Name: 멀티 플렉스 PCR 및 역방향 라인 얼룩 하이브리드화 분석 (mPCR / RLB) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 학습하세요 mPCR/RLB 기법을 활용한 고효율 병원체 동시 검출 방법을. 나일론 멤브레인 하이브리드화와 화학발광 검출을 통해 최대 43개 분자 표적을 신속하게 식별할 수 있습니다.

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매튜 오설리번 및 페이 만주국은 호주 국립 보건 의학 연구위원회 대학원 의학 연구 장학금을받는 수 있습니다.

신중한 검토가 프라이머 및 프로브 디자인에 부여해야합니다. 같은 GenBank와 같은 데이터베이스에서 관심의 대상의 가능한 모든 시퀀스는 적합한 목표물 보존 영역을 식별하는 데 활용해야합니다. 목표의 많은 수의 단일 mPCR 분석에 증폭되고 어디에, 각 증폭 시퀀스와 비슷한 길이 있어야하고, 경쟁을 피하기 위해 300 기본 쌍을 초과해서는 안됩니다. 방법의 대안 응용 프로그램은 보존 지역에 대한 primers를 사용하여 하나 이상 목표를 증폭하고 amplicon 내에서 순서 변화를 식별하는 여러 개의 프로브를 사용하는 것입니다. 이 인스턴스에서 증폭된 PCR 제품은 더 이상있을 수 있습니다. 프라이머 어닐링 온도는 적절하게 조정 PCR 조건과 비슷한해야합니다. 강력한 보조 구조 또는 프라이머의 이합체 형성 Primers은 피해야한다. 시그마 알드리치 DNA 계산기 ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp는</a> ) 안정적으로 이러한 기능을 예측하는 데 사용할 수 있습니다. DNA 프로브은 60에 가까운 온도 ° C.를 어닐링되도록 설계되어야 특이성을 극대화하기 위해, 관심있는 각 대상의 두 가지 프로브는 분석, 반대 뇌관 바인딩 사이트에 인접한 앞으로의 DNA 가닥을 hybridizing 하나 그리고 앞으로 뇌관 바인딩 사이트에 인접한 반대 스트랜드에 다른 포함될 수 있습니다. 이 경우에 모두 순방향 및 역방향 primers은 비오틴 - 수정해야합니다. 증폭 대상마다 하나의 프로브가 사용되는 경우, 하나의 뇌관이 비오틴은 변경될 수 필요합니다. primers 및 mPCR / RLB 분석을위한 프로브를 디자인할 때 그것은 강력하게 체외 결과와 연관시키는 것은 PCR 제품 및 프로브 하이브 리다이 제이션을 예측하는 silico 방법에 사용하는 것이 좋습니다. 이상적으로 이것은 전체 게놈 시퀀스를 사용할 수있는 격리를 사용하여 수행됩니다. 이러한 FastPCR (http://primerdigital.com/fastpcr.html보실 수 있습니다)와 같은 소프트웨어는 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다. silico 분석에 낮은 온도 프로브 어닐링의 결과로 기본 쌍의 불일치를 나타냅니다 약하거나 부재 프로브 신호가 예측할 수 있습니다. DNA 추출 기술은 테스트중인 샘플에 따라 달라질 수 및 PCR 조건은 프라이머 설계에 의존합니다. 독자들은 DNA 추출 및 PCR 시약의 조건 1-19에 대한 자세한 내용은 개별 assays에 간행물라고합니다. 각각의 분석은 적어도 한 멤브레인 각 프로브에 대한 긍정적인 하나의 부정적인 프로브 신호뿐만 아니라 DNA없는 제어를 제공하기 위해 적절한 컨트롤로 실행됩니다. 또한 그것은 모든 샘플 (미생물의 경우에는 동물 또는 속 특정 프로브 등)에 대한 긍정적인 것으로 예상되는 멤브레인 상단의 프로브를 포함하는 유용합니다. 이것은 긍정적인 제어 프로브 역할뿐만 아니라, 결과를 쉽게 방향을 수 있습니다. 1. 분리막의 준비 <ol><li> 다음과 같은 솔루션을 준비 : <ul><li> 100ml 0.5M NaHCO3 (산도 8.4) </li><li> 100 ML 0.5M NaHCO 3 </li><li> 20 ML 16 % EDAC </li><li> 250 ML 0.1 M NaOH </li><li> 250 ML 2xSSPE </li><li> 250 ML 2xSSPE/0.1 % SDS - 60 ° C에서 waterbath에서 개최 </li><li> 250 ML 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). </li></ul></li><li> 60 ° C. 미리 가열 오븐 </li><li> 70 % 에탄올로 Immunetics의 Miniblotter를 청소합니다. </li><li> 2 pmol / μl의 최종 농도와 200 μl의 볼륨에 0.5 M NaHCO 3의 oligonucleotide 프로브를 희석. </li><li> 15x15 cm에 BiodyneC 나일론 막 컷. 연필과 통치자를 사용하여 막의 맨 위에 0.5 cm 공간을 지배하고 여기에 세부 사항을 작성합니다. </li><li> 20 ML과 비닐 봉투에 밀봉 막 갓 10 분 실온에서 16 % EDAC 솔루션과 바위했다. </li><li> 30 초 동안 deionised 물에 막 씻으십시오. </li><li> 멤브레인 (연필 라인에 평행)에 걸쳐 실행 채널 miniblotter에 넣어 막. 장소와 가까운 블로터에서 지원 쿠션을 넣어. 채널에서 유체 대기음. </li><li> 150 μl 0.5 M NaHCO 3 차선 1 45 채웁니다. 공기 방울을 피하기 위해주의되는, 차선 순서에 2-44을 채우기 위해 각 프로브 솔루션 150 μl를 사용하십시오. 공기 방울이 자리에 피펫을 유지, 채널에 나타나지 않는 경우, 신속하게 공기 방울은 피펫의 상단에 부동 수 있도록 솔루션을 대기음 후 다시 시도하십시오. 5 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 프로브 솔루션을 기음, 멤브레인을 제거하고 구분을 위해 상온에서 250 ML 0.1 M NaOH로 씻으십시오. </li><li> 30 초 동안 250 ML 2xSSPE에서 막 씻으십시오. </li><li> 60 오븐에 250 ML 미리 예열 2xSSPE/0.1 % SDS에서 막 씻으 ° C 5 분. </li><li> 즉시 하이브 리다이 제이션을 위해 사용하지 않는 경우, 20 분 (나머지 10ml를 예약)에 상온에서 240 ML 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 막을 세척 후, 나머지 10 ML 20 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 스터와 비닐 봉투에 막을 인감4 냉장고에 E ° C. </li><li> 세제와 브러쉬 Pyroneg와 miniblotter 씻으십시오. 린스 건조 수 있습니다. </li></ol> 2. 하이브 리다이 제이션 및 감지 <ol><li> 다음과 같은 솔루션을 준비 : <ul><li> 250 ML 2xSSPE/0.1 % SDS - 60 물 목욕에 저장 ° C. </li><li> 500 ML 2xSSPE/0.5 % SDS - 60 물 목욕에 저장 ° C </li><li> 500 ML 2xSSPE/0.5 % SDS - 42에서 오븐에 저장 ° C </li><li> 500 ML 2xSSPE - 실온에서 보관 </li><li> 500 ML 1퍼센트 SDS - 60 물 목욕에 저장 ° C 초기 (3 단계) </li><li> 250 ML 20 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 상온에서 저장 (3 단계). </li></ul></li><li> 60 한 오븐 켜고 ° C 한 오븐 42 ° C. 열판에 큰 비커에 넣어 익히지 물을 가져와. </li><li> 70 % 에탄올로 Miniblotter 클린 Immunetics. </li><li> 작은 용기에 2xSSPE/0.1 % SDS의 나누어지는 10 ML. 번호 튜브 150 μl 2xSSPE/0.1 % SDS 각 PCR 제품의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 100 10 분에 대한 PCR 제품을 삶아 ° C 스티로폼 홀더를 사용하여. 적어도 5 분 즉시 얼음에 놓습니다. </li><li> 60 240 ML 2xSSPE/0.1 % SDS를 나머지에 막 씻으 5 분 ° C 오븐. </li><li> 배경 쿠션과 miniblotter에 넣어 막. 동쪽을 향하게하므로 채널 (수직 연필 선)를 수직으로 실행합니다. </li><li> miniblotter 채널에서 흡입 초과 액체. </li><li> 처음이자 마지막 채널 남은 150 μl 2xSSPE/0.1 % SDS를 추가합니다. 공기 방울을 피하기 위해주의하고, 시퀀스에 남아 채널 (2-44)에 삶은 PCR 제품을 추가합니다. </li><li> 60 평면 플레이스 miniblotter 하이브리드화가 이루어지는 수 있도록 1 시간 ° C 오븐. </li><li> 각 채널에서 대기음 액체 다음 miniblotter에서 막을 제거합니다. </li><li> 10 분 60 ° C의 오븐에 prewarmed 250 ML 2xSSPE/0.5 % SDS 두 번 씻으십시오. </li><li> 42 2xSSPE/0.5 % SDS와 나일론 메쉬 분리를 축축하게하다 ° C와 멤브레인을 올리고 그것을 사용합니다. </li><li> 장소는 롤러 튜브로 막을 올리고, 그리고 멤브레인은 내부 표면을 맞닿아 있죠 있도록 펴다. 42 15 ML 2xSSPE/0.5 % SDS 3 μl streptavidin - 퍼옥시데이즈의 공액 (로체 응용 과학)를 추가 ° C와 롤러 튜브에 추가합니다. 단단히에서 뚜껑을 비할 42 롤러 오븐에 품어 ° C를 60 분. 롤 방향 멤브레인가 강화하지 않는 등한지 확인하십시오. 누출 주기적으로 확인합니다. </li><li> 세제와 물을 Pyroneg에 miniblotter 씻으십시오, 린스와 건조 수 있습니다. </li><li> 롤러 튜브에서 막을 제거합니다. 42 2xSSPE/0.5 % SDS를 남은 ° C를 10 분 동안 두 번 씻으십시오. </li><li> 5 분 상온에서 두 번 2xSSPE에 씻으십시오. </li><li> 80까지 오븐 미리 따뜻하게 ° C 및 장소 500ml 1% SDS 오븐 인치 턴 </li><li> 15 ML 아머샴 ECL 탐지 솔루션 (솔루션의 7.5 ML를 및 솔루션 B의 7.5 ML)까지합니다. 2xSSPE 및 검색 솔루션을 추가 폐기하십시오. 솔루션을 막의 완전한 범위를 보장 2 분 동안 손으로 부드럽게 록. chemiluminescent 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> 노출 카트리지에 맞게 플라스틱 투명 두 시트를 자르고. 두 시트 및 노출 카트리지에 장소 사이 막. </li><li> 암실로 진행합니다. 빨간 불빛 아래 카트리지에 ECL 검출 필름을 추가하고 5 분 노출. 볼 때 올바른 방향을 수 있도록 제거시 필름의 강아지 귀 오른쪽 아래 모퉁이. </li><li> 마다 제조 업체의 지시로 자동 개발자 또는 화학 욕조와 필름을 개발. </li><li> 필요한 경우 길거나 짧게 노출 시간과 노출을 반복합니다. </li></ol> 3. 분리막의 재생 <ol><li> ° C 30 분 동안 두 번 80 250 ML 1% SDS에서 막 씻으십시오. </li><li> 15 분 동안 상온에서 240 ML 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 막 씻으십시오. </li><li> 시일 10 ML 20 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 비닐 봉지에 막과 ° C 향후 다시 사용할 수 있도록 4 냉장. </li></ol> 4. 대표 결과 : 결과는 최고의 인쇄된 격자를 통해 영화를 배치하거나,​​ 다른 이미지를 스캔과 같은 BioNumerics (응용 수학, 신트 - 마틴스 - Latem, 벨기에)와 같은 소프트웨어로 가져와서 볼 수 있습니다. 각 프로브 결과는 긍정적이고 부정적인 제어 프로브 참조로 해석해야합니다. 결과는 최고 부정적 약하거나 긍정적으로 등급입니다. 신호가처럼 강한하거나 긍정적인 제어 프로브보다 강한 어디에 긍정적인 결과입니다. 신호가 없거나 부정적인 제어 (배경 신호의 경우)에 동일한 어디에 부정적인 결과입니다. 약한 결과는 신호가 긍정적인 제어 프로브보다 약해요하지만, 대조군보다 강한 어디에 있습니다. 약한 결과는 약한 프로브 구속력이나 뇌관의 이합체 형성 이외의 특정 신호로 인해 이어지는 점 돌연변이의 결과 수 있습니다. 관심 대상마다이 프로브를 사용하면 하나의 약한 결과가 안전하지 않은 특정 신호로 해석될 수있는 특이성을 향상시킬 수 있습니다. 의심이 남아있을 경우, 단일 플렉스 PCR 반응은 어떤 A의 젤 기반 감지 및 시퀀싱과 함께 수행할 수결과가 정말 긍정적인 있는지 확인하기 위해 제품을 lified. 대표 결과는 그림 2에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. mPCR / RLB 원칙 (P1)은 1.9 단계. 아민 수정 프로브는 나일론 막에 covalently 바운드 있습니다. (P2) 단계 2.10. 비오틴 수정 PCR 제품은 프로브에 hybridized입니다. (P3) 단계 2.14. 퍼옥시데이즈으로 표시 Streptavidin은, 멤브레인와 incubated과 비오틴에 바인딩됩니다. (P4) 2.19-2.21 단계를 반복합니다. 퍼옥시데이즈는 빛이있는 조명 민감한 필름을 노출하기 위해 생산, ECL 검색 시약의 반응을 catalyses. 막 그런 다음 다시 사용하는 세탁 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 대표 mPCR / RLB 결과. 1-6 샘플 1 긍정적인 컨트롤을 나타냅니다 - 그들 사이의 43 프로브 각각에 대해 적어도 하나의 긍정적인 프로브 신호가 있습니다. 각 대상 시퀀스 (U를 통해 A) 특이성을 최대화하기 위해 두 가지 프로브와 함께 발견됩니다. 프로브 A1과 A2는 각 샘플에 대해 긍정하고 필름을 orienting 도와 것으로 예상되는 종의 특정 프로브를 나타냅니다. 프로브 A1은 막의 하단에 반복됩니다. 샘플 7 8 부정적인 컨트롤입니다. 프로브 Q1이 Q2, T1과 T2가 primers 또는 뇌관 이합체의 제품의 가능성이 특이 현상이 바인딩을 나타내는 부정적인 컨트롤에 신호를 가지고 있습니다. 이러한 프로브 또는 primers의 다시 설계해야 할 것입니다. 프로브 C1, D1과 streptavidin - 퍼옥시데이즈의 공액 또는 chemiluminescent 기판의 일부가 아닌 구체적인 이해로 인해 가능성 멤브레인 전체 줄이 F1 쇼, 그러나 이것은 쉽게 진정한 긍정적인 프로브 신호를 구분할 수 있습니다. 프로브 D1과 D2는 다른 프로브에 비해 상대적으로 약한 신호를 가지고이 덜 효율적으로 증폭에 이르는 큰 amplicons 때문일 수 있습니다. 프로브 J2는 부정적인 것은 프로브 J1가 좋은 몇 가지 샘플 (1, 3, 4, 6, 39)입니다. 이것은 대부분이 샘플에 대한 J2 바인딩 사이트에서 돌연변을 나타냅니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

mPCR / RLB 방법은 PCR의 amplicons 다수의 동시 감지를 허용합니다. 때문에 chemiluminescent 프로브 기반 탐지의 높은 감도의 프라이머 쌍 다수와 함께 하나의 멀티 플렉스 PCR 반응은 DNA 템플릿을 증폭하는 데 사용할 수 있습니다. 더 프로브 신호가 남아있는 PCR 제품과 겔 전기 영동을 수행하는 하나 이상의 샘플과 취득이 없으면 문제가 PCR의 증폭이나 프로브 하이브 리다이 제이션과 함께인지 여부를 구별할 수 있습니다. 멤브레인 모든 프로브 신호가 약하거나 부재하지만, 겔 전기 영동이 성공적으로 PCR 증폭을 나타냅니다 어디에, 가능성은 멤브레인의 상표 문제, 이전에 사용 후 막의 잘못된 재생, 하이브리드화 또는 streptavidin 부화하는 동안 잘못된 온도, 또는 결함이 포함 streptavidin을 퍼옥시데이즈의 공액 또는 검출 시약. 컨트롤 샘플 개별 프로브가 거짓 부정적인 신호, 젤 기반 감지 및 이후의 시퀀싱과 함께 하나의 PCR은 PCR 제품의 증폭을 확인하고 프로브 바인딩 사이트에서 순서 변화를 찾는 수행할 수 있습니다 생산있을 수 나타내는 경우. 약하거나 부재 프로브 신호는 대형 amplicon 크기 때문일 수 있습니다 : 가능하면 모든 amplicons 비슷한 길이 미만 300 BP의해야합니다. amplicons의 보조 DNA 구조는 또한 가난한 프로브 바인딩을 생산 수 있으며, primers의 다시 디자인을 할거 수 있습니다. 개인 프라이머 또는 프로브 농도는 신호의 강도를 최적화하기 위해 다양한 수 있습니다. nonamplified primers 또는 뇌관 이합체 - 제품의 바인딩 프로브에 의한 거짓 긍정적인 신호는 젤 기반 감지 및 이후의 시퀀싱과 함께 하나의 PCR를 수행하여 조사 수 있습니다. 이런 경우, necessitated 수있는 프로브의 재설계. 프로브 구속력이 사이트에 포인트 돌연변이 약하거나 결석 신호가 발생할 수 있습니다. 각각의 증폭 제품의 두 가지 프로브를 허용하면 검색이 쉽습니다. 이 특성은 신중 뇌관 및 대상 DNA의 작은 시퀀스 변화를 감지 프로브 디자인으로 악용될 수 있습니다. 사용 가능한 제품 검색 다음의 멀티 플렉스 PCR 반응의 많은 방법이 있지만 요약, mPCR / RLB 낮은 설정 - 비용으로 높은 처리량과 저렴한되는 장점이 있습니다. 방법의 유연성은 어플 리케이션의 광범위한에서의 사용을 허용합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 5 &#39;아민 C6는 oligonucleotide 프로브를 수정 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S - 8875 </td><td> 0.5 M 솔루션은 산도 8.4까지 만들어 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S5881 </td><td> 0.1M 용액 </td></tr><tr><td> 20xSSPE 버퍼 </td><td> Amresco </td><td> 0810 - 4L </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 dodecyl 황산 (SDS) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> L - 4390 </td><td> 10 % 주식 솔루션을 만들고 압력솥하지, 사용하기 전에 1 주 최대 보관해야합니다 </td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E9884 </td><td> 산도 8.0 압력솥 조정 0.5 M 솔루션을 확인하십시오 </td></tr><tr><td> N - (3 - 디메틸 아미노) - N &#39;- ethylcarbodiimide 하이드로 클로라이드 (EDAC) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E7750 </td><td> 3.2 g의 EDAC 18 ML Millipore 물을 이용하여 사용하기 직전 20 ML 16 % 용액을 만들어 </td></tr><tr><td> BiodyneC 0.45 μm의 나일론 막 20x20 cm </td><td> 팔 생명 과학 </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deionised, 정화 물 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 액체 Pyroneg 세제 </td><td> 존슨 다이버시 </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin - 퍼옥시데이즈의 공액 </td><td> 로체 </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> 아머샴 ECL 검출 시약 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> 아머샴 ECL 검출 시약 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> OHP 투명 필름 </td><td> 기업 익스프레스 </td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td> 아머샴 hyperfilm ECL 고성능 chemiluminescent 필름 18x24 cm의 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> 얼음 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> mPCR / RLB 분석에 사용되는 표 1. 소모품. <table border="1"><tbody><tr><th> 장비 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> Hybaid Shake&#39;n&#39;Stack 오븐즈 (2) 압연 병 나일론 메쉬 분리 </td><td> 써모 과학 </td><td> HBSNSRS220 </td><td> 방법은 42 솔루션을 유지하기위한 시설이있는만큼 단일 오븐과 함께 수행할 수 있습니다 ° C 60 ° C 사용하기 전에 </td></tr><tr><td> 벨리 댄서 락을 플랫폼 </td><td> 스토벌 생명 과학 </td><td> 유로 BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100 - 45 </td><td></td></tr><tr><td> 열탕 목욕 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 흡입관 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 핫 플레이트 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 노출 카트리지 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> Z36 ,009 - 0 </td><td></td></tr><tr><td> X - 선 필름 개발자 </td><td></td><td></td><td> 또한 어두운 방에 대신 자동화의 트레이에있는 개발자, 해결사과 물을 사용할 수개발자. Lumino - 영상기는 Xray 필름 대신 사용할 수 있습니다 </td></tr></tbody></table> 표 2. 장비 mPCR / RLB 분석을 위해 필요합니다.

멀티 플렉스 pcr 및 역방향 라인 얼룩 하이브리드화 분석 (mpcr / rlb)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

멀티 플렉스 PCR / 역방향 라인 얼룩 하이브리드화 분석을 다시 사용할 수있는 나일론 막에 프로브 하이브 리다이 제이션 다음 한 멀티 플렉스 PCR 반응을 사용하여 43 샘플 43 분자 타겟까지 검색하실 수 있습니다. 프로브는 세포막에 고정을 허용하도록 수정 5 &#39;아민 있습니다. Primers은 streptavidin - 퍼옥시데이즈 및 감광성의 영화를 통해 chemiluminescent 기판을 사용하여 hybridized PCR 제품의 검출을 허용 5 &#39;비오틴 수정됩니다. 낮은 설치 및 소모품 비용이 기술은 저렴 (약 미국 2달러 샘플 당), 높은 처리량 (여러 세포막을 동시에 처리할 수)과 짧은 처리 시간 (약 10 시간)입니다. 기술은 여러 가지 방법으로 활용하실 수 있습니다. 여러 프로브는 단일 증폭 제품 내에 순서 변화를 감지하기위한 수 또는 여러 개의 제품은 후속 검색에 사용 하나 (혹은 이상) 프로브로 동시에 증폭하실 수 있습니다. 두 방법의 조합은 하나의 분석 시간에도 사용할 수 있습니다. 단일 대상 시퀀스에 대해 여러 프로브를 포함하는 능력은 분석은 매우 구체적인 수 있습니다. mPCR / RLB의 게시 응용 프로그램 methicillin - 내성 포도상 구균 3-5과 살모넬라균 SP 6, 연쇄상 구균 pneumoniae 7,8, 연쇄상 구균 agalactiae 9 enteroviruses 10,11, 신분의 분자 serotyping의 타이핑, 항생제 저항 유전자의 1,2의 탐지를 포함 Mycobacterium SP 12, 생식기 및 호흡기 13-15 16 기타 17 병원체 및 감지 및 mollicutes 18 신분의 감지. 그러나, 기술의 융통성은 응용 프로그램이 거의 무한하고 미생물의 분자 분석에 국한되지 않습니다 것을 의미합니다. mPCR / RLB에서 5 단계) 프리머 및 프로브 디자인, B) DNA 추출 및 PCR 증폭 C) 막의 작성, D) 하이브 리다이 제이션 및 감지되며, 분리막의 E) 리제.

43 분자 타겟까지 동시 검출을위한 저렴, 높은 처리량 방법을 설명합니다. mPCR / RLB의 응용은 미생물 입력 및 임상 샘플에서 여러 병원균의 감지를 포함합니다.

멀티 플렉스 PCR 및 역방향 라인 얼룩 하이브리드화 분석 (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/역선 블롯 하이브리드화(Reverse Line Blot Hybridization) 분석법을 이용하면 한 번의 Multiplex PCR 반응으로 43개 샘플에서 최대 43개의 분자 표적을 검출할 수 있습니다...

본 절차의 전반적인 목표는 멀티플렉스 PCR 반응을 통해 이전에 증폭된 특정 핵산 서열 패널의 존재 여부를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 아민 표지 DNA 프로브를 재사용 가능한 나일론 막에 고정함으로써 수행됩니다. 그 다음, 비오틴 표지 PCR 생성물을 막에 결합된 프로브와 peroxidase가 포함된 strep TTR에 하이브리드화합니다.결합된 PCR 산물에 접합체(conjugate)를 추가합니다. 다음으로, 화학발광 검출 시약을 첨가하고 막을 고감도 x-ray 필름에 노출시켜 결합된 PCR 산물을 검출합니다. 마지막으로, 하이브리드화된 PCR 산물을 제거하기 위해 막을 세척하여 향후 분석에 재사용할 수 있도록 합니다.최종적으로, X선 필름 상의 막 결합 프로브에 PCR 산물이 하이브리드화된 결과를 얻을 수 있습니다. 젤 전기영동, 실시간 PCR 또는 마이크로어레이와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 처리량이 높고 상대적으로 신속하며, 특수 장비가 필요하지 않고, 무엇보다 비용이 저렴하다는 점입니다. 시작하기 전에, 본 프로토콜의 서면 부분에 따라 다음 용액들을 준비하십시오.막을 준비하려면 오븐을 60 °C로 예열하십시오. 미니 블로터를 70% ethanol로 세척하고, oligonucleotide 프로브를 0.5 molar sodium bicarbonate에 희석하여 최종 농도 2 pmol/µL, 부피 200 µL가 되도록 조절하십시오. 나일론 막을 15 by 15 cm 크기로 자른 후, 연필과 자를 사용하여 막 상단에 0.5 cm 간격의 공간을 표시하고 그곳에 실험 세부 사항을 작성하십시오.막을 20 milliliters의 갓 제조한 16%EDAC 용액과 함께 플라스틱 백에 넣어 밀봉하고 실온에서 10분 동안 흔들어 줍니다. 탈이온수로 막을 30초 동안 세척합니다. 다음으로, 막 전체에 걸쳐 채널이 형성된 미니 블로터(mini blotter)에 막을 배치합니다.그 다음 지지 쿠션을 배치하고 블롯터를 닫습니다. 채널 내의 모든 액체를 완전히 흡입하여 제거합니다. 1번과 45번 레인에 0.5 molar sodium bicarbonate 150 microliters를 채웁니다.각 프로브 용액 150 µL를 사용하여 2번부터 44번 레인까지 순서대로 채우되, 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 채널에 기포가 발생한 경우, 피펫을 그대로 둔 상태에서 용액을 빠르게 흡입하여 기포가 피펫 팁 상단으로 떠오르게 한 뒤 다시 시도하십시오. 상온에서 5분 동안 배양하십시오.프로브 용액을 흡입하여 제거합니다. 멤브레인을 꺼내어 실온에서 0.1 molar 수산화나트륨 250 milliliters로 9분 동안 세척합니다. 이어서 멤브레인을 2배 농도 SSPE 250 milliliters로 30초 동안 세척합니다.하이브리드화에 즉시 사용하지 않을 경우, 60°C 오븐에서 5분 동안 250 mL의 예열된 2x SSPE 0.1% SDS로 두 번 세척하십시오. 실온에서 240 mL의 20 mM EDTA로 멤브레인을 20분 동안 세척하십시오. 그 후, 남은 10 mL의 20 mM EDTA와 함께 멤브레인을 플라스틱 백에 밀봉하여 4°C에서 보관하십시오.마지막으로, pyro neck 세제와 브러시를 사용하여 mini blosser를 세척하고 헹군 뒤 다중으로 건조시킵니다. 관심 표적의 PCR 증폭은 본 시연에서 설명하지 않으나, 프로 하이브리드화 이전에 반드시 수행되어야 합니다. 하이브리드화 절차를 시작하기 전에, 본 프로토콜의 서술된 부분에 따라 다음 용액들을 준비하십시오.오븐 하나는 60 °C로, 다른 하나는 42 °C로 설정하여 켭니다. 핫플레이트 위의 큰 비커에 물을 넣고 끓입니다. 70% ethanol로 미니 블로터를 세척합니다.다음으로 2배 SSPE 0.1%SDS 10 milliliters를 작은 용기에 분주합니다. 그런 다음 번호가 매겨진 튜브에 2배 SSPE 0.1%SDS 150 microliters를 넣고, 각 PCR 산물 20 microliters를 추가합니다. 스티로폼 홀더를 사용하여 PCR 산물을 100 degrees Celsius에서 10 minutes 동안 가열한 후, 즉시 얼음 위에 올려 최소 five minutes 동안 방치합니다.60°C 오븐에서 2배 SSPE 0.1% SDS 용액 240 mL로 멤브레인을 5분 동안 세척합니다. 백킹 쿠션이 있는 미니 블로터에 멤브레인을 놓습니다. 채널이 수직으로 향하도록 배치하십시오.미니 블로터 채널에서 과잉 액체를 흡입하여 제거합니다. 남은 150 µL의 2배 SSPE 0.1%SDS를 첫 번째와 마지막 채널에 추가합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 가열하여 변성시킨 PCR 산물을 2번부터 44번 채널까지 순서대로 추가합니다.하이브리드화가 일어날 수 있도록 미니 블로터를 60 °C 오븐에 평평하게 놓고 1시간 동안 둡니다. 각 채널의 액체를 분사합니다. 그런 다음 미니 블로터에서 멤브레인을 제거합니다.미리 데워둔 250 milliliters의 2배 SSPE, 0.5%SDS 용액으로 60 degree Celsius 오븐에서 10분 동안 두 번 세척합니다. 42 degrees Celsius의 2배 SSPE 0.5%SDS로 나일론 지지체를 적신 후 이를 사용하여 막을 말아 올립니다. 말아 올린 막을 롤러 튜브에 넣고, 막이 내부 표면에 밀착되도록 펴줍니다.42°C에서 2배 SSPE, 0.5% SDS 15 mL에 peroxidase 접합 strept AD 3 µL를 첨가하고 이를 튜브에 넣습니다. 캡을 단단히 잠그고 42°C의 롤러 오븐에서 60분 동안 배양합니다. 이때 멤브레인이 팽팽해지지 않도록 롤링 방향을 확인하십시오.주기적으로 누출 여부를 확인하십시오. 미니 블로터를 pyro neck 세제와 물로 세척한 후 건조시킵니다. 롤러 튜브에서 멤브레인을 제거하고, 나머지 2회의 SSPE 0.5%SDS 용액을 사용하여 42°C에서 10분 동안 두 번 세척합니다.그 다음, 실온에서 5분 동안 SSPE로 2회 세척합니다. 두 오븐의 온도를 80 °C로 올리고, 한쪽 오븐에 1% SDS 500 milliliters를 넣어 예열합니다. ECL 용액을 조제하고 막을 ECL 검출 용액에 2분 동안 반응시킵니다.그 다음 막을 필름에 노출시키고 현상합니다. 막을 재생해야 하는 경우, 필요에 따라 노출 시간을 더 길게 또는 짧게 하여 노출 과정을 반복합니다. 80 °C의 1% SDS 250 milliliters로 30분 동안 두 번 세척합니다.그런 다음 실온에서 20 millimolar EDTA 240 milliliters로 15분 동안 세척합니다. 20 millimolar EDTA 10 milliliters와 함께 막을 플라스틱 백에 밀봉하여 4 °C 냉장고에 보관하여 추후에 재사용하십시오. 이 그림은 멀티플렉스 PCR 역선 블롯 하이브리다이제이션 분석 결과를 보여줍니다. 샘플 1번부터 6번은 그 사이의 양성 대조군을 나타냅니다.43개의 프로브 각각에 대해 적어도 하나의 양성 프로브 신호가 나타납니다. 특이성을 최대화하기 위해 각 타겟 서열 A부터 U까지는 두 개의 서로 다른 프로브로 검출됩니다. 1과 2는 종 특이적 프로브를 나타내며, 이는 각 샘플에서 양성으로 나타날 것으로 예상되어 필름 프로브의 방향을 잡는 데 도움을 줍니다.멤브레인 하단에 하나가 반복됩니다. 샘플 7과 8은 음성 대조군입니다. 프로브 Q1, Q2, T1 및 T2가 음성 대조군에서 신호를 나타내는 것은 프라이머의 비특이적 결합 또는 프라이머 이량체 형성 가능성을 시사합니다.이러한 프로브나 프라이머의 제품 재설계가 필요할 것입니다. 프로브 C1, D1 및 F1은 멤브레인 전체에 걸쳐 스트리킹(streaking) 현상을 보이는데, 이는 스트렙타비딘 퍼옥시다아제 접합체 또는 화학발광 기질의 일부 비특이적 흡착으로 인한 것으로 보입니다. 하지만 이는 실제 양성 프로브와 쉽게 구별됩니다. 신호의 경우, 프로브 D1과 D2는 다른 프로브들에 비해 상대적으로 약한 신호를 나타냅니다.이는 더 큰 앰플리콘으로 인해 증폭 효율이 낮아졌기 때문일 수 있습니다. 마지막으로, 프로브 J one은 양성인 반면 여러 샘플에서 프로브 J two는 음성으로 나타났습니다. 이는 해당 샘플들의 J two 결합 부위에 돌연변이가 발생했음을 의미할 가능성이 매우 높습니다.DNA 추출부터 PCR 프로 하이브리다이제이션까지 이 기술을 숙달하고 나면, 결과 해석과 멤브레인 재생을 모두 10시간 이내에 완료할 수 있습니다.

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연구

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