효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

다음 실험의 전반적인 목표는 미토콘드리아의 자가포식(autophagy)을 연구하기 위한 수단으로 미토콘드리아가 혈관으로 흡수되는 과정을 추적하는 것입니다. 이는 효모 세포에서 유전적으로 인코딩되고 미토콘드리아 표적 이중 방출 형광, 미토콘드리아를 적색 및 녹색 형광으로 표지하는 Mt Rosea라는 pH 바이오센서를 발현함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 효모 세포는 자가포식을 유도하기 위해 질소 결핍을 겪습니다.

다음으로, 미토콘드리아가 혈관으로 흡수되는 것을 시각화하기 위해 형광 현미경 또는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 세포를 관찰합니다. 질소가 부족한 세포의 VA에서 빨간색이지만 녹색이 아닌 형광의 축적을 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 집단에서 세포의 자가포식 점수를 나타내면 미토파지의 정도를 결정할 수 있습니다.

로세아(rosea)를 사용하여 미토콘드리아가 효모 세포의 액포로 흡수되는 것을 모니터링하면 mii 과정에 대한 기계론적 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 접근법은 핵과 같은 다른 세포 구획의 자가포식을 모니터링하도록 조정할 수 있으며, 이 절차는 우리 실험실의 박사후 연구원인 Dalibor alica가 될 것임을 시연합니다. 이 프로토콜에서는 미토콘드리아의 국소화를 시각화하기 위해 동일한 유전적 배경에서 파생된 야생형 균주 BY 4 7 41 및 결실 돌연변이 균주 델타 A TG 3을 사용합니다.

이 균주에서는 형광 리포터로 표시됩니다. Rosea Rosea는 상대적으로 pH가 안정적인 적색 형광 단백질과 pH에 민감한 녹색 형광 단백질로 구성된 이중 색 방출 바이오 센서입니다. 미토콘드리아 표적 염기서열은 Rosea 바이오센서를 미토콘드리아 기질에 표적화하는 데 사용됩니다.

이 기자는 높은 pH에서 Mt.Rosea로 명명되었으며 바이오 센서는 빨간색과 녹색으로 형광을 발합니다. 그러나 낮은 pH에서는 빨간색만 형광을 발합니다. 야생형 균주는 일반적으로 음성 대조군으로 예상되는 자가포식 수준을 나타내는 대조군입니다.

필수 자가포식 유전자의 발현을 위한 균주 null이 적합합니다. 이러한 균주는 미토콘드리아를 액포에 전달할 수 없기 때문에, 미토콘드리아 표적 로살라 리포터 성장 플레이트를 운반하는 플라스미드로 효모 균주를 형질전환하기 위해 표준 절차를 사용하여 직경 약 2-30mm의 콜로니가 나타날 때까지 섭씨 28-30도에서 2-4일 동안 배양하여 자가포식 유도를 위한 세포를 성장시키고, 각 균주에 대해 접종, 단일 효모 식민지를 10 밀리리터의 성장으로 접종합니다. 발효되지 않는 탄소원을 포함하는 배지.

이 경우, 에탄올 및 적절한 황소 위축성 보충제. 각 균주에 대해 중복 배양이 성장하여 총 4개의 배양이 됩니다. 효모 배양물을 섭씨 28-30도에서 약 48시간 동안 안와 흔들면서 배양하면 배양액이 성장의 중간 로그 단계에 있어야 합니다.

배양 기간이 끝나면 각 배양액의 1ml 샘플 2개를 1.7ml로 옮깁니다. 스냅 캡 플라스틱 원심분리기 튜브는 저속으로 원심분리하여 세포를 부드럽게 펠릿화합니다. 원심분리 후 세포 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브에서 상등액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.

1ml의 멸균 증류수로 세포를 재현탁액으로 세척한 다음 원심분리합니다. 세척을 두 번 더 반복하여 잔류 매체를 제거합니다. 세 번째 세척 후 100마이크로리터의 성장, 중간 또는 질소 결핍 상태에서 세포를 재현탁합니다.

중간 질소 결핍 배지는 탄소원 에탄올을 함유하고 있지만 질소 보충제가 부족하여 세포에서 자가포식을 유도합니다. 다음으로, 재현탁된 세포를 10ml의 신선한 성장에 다시 접종합니다. 중간 또는 10밀리리터의 질소 결핍. 보통.

자가포식 유도 후 6-12시간 동안 안와 흔들림으로 배양물을 배양합니다. 형광 현미경으로 Mt Rosea가 vae로 전달되는 것을 확인하는 것이 유용합니다. vae는 7 개의 아미노 4 클로로 메틸 쿠메린, L 아르기닌 mi cmac arg와 같은 cumerin 기반 청색 형광 염료를 사용하여 표지하여 위치를 지정할 수 있습니다.

cmac ARG를 사용한 라벨링은 일상적으로 수행할 필요는 없지만 효모에서 액포의 위치와 모양에 익숙하지 않은 사람들에게는 권장됩니다. 액포 라벨링 절차를 시작하려면 각 배양액의 1mL 샘플을 별도의 1.7ml 스냅 캡 플라스틱 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 각 튜브에 cmac arg를 추가합니다.

섭씨 28-30도에서 30분 동안 안와 흔들기로 튜브를 배양합니다. 30분 후, 원심분리로 세포를 펠릿화하고, 상등액을 버리고, 현탁액으로 1ml의 멸균 증류수로 세포를 세척한 다음 원심분리합니다. 멸균 증류수로 세포를 두 번 더 씻으십시오.

이 단계는 잔류 매체 및 초과 cmac arg die를 제거합니다. 세 번째 세척 후 resus는 100마이크로리터의 멸균 증류수에 세포를 현탁시킵니다. 이제 세포를 형광 현미경 검사로 이미징할 수 있도록 장착할 준비가 되었습니다.

이 프로토콜을 수행할 때 고도로 형광 미토콘드리아를 가진 T 세포를 얻을 수 있도록 새로 형질전환된 효모 배양액을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 형광 현미경 검사로 이미징을 위해 살아있는 효모 세포를 준비하기 위해 먼저 섭씨 70도에서 1시간 동안 배양하여 성장 배지와 질소 결핍 배지의 별도 1밀리리터 분취액에 2mg의 저융점 에어로를 용융하고 용융 아로스를 섭씨 70도로 유지합니다. 세포를 장착하기 위해 20마이크로리터의 용융물을 라벨이 붙은 76 x 26mm 유리 현미경에 찾아냅니다.

세척된 셀 현탁액 10마이크로리터를 aros 베드에 즉시 밀어 넣습니다. aros 침대를 22 x 22mm 유리 커버 슬립으로 덮으십시오. 세포는 커버 슬립 아래의 아그로스 표면을 가로질러 퍼질 것입니다.

그런 다음 매니큐어의 얇은 필름으로 커버 슬립의 가장자리를 조심스럽게 밀봉합니다. 이것은 탈수함 그리고 덮개 미끄러짐의 움직임을 방지할 것입니다 매니큐어가 완전히 말릴 때 화상 진찰 도중, 활주는 거치된 형광 현미경 검사법 세포에 의해 전망되게 준비되어 있습니다. 이 기술을 사용하면 세포에 대한 명백한 부작용 없이 장착 후 최대 1시간 동안 관찰할 수 있습니다.

효모 세포는 상대적으로 작기 때문에 GFP 방출 및 RFP 방출의 별도 시각화에 적합한 여기 방출 필터가 장착된 우수한 품질의 형광 현미경과 개구수가 1.2인 60배 침수 대물 렌즈가 필요합니다. 야생형 세포에서 발현된 MT Rosea와 컨포칼 레이저 스캐닝을 사용하여 얻은 일반적인 결과. 현미경 검사는 에탄올을 탄소원으로 사용하는 비결핍 조건에서 여기에 표시되며, 유형 세포는 적색 및 녹색 형광을 모두 나타내는 효모 세포의 주변에서 미토콘드리아의 전형적인 세포 분포를 나타냅니다.

적색 및 녹색 형광 방출은 액포에서 감지되지 않습니다. 때 MT. 야생형 세포를 발현하는 Rosea는 6시간 이상 질소 결핍 상태에 있습니다. 그들은 미토콘드리아에 해당하는 적색 및 녹색 형광 외에도 va에서 빨간색이지만 녹색 형광이 축적되지 않은 것을 나타냅니다.

이 ular 신호는 자가포식을 나타냅니다. 미토콘드리아 울라의 자가포식 흡수. rosea의 국소화는 CMAC arg를 사용하여 별도로 확인할 수 있습니다.

대조적으로, MT를 발현하는 미토파지 음성 대조 세포. 굶주리기 전과 굶주림 후 6시간 이상 관찰된 Rosea는 액포에 적색 형광이 축적되지 않음을 보여줍니다. 야생형과 A TG 3개의 돌연변이 균주에서 자가포식 수준을 평가하기 위해 미토콘드리아 표지가 강력하게 유지되고 있지만, 자가포식 유도 전과 선택된 시점에서 균주당 200개 이상의 세포가 ole에서 적색 형광 축적을 관찰했습니다. 자가포식 유도 후 ular 축적을 보이는 세포의 비율을 그래프로 표시한 결과 야생형 세포에서 ular 흡수 정도가 시간이 지남에 따라 증가한다는 것을 알 수 있습니다. 그러나 델타 ATG에서는 미토콘드리아를 액포에 전달할 수 없는 3개의 돌연변이 세포가 발달 후 그렇지 않습니다. 이 기술은 자가포식 분야의 연구자들이 미토콘드리아와 핵과 같은 다른 세포 기관이 VA로 전달되고 이러한 세포의 다양한 성장 조건을 탐구할 수 있는 방법을 제공합니다.