추적 연구 Qdot Nanocrystals와 Murine 골수 파생 돌기 세포의 생성 및 라벨링

이 절차의 전반적인 목표는 Q dot 나노 결정을 사용하여 이미징 연구를 위해 수지상 세포를 준비하는 것입니다. 이는 먼저 골수 세포를 murn, femurs 및 tibias에서 분리함으로써 이루어집니다. 다음으로, 골수 세포 배양은 GM CSF가 있는 곳에서 수지상 세포로의 세포 분화를 촉진하도록 설정됩니다.

그런 다음 수지상 세포는 8일 후에 골수 세포 배양에서 회수됩니다. 절차의 마지막 단계는 형광 Q 나노 결정으로 세포를 염색하는 것입니다. 궁극적으로, 밝게 염색된 수지상 세포는 형광 현미경으로 시각화할 수 있습니다.

GFP 태그 수지상 세포 사용과 같은 다른 방법과 비교하여 이 기술을 사용하는 주요 이점은 Q 점 나노 결정이 아세톤과 같은 유기 용매로 염색한 후에도 형광을 유지한다는 것입니다. 이 방법은 수지상 세포 생물학자가 다양한 질병 또는 다른 질병의 맥락에서 이러한 세포의 이동 특성과 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 염색 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Maria Ali입니다.

희생 후 뼈 끝을 자르지 않고 두 마리의 쥐에서 경골과 대퇴골을 조심스럽게 절개합니다. 그런 다음 티슈 페이퍼를 사용하여 뼈에서 부착된 모든 조직을 청소하고 부러지지 않도록 주의합니다. 생물 안전 후드에.

35mm 페트리 접시에 70% 에탄올을 채운 다음 뼈를 에탄올에 10분 동안 담급니다. 뼈를 멸균한 후 에탄올에서 뼈를 회수하고 새 페트리 접시에서 5분 동안 자연 건조시킵니다. 이제 대퇴골 중앙과 경골의 가장 얇은 끝부분을 잘라냅니다.

멸균 주사기를 사용하여 뼈 안쪽에 1ml의 RPMI 배지를 주입합니다. 15ml 튜브에 세포 현탁액을 모으고 스윙 버킷 로터가 있는 원심분리기에서 섭씨 4도에서 300배 G로 10분 동안 원심분리하여 RPMI 배지로 두 번 세척합니다. 마지막 세척 후, resus는 2ml의 CK 용해, 완충액에 세포를 현탁시키고 적혈구를 제거하기 위해 실온에서 5분 동안 배양합니다.

다음으로, 13ml의 RPMI와 10%FBS를 추가하고 이전과 동일한 원심분리기 설정으로 이 배지에서 세포를 두 번 더 세척합니다. 세포를 세고 농도를 2배, 10으로 조절하여 밀리리터당 5번째 세포로 조정합니다. RPMI와 10%FBS를 함께 사용하여 재조합 쥐 G-M-C-S-F를 최종 농도인 밀리리터당 20나노그램으로 추가합니다.

그런 다음 이 현탁액 10ml를 멸균 미생물 품질 10cm 페트리 접시 및 배양액에 추가합니다. 이산화탄소 인큐베이터의 세포 현탁액. 3일 후, 준비된 각 플레이트에 10ml의 RPMI와 10%FBS를 1밀리리터당 20나노그램의 재조합 쥐 G-M-C-S-F를 추가합니다.

3일 후, 각 페트리 접시에서 10ml의 세포 현탁액을 회수하고, 동일한 조건에서 세포를 원심분리하고, 페트리 접시에서 회수한 것과 동일한 부피의 RPMI와 10%FBS로 펠릿을 재현탁하고 새로운 재조합 쥐 G-M-C-S-F로 보충합니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 원래의 각 페트리 접시에 다시 넣고 이틀 동안 이틀 동안 세포를 이산화탄소 배양기에서 배양합니다. 배양에서 8일 후, 페트리 접시를 새 배지로 세척하여 부유하고 느슨하게 부착된 세포를 회수합니다.

그런 다음 수집된 세포에 Q tracker 6 55 cell labeling kit를 사용하여 10 나노 몰 농도의 Q 나노 결정으로 쥐 골수 유래 dcs의 5배부터 10배부터 6분의 1까지 라벨을 부착합니다. 먼저 키트 구성 요소 A와 B를 각각 5마이크로리터씩 einor 튜브에 넣고 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 RPMI 1ml와 10%FBS를 넣고 30초 동안 튜브를 소용돌이칩니다.

그런 다음 5번째에 10을 5곱하기 더합니다. 0.5 밀리리터의 RPMI와 10%FBS를 첨가한 Dcs를 einor 튜브에 현탁시키고 D 용액의 세포를 섭씨 37도에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 이전과 동일한 조건에서 RPMI와 10%FBS로 세포를 두 번 세척하고 RPMI에서 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

이 그림은 dcs의 형광 마이크로 사진의 예를 보여줍니다. 라벨링 직후, 라벨링된 세포 한 방울을 유리 슬라이드에 증착하고 커버 슬립으로 덮었습니다. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 샘플을 평가했습니다.

이 그림에서는 48시간 후 체외 성숙 dcs의 형광 마이크로 사진이 라벨링된 것을 볼 수 있습니다. Dcs는 이산화탄소 인큐베이터의 슬라이드 배양 챔버에서 밀리리터당 100나노그램, LPS 및 밀리리터당 20나노그램, TNF 알파로 48시간 동안 배양되었습니다. 그런 다음 샘플을 아세톤으로 고정한 PBS로 세척하고 DPI로 카운터 스테인하고 형광 현미경을 사용하여 평가했습니다.

in vitro에서 성숙 된 표지 된 dcs를 유세포 분석으로 분석하고, Q 점 염색 된 세포는 FL 3 채널 Q에서 염색 및 염색되지 않은 강한 신호를 제공합니다. Dc는 성숙 마커인 CD 86 및 CD 40에 대한 특정 항체로 추가로 염색하고, 이소형대조군 세포를 유세포 분석으로 분석했습니다. 또한, IL 6 및 산화질소 수준은 성숙한 Q 염색 DCS 및 대조군의 상등액에서 측정되었습니다.

여기에서는 절개된 조직에서 라벨링된 DCS의 대표적인 그림이 라벨링된 것으로 표시됩니다. 성숙한 dcs를 C 57 블랙 6 마우스에 정맥 주사했습니다. 3일 후, 생쥐를 제물로 바치고 비장을 채취했습니다.

OCT 및 8미크론 절편에 내장된 스냅 동결은 저온 유지 장치를 사용하여 준비되었습니다. 그런 다음 샘플을 아세톤으로 고정하고 DPI로 대조염색한 다음 형광 현미경을 사용하여 평가했습니다. 다음 절차를 따릅니다.

다른 자극을 가진 항원 자세 또는 성숙과 같은 다른 방법은 다른 성숙 자극에 대한 반응으로 수지상 세포의 이동과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행 할 수 있습니다.