Trichuris muris 감염 : 굿에서 2 형 내성 및 염증의 모델

이 절차의 전체적인 목표는 자연적인 hain 감염 모델을 확립하고 유지하는 것입니다. 먼저 마우스에 oral gavage를 통해 tra curus mirrors 충란을 감염시킵니다. 21일 후, 감염된 동물을 안락사시키고 혈액, 장간막 림프절, 분변 펠릿, 결장 및 seeker를 채취합니다.

이 시료들을 사용하여, tricks. Mirrors에 대해 생성된 면역 반응을 분석할 수 있습니다. 혈청 시료는 ELISA를 통해 분석하여 TRA 특이적 항체를 검출할 수 있습니다.

세포성 면역 반응을 분석하기 위해 림프절 세포의 in vitro 재자극을 수행할 수 있습니다. 분변 펠렛은 웨스턴 블롯을 이용한 단백질 함량 평가에 사용할 수 있으며, 결장의 QPCR 분석을 통해 유전자 발현 분석을 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 맹장 끝부분은 조직학적 분석에 사용할 수 있으며, 맹장의 나머지 부분은 감염된 마우스의 충란 수를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

최종적으로, 마우스가 Trauss MOUs 감염에 대해 저항성을 갖는지 또는 감수성이 있는지 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 기생충에 대해 형성된 면역 반응을 특성화할 수 있습니다. 이 방법은 어떤 요인이 T 헬퍼 세포 활성화를 조절하는지, 그리고 TH2 세포 분화에 어떤 단백질이 필요한지와 같은 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. Trauss MOUs 알은 면역결핍 마우스 또는 KR과 같은 유전적 감수성 계통에서 증식시킬 수 있으며, 감염 35일 후 안락사시킨 마우스로부터 알을 수확합니다.

동물의 복면을 노출시키고 멸균 핀셋과 가위를 사용하여 마우스의 복부를 에탄올로 헹굽니다. 복부 피부를 잡고 작게 절개합니다. 복강 내 장기를 노출시켜 맹장과 근위 결장을 확인한 후 이를 제거합니다.

페니실린과 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM이 들어 있는 10 centimeter 페트리 접시에 장기를 옮깁니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 맹장과 근위 결장을 절개하여 내강과 벌레가 드러나게 합니다. 절개한 장기를 PBS가 담긴 비커에 넣고 부드럽게 흔들어 분변을 씻어냅니다.

맹장을 세척한 후, 새 페트리 접시에 옮기고 매끄러운 곡선 핀셋을 사용하여 벌레를 조심스럽게 꺼냅니다. 각 마우스에서 추출한 모든 벌레를 항생제가 첨가된 DMEM 5 mL가 들어 있는 6-웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다. 젖은 종이 타월과 함께 6-웰 플레이트를 튜퍼웨어 용기 안에 넣고 37°C에서 4시간 동안 배양하여 벌레가 알을 낳도록 합니다.

배양 후, 핀셋을 사용하여 원래 웰에서 벌레를 제거하고 DMEM이 들어 있는 두 개의 새 웰로 나누어 옮깁니다. 이런 방식으로 벌레를 나누면 피펫을 사용하여 알을 최대한으로 회수할 수 있습니다. 분비 항원과 알이 포함된 원래 웰의 남은 배지를 수확하여 15 milliliter Falcon 튜브로 옮깁니다.

튜브를 3000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 그다음 4시간 항원이 포함된 상층액을 제거하여 보관하고, 펠렛이 포함된 튜브를 멸균수로 세척합니다. 벌레가 들어 있는 6웰 플레이트를 다시 37°C에 두고 다음 날 아침까지 하룻밤 동안 배양합니다.

벌레를 제거한 후, 앞서 설명한 대로 웰의 내용물을 수확하고 상층액을 원심 분리하여 알을 분리합니다. 밤새 항원 처리를 한 상층액을 보관하고, 알을 물에 다시 현탁합니다. 이전과 마찬가지로, 이 알들을 4시간 동안 배양하여 얻은 알들과 합칩니다.

남아 있는 벌레를 제거하기 위해 알을 70 micron 체로 거릅니다. 그 다음 75 centimeter 사각 플라스크로 옮깁니다. 빛을 차단하기 위해 플라스크를 알루미늄 호일로 감싸고, 알을 상온에서 6주 동안 보관합니다.

이렇게 하면 6주 후에 알이 성숙하고 배아 발달이 이루어집니다. 알을 세척하고 물을 저어준 뒤 생존 가능한 알의 수를 셉니다. 여기에서 확인하십시오.

생존 가능한 유정란과 생존 불가능한 난자의 예로, Exeter 농도의 50 per 50 microliters를 굽힙니다. 이 시점에서, 난자는 마우스에 감염시키기 전 4 °C에서 보관할 수 있습니다. 난자가 포함된 용액을 충분히 재현송하십시오.

원하는 양의 접종물을 14 milliliter 스냅 캡 튜브에 옮기고 튜브를 뒤집어 혼합합니다. 1 milli liter 주사기에 장착된 동물 크기에 적합한 크기의 급여 바늘로 알 200 microliters를 흡입합니다. 마우스의 목덜미 피부를 잡아 고정하고 경구 투여(oral gavage)를 통해 알을 투여합니다.

감염된 마우스를 케이지로 돌려보내고 21일 동안 감염이 진행되도록 합니다. 21일 후, 헤파린 처리되지 않은 주사기를 사용하여 심장 천자로 감염된 마우스의 혈액을 채취합니다. 이산화탄소 안락사 후, 혈액 샘플은 4 °C에서 보관할 수 있습니다.

혈청 분리 및 ELISA를 이용한 tra 특이적 IgG 및 IgE 분석을 위한 단계입니다. 앞서 설명한 대로 마우스의 복강을 노출시킵니다. 그런 다음 핀셋과 가위 또는 다른 핀셋을 사용하여 맹장을 끌어냅니다.

소장을 오른쪽으로 밀어 장간막 림프절을 노출시킵니다. 장을 절단하지 않도록 주의하며 림프절을 조심스럽게 제거한 후, 2 mL의 배지가 담긴 15 mL Falcon 튜브에 넣습니다. 이후 림프절 세포를 충원 배양액에서 얻은 4시간 항원 S 상청액과 함께 in vitro에서 배양하여 기생충에 대한 세포성 면역 반응을 분석할 수 있습니다.

림프절을 채취한 후, 앞서 설명한 대로 집게를 사용하여 맹장과 결장을 절제하고, 원위 결장에서 분변 펠렛을 분리하여 2 mL 산소 튜브에 넣습니다. 펠렛은 -20 °C에서 보관할 수 있으며, 웨스턴 블롯을 통해 단백질 함량을 분석할 수 있습니다. 가위를 사용하여 근위 결장을 약 1 cm 절단하여 RNA가 포함된 튜브에 넣습니다. 이후 4 °C에서 보관하십시오.

포셉으로 맹장 끝부분을 잡고 끝에서 약 5 mm 지점을 절단합니다. 3 mL 주사기와 22G 바늘을 사용하여 샘플을 PBS로 세척합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드가 들어 있는 5 mL falk 및 스냅 캡 튜브로 옮깁니다.

파라알데히드로 고정한 맹장 샘플은 4°C에서 보관하며 조직학적 분석에 사용할 수 있습니다. 나머지 맹장은 페트리 접시에 넣고 -20°C에서 냉동하여 기생충을 사멸시킵니다. 기생충 수를 더 쉽게 측정하기 위해, 맹장을 해동한 후 가위로 자르며 약 5 mL의 물이 담긴 페트리 접시에 넣습니다.

맹장을 절개하여 내강을 노출시키고 흔들어 분변을 접시에 수집합니다. 깨끗해진 맹장을 물이 담긴 새 페트리 접시에 넣고, 완만한 곡선형 핀셋을 사용하여 장 상피 세포를 긁어냅니다. 맹장을 물이 담긴 새로운 페트리 접시로 옮기고 조직을 작은 조각으로 찢습니다.

실체 현미경으로 분변, 장 상피 세포 및 맹장 조직을 관찰하고 기생충의 수를 세며, 수를 세는 동시에 기생충을 제거하여 새로운 접시에 옮깁니다. 여기에서 보여주는 것처럼 분리 전과 후의 맹장 내 기생충 모습은 다음과 같아야 합니다. Tragus 거울 감염 이후, black six 쥐는 기생충을 제어할 수 있는 반면 KR 쥐는 기생충 부하가 증가합니다.

마찬가지로 감수성이 있는 AKR 마우스는 혈청 ELISA로 측정했을 때 C60 마우스보다 현저히 높은 TRA 특이적 IgG2a 타이터를 나타냅니다. 이 실험에서 Western blot 분석 결과, 감염 후 C60 마우스의 분변에서는 goblet cell 특이적 단백질 Relm-β의 양이 증가했으나, AKR 마우스에서는 증가하지 않았음이 밝혀졌습니다. 원위 맹장의 조직학적 분석 결과, 저항성을 가진 TRA 마우스와 C60 마우스에서는 goblet cell 증식과 점액 생성이 나타났으나, 감수성이 있는 AKR 마우스에서는 나타나지 않았습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 trismus 알을 증식시키고, 실험 마우스에 감염시키며, 감수성 또는 저항성 마우스의 감염 분석을 위해 장 조직, 장간막, 장관 림프절 및 혈액을 수집하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.