이 절차의 전체적인 목표는 자연적인 hain 감염 모델을 확립하고 유지하는 것입니다. 먼저 마우스에 oral gavage를 통해 tra curus mirrors 충란을 감염시킵니다. 21일 후, 감염된 동물을 안락사시키고 혈액, 장간막 림프절, 분변 펠릿, 결장 및 seeker를 채취합니다.이 시료들을 사용하여, tricks. Mirrors에 대해 생성된 면역 반응을 분석할 수 있습니다. 혈청 시료는 ELISA를 통해 분석하여 TRA 특이적 항체를 검출할 수 있습니다.세포성 면역 반응을 분석하기 위해 림프절 세포의 in vitro 재자극을 수행할 수 있습니다. 분변 펠렛은 웨스턴 블롯을 이용한 단백질 함량 평가에 사용할 수 있으며, 결장의 QPCR 분석을 통해 유전자 발현 분석을 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 맹장 끝부분은 조직학적 분석에 사용할 수 있으며, 맹장의 나머지 부분은 감염된 마우스의 충란 수를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.최종적으로, 마우스가 Trauss MOUs 감염에 대해 저항성을 갖는지 또는 감수성이 있는지 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 기생충에 대해 형성된 면역 반응을 특성화할 수 있습니다. 이 방법은 어떤 요인이 T 헬퍼 세포 활성화를 조절하는지, 그리고 TH2 세포 분화에 어떤 단백질이 필요한지와 같은 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. Trauss MOUs 알은 면역결핍 마우스 또는 KR과 같은 유전적 감수성 계통에서 증식시킬 수 있으며, 감염 35일 후 안락사시킨 마우스로부터 알을 수확합니다.동물의 복면을 노출시키고 멸균 핀셋과 가위를 사용하여 마우스의 복부를 에탄올로 헹굽니다. 복부 피부를 잡고 작게 절개합니다. 복강 내 장기를 노출시켜 맹장과 근위 결장을 확인한 후 이를 제거합니다.페니실린과 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM이 들어 있는 10 centimeter 페트리 접시에 장기를 옮깁니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 맹장과 근위 결장을 절개하여 내강과 벌레가 드러나게 합니다. 절개한 장기를 PBS가 담긴 비커에 넣고 부드럽게 흔들어 분변을 씻어냅니다.맹장을 세척한 후, 새 페트리 접시에 옮기고 매끄러운 곡선 핀셋을 사용하여 벌레를 조심스럽게 꺼냅니다. 각 마우스에서 추출한 모든 벌레를 항생제가 첨가된 DMEM 5 mL가 들어 있는 6-웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다. 젖은 종이 타월과 함께 6-웰 플레이트를 튜퍼웨어 용기 안에 넣고 37°C에서 4시간 동안 배양하여 벌레가 알을 낳도록 합니다.배양 후, 핀셋을 사용하여 원래 웰에서 벌레를 제거하고 DMEM이 들어 있는 두 개의 새 웰로 나누어 옮깁니다. 이런 방식으로 벌레를 나누면 피펫을 사용하여 알을 최대한으로 회수할 수 있습니다. 분비 항원과 알이 포함된 원래 웰의 남은 배지를 수확하여 15 milliliter Falcon 튜브로 옮깁니다.튜브를 3000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 그다음 4시간 항원이 포함된 상층액을 제거하여 보관하고, 펠렛이 포함된 튜브를 멸균수로 세척합니다. 벌레가 들어 있는 6웰 플레이트를 다시 37°C에 두고 다음 날 아침까지 하룻밤 동안 배양합니다.벌레를 제거한 후, 앞서 설명한 대로 웰의 내용물을 수확하고 상층액을 원심 분리하여 알을 분리합니다. 밤새 항원 처리를 한 상층액을 보관하고, 알을 물에 다시 현탁합니다. 이전과 마찬가지로, 이 알들을 4시간 동안 배양하여 얻은 알들과 합칩니다.남아 있는 벌레를 제거하기 위해 알을 70 micron 체로 거릅니다. 그 다음 75 centimeter 사각 플라스크로 옮깁니다. 빛을 차단하기 위해 플라스크를 알루미늄 호일로 감싸고, 알을 상온에서 6주 동안 보관합니다.이렇게 하면 6주 후에 알이 성숙하고 배아 발달이 이루어집니다. 알을 세척하고 물을 저어준 뒤 생존 가능한 알의 수를 셉니다. 여기에서 확인하십시오.생존 가능한 유정란과 생존 불가능한 난자의 예로, Exeter 농도의 50 per 50 microliters를 굽힙니다. 이 시점에서, 난자는 마우스에 감염시키기 전 4 °C에서 보관할 수 있습니다. 난자가 포함된 용액을 충분히 재현송하십시오.원하는 양의 접종물을 14 milliliter 스냅 캡 튜브에 옮기고 튜브를 뒤집어 혼합합니다. 1 milli liter 주사기에 장착된 동물 크기에 적합한 크기의 급여 바늘로 알 200 microliters를 흡입합니다. 마우스의 목덜미 피부를 잡아 고정하고 경구 투여(oral gavage)를 통해 알을 투여합니다.감염된 마우스를 케이지로 돌려보내고 21일 동안 감염이 진행되도록 합니다. 21일 후, 헤파린 처리되지 않은 주사기를 사용하여 심장 천자로 감염된 마우스의 혈액을 채취합니다. 이산화탄소 안락사 후, 혈액 샘플은 4 °C에서 보관할 수 있습니다.혈청 분리 및 ELISA를 이용한 tra 특이적 IgG 및 IgE 분석을 위한 단계입니다. 앞서 설명한 대로 마우스의 복강을 노출시킵니다. 그런 다음 핀셋과 가위 또는 다른 핀셋을 사용하여 맹장을 끌어냅니다.소장을 오른쪽으로 밀어 장간막 림프절을 노출시킵니다. 장을 절단하지 않도록 주의하며 림프절을 조심스럽게 제거한 후, 2 mL의 배지가 담긴 15 mL Falcon 튜브에 넣습니다. 이후 림프절 세포를 충원 배양액에서 얻은 4시간 항원 S 상청액과 함께 in vitro에서 배양하여 기생충에 대한 세포성 면역 반응을 분석할 수 있습니다.림프절을 채취한 후, 앞서 설명한 대로 집게를 사용하여 맹장과 결장을 절제하고, 원위 결장에서 분변 펠렛을 분리하여 2 mL 산소 튜브에 넣습니다. 펠렛은 -20 °C에서 보관할 수 있으며, 웨스턴 블롯을 통해 단백질 함량을 분석할 수 있습니다. 가위를 사용하여 근위 결장을 약 1 cm 절단하여 RNA가 포함된 튜브에 넣습니다. 이후 4 °C에서 보관하십시오.포셉으로 맹장 끝부분을 잡고 끝에서 약 5 mm 지점을 절단합니다. 3 mL 주사기와 22G 바늘을 사용하여 샘플을 PBS로 세척합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드가 들어 있는 5 mL falk 및 스냅 캡 튜브로 옮깁니다.파라알데히드로 고정한 맹장 샘플은 4°C에서 보관하며 조직학적 분석에 사용할 수 있습니다. 나머지 맹장은 페트리 접시에 넣고 -20°C에서 냉동하여 기생충을 사멸시킵니다. 기생충 수를 더 쉽게 측정하기 위해, 맹장을 해동한 후 가위로 자르며 약 5 mL의 물이 담긴 페트리 접시에 넣습니다.맹장을 절개하여 내강을 노출시키고 흔들어 분변을 접시에 수집합니다. 깨끗해진 맹장을 물이 담긴 새 페트리 접시에 넣고, 완만한 곡선형 핀셋을 사용하여 장 상피 세포를 긁어냅니다. 맹장을 물이 담긴 새로운 페트리 접시로 옮기고 조직을 작은 조각으로 찢습니다.실체 현미경으로 분변, 장 상피 세포 및 맹장 조직을 관찰하고 기생충의 수를 세며, 수를 세는 동시에 기생충을 제거하여 새로운 접시에 옮깁니다. 여기에서 보여주는 것처럼 분리 전과 후의 맹장 내 기생충 모습은 다음과 같아야 합니다. Tragus 거울 감염 이후, black six 쥐는 기생충을 제어할 수 있는 반면 KR 쥐는 기생충 부하가 증가합니다.마찬가지로 감수성이 있는 AKR 마우스는 혈청 ELISA로 측정했을 때 C60 마우스보다 현저히 높은 TRA 특이적 IgG2a 타이터를 나타냅니다. 이 실험에서 Western blot 분석 결과, 감염 후 C60 마우스의 분변에서는 goblet cell 특이적 단백질 Relm-β의 양이 증가했으나, AKR 마우스에서는 증가하지 않았음이 밝혀졌습니다. 원위 맹장의 조직학적 분석 결과, 저항성을 가진 TRA 마우스와 C60 마우스에서는 goblet cell 증식과 점액 생성이 나타났으나, 감수성이 있는 AKR 마우스에서는 나타나지 않았습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 trismus 알을 증식시키고, 실험 마우스에 감염시키며, 감수성 또는 저항성 마우스의 감염 분석을 위해 장 조직, 장간막, 장관 림프절 및 혈액을 수집하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

염증성 장 질환의 실험적 모델은 우리가 pathogenesis와 관련된 복잡한 본래과 적응 면역 반응을 조사 수 있습니다. histological 채점, 프로 - 염증 크린 시토킨 및 myeloperoxidase 활동 부량 사용하여, 하나는 염증성 장 질환에서 볼 이러한 반응을 평가하기 시작할 수 있습니다.

IBD의 DSS 유발 모델에서 창자 염증을 조사

수술 후 장폐색 (POI)가 증가 병적 상태와 장시간 입원으로 이어지는 복부 수술의 합병증입니다. 예방 또는 치료 전략이 심화 연구를 부족하기 때문에하는 것은 필요합니다. 따라서 우리는 POI의 pathophysiology를 조사하고 잠재적 인 치료 옵션을 연구하기위한 표준화하고 실현 가능한 마우스 모델을 만들었습니다.

장 조작의 표준화 된 모델의 분석 : 쥐의 장 운동성 및 내장 벽의 염증의 기능 평가

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<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; 마우스 모델 : 감염성 대장염에 대한 공부 병원체 및 호스트 기부

동물 모델은 만성 염증의 발달에 기여하는 호스트와 병원체의 특정 메커니즘을 규정하는 매우 중요한 도구로 입증되었다. 여기서 우리는 로컬 및 전신성 염증 부위에서의 진행을 평가하기 위해 인간 병원체 Porphyromonas 진지 발리 및 세부 방법론 경구 감염 마우스 모델을 설명한다.

로컬 및 전신 사이트에서 병원체에 의한 만성 염증을위한 마우스 모델

여기에서는 syngeneic CD4+CD45RBhigh T cell을 T 및 B cell 결핍 수용자로 이식하여 마우스에서 결장 염증을 유도하는 프로토콜을 제시합니다. 임상적 및 조직병리학적 특징은 인간의 염증성 장 질환을 모방합니다. 이 방법을 사용하면 결장 염증의 시작과 질병의 진행에 대한 연구를 할 수 있습니다.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

이 항원 주도 대장염 모델에서는 적색 형광 단백질을 발현하는 OT-II CD4+ T 세포를 단핵 식세포(MP)에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 RAG-/- 마우스로 채택하여 전달했습니다. 숙주는 청록색 형광 단백질(CFP)에 융합된 오브알부민 단백질(OVA)을 발현하는 대장균(E.coli)에 도전했습니다.

항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기

여기 장 장벽 위반 후 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 프로토콜 제공 됩니다. Lipopolysaccharide sublethal 저용량 24 h 후 주입에 대 한 모니터링 했다 생쥐에 체계적으로 주입 했다. 프로 염증 성 cytokines의 표정은 비장, 간, 그리고 콜론에서 여러 시간 지점에서 결정 되었다.

장 방 벽 위반 후 미생물 파생 제품의 입구를 모방 하는 쥐로 Lipopolysaccharide의 주사

Murine 원심 인공 인간의 전환 colitis, 지저분한 스트림에서 제외 콜론 세그먼트에서 주로 림프 colitis 위한 murine 모델을 제공 합니다.

Murine 원심 인공, C57BL/6 마우스에 전환 Colitis의 새로운 모델

이 프로토콜은 갈모넬라 구동 장 섬유증의 마우스 모델을 설명합니다 이는 국외 염증과 섬유증을 포함하여 크론병의 주요 병리학 적 특징을 닮았다. 이 방법은 C57Bl/6 유전 적 배경에 유지 돌연변이 마우스를 사용하여 섬유성 결과를 변경 호스트 요인을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

만성 살모넬라 감염 유도 장 섬유증

본 프로토콜에서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 입양 상반염 모델이 기재된다. CD4+ T 세포는 CBir1 TCR 형질전환 마우스로부터 분리된다. 이들은 면역 지배적인 창자 microbiota 항원 CBir1 flagellin를 위해 특정합니다, 수신자 Rag1/-- 마우스로 전송되는, 장 염증으로 이끌어 내는.

CBir1 TCR 형질 전환 CD4+ T 세포의 입양 전달에 의한 장 염증유도

당사의 상세 프로토콜은 3D 구조와 다양한 세포 유형으로 인간의 장 점막을 시뮬레이션하는 고급 intestine-on-chip 모델의 생성 및 사용을 간략하게 설명하여 미생물 집락화에 대한 면역 반응 및 세포 기능에 대한 심층 분석을 가능하게 합니다.

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

학습하세요 Trichuris muris 감염 모델을 통해 내성 및 민감성 마우스의 Th2 면역 반응을 분석하는 방법을 배우세요. 이 기법은 기생충 면역학 연구에 필수적입니다.

Trichuris muris 감염 : 굿에서 2 형 내성 및 염증의 모델

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