Name: Vibratome는 Corti의 포유 동물 조직의 Cytoarchitecture의 향상된 보존을위한 Sectioning (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 배우세요 Corti 기관의 세포 구조 보존을 위한 vibratome 절단법을. 면역조직화학 및 공초점 현미경을 활용하여 정확한 세포 정량화가 가능한 신경과학 연구 방법입니다.

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저자는 아가로 오스 비즈를 사용하여 섹션을 탑재하는 제안에 대한 공촛점 현미경 박사 지앤 장을위한 어린이 연구소 이미징 코어의 사용을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 NIH에 의해 투자 DC010387 부여했다.

1. 내부의 귀를 분리 및 고정 <ol><li> Corti의 장기에서 세포 patterning의 분석을 위해, 안락사가 적절하게 배아 또는 성인 개최. </li><li> 막의 내이 (内耳)를 포함, 귀의 캡슐을 절개하다. 마우스에서, 이것은 쉽게 (E) 일 14.5 세 이상이있는 E0.5가 질 플러그가 발견했습니다되는 날이 배아에서 배아에서 할 수 있습니다. 귀의 캡슐의 절개는 정중선에서 잘린과 두개골의 개방에 의해 첫번째 수행됩니다. 각각의 귀를 (그림 1A) 노출 두뇌를 제거합니다. 내부 귀는 그대로 사용 포셉 (예 : 더몬트 # 5, 그림. 1B)를 했대 수 있습니다. 이미지 Corti 기관의 경우, 귀의 캡슐과 관련된 모든의 연결 및 결합 조직의주의 제거가 필요하지 않습니다. </li><li> 4 부드러운 락을과 4 % paraformaldehyde에 집중 (PFA)에 의해 전체 내부 귀를 수정 ° C 1.8 ML 나사 덮인 NUNC Cryo - 튜브 튜브 또는 기타 적절한 크기의 용기에 하룻밤. PFA 솔루션이 필요 때까지 -20 ° C에 보관 ddH 2 0에서 신선한하여야한다. </li><li> 그 다음날, 1X 인산 세 변화로 정착액을 씻어 호수 (PBS)를 버퍼. 처리를위한 준비까지 조직은 개월 일 최대 살균 1X PBS에 저장할 수 있습니다. 성인 조직에 대한 4 10 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.27 M)에 decalcify ° rinsing 및 1X PBS에 보관하여 다음에 오일에 대한 C,. </li></ol> 2. vibratome 섹션을 절단 <ol><li> 1X PBS에서 4% 낮은 녹는 포인​​트 아가로 오스를 준비합니다. 아가로 오스는 솔루션에까지 1X PBS, 전자렌지에 낮은 용융 점 아가로 오스를 추가합니다. 솔루션을 통해 거품하지 않는 부탁해 - 정기적으로 전자 레인지와 섞어 소용돌이 밖으로 가져가라. 사용할 준비가 될 때까지 55 ° C의 물을 욕조의 솔루션을 유지. </li><li> 포셉를 사용 1X PBS 솔루션과 필 - A - 웨이 포함 금형의 하단에있는 위치에서 내이 (内耳)를 제거합니다. 금형에서 Pipet 거리 초과 1X PBS. 액체 4퍼센트 낮은 녹는 포인​​트 아가로 오스 (그림 2A) 많이있는 조직을 커버하기 위해 금형을 입력합니다. </li><li> 해당 비행기에 sectioning에 대한 내이 (内耳)를 놓습니다. 난 그게 머리에 현장에 남아 있던 것처럼 귀의 캡슐의 위치를​​ approximating 및 가로 비행기에 sectioning에 의해 Corti의 기관의 좋은 크로스 섹션을 획득했습니다. 그것이 눈에 보이는 측면 반 원형 운하 (그림 2B)로, 옆으로 볼 수 있도록 성인, 위치, 내이 (内耳)를 E14.5 배아하십시오. 귀의 캡슐의 사후 옆 형성 라인 (그림 2A, B) sectioning의 의도된 비행기에서 45도 각도로 약되도록 내이 (内耳)를 각도. 귀의 캡슐이 귀의 캡슐의 지느러미 부분이 상단에 너무 많이하면 달팽이관의 기초 설정은 하단 (화살촉, 그림. 2B)에 위치하고 앞쪽에 반 원형 운하 (ASC)이되어야한다 상단 (그림 2B)에 있습니다. </li><li> 아가로 오스는 30 분 이내에 RT로 설정합니다. 전송 필 - 어웨이 금형은 ° C 섹션 준비까지 4 임베디드 조직을 포함하는. sectioning가 다음날까지 연기되는 경우, 1X PBS는 1X PBS에 담가 젖은 종이 타월을 포함 상자에 금형 및 저장소의 아가로 오스를 충당하기 위해 추가합니다. </li><li> 플라스틱 금형 벗겨내는 거지. 면도날을 사용하여 내이 (内耳)의 조직을 포함하는 아가로 오스 상자를 잘라. 섹션의 비행기가 똑바로 아가로 오스 블록이 아래로 접착되는 표면 될 블록의 반대편에 평행하게되도록하는데주의를 기울여야. 아가로 오스가 조직에 침투하지 않기 때문에, 조직이 잘 지원되도록, 조직 주위에서 너무 많은 아가로 오스를 잘라하지 않습니다. </li><li> 절단 표면에 블록을 연결하는 superglue를 사용합니다. </li><li> vibratome으로 40-100 μm의 두께로 섹션을 참조하십시오. 1X PBS, 0.1 % TritonX - 100 가득한 조직 문화 요리에 섹션을 저장합니다. 달팽이 나선형을 통해 대표적인 부분은 그림에 표시됩니다. 2C. </li><li> 조직의 아가로 오스 멀리 해부하다하는 포셉를 사용합니다. 아가로 오스는 조직을 침투하지 않지만 단지 내이 (内耳)의 바깥 표면에 붙어 것입니다. </li><li> 원하는 경우, 수영장, 아가로 오스 프리, sectioned 조직은 조직의 과도한 전단을 방지하기 위해 큰 구멍이 열고있는 pipet을 사용합니다. 또는 24 - 잘 조직 문화 요리 - 여러 다른 조직에 여러 항체 얼룩을 수행하는 경우, 섹션은 16 구성할 수 있습니다. </li></ol> 3. 항체 얼룩의 vibratome 섹션 항체는 얼룩 진행합니다. 솔루션에 무료 부동 전체 - 마운트의 프로세스 섹션. 아래 Corti의 기관의 기둥 세포의 S100 표시에 대한 예제 항체 얼룩 프로토콜이지만, 프로토콜은 모든 항체에 대해 사용할 수 있습니다. 별도의 언급이없는 한 모든 세척은 상온에서 실시하고 있습니다. <ol><li> 멀티 잘 조직 문화 요리에서 30 분 대한 PBT의 부드러운 락을 (1X PBS, 1 % 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X - 100) 무료 - 부동 섹션을 품어. </li><li> 이전 솔루션과 블록 자유 층에서 Pipet30 분 대한 PBT + 정상 염소 혈청에 부드러운 락을 (50 μl NGS / 1 ML PBT)와 섹션을 oating. </li><li> 이전 솔루션에서 Pipet와 PBT + NGS (PBT + NGS의 S100의 1:200 희석)에 희석 기본 항체를 추가합니다. 4 밤새 품어 ° C를 부드러운 락을 함께. </li><li> 기본 항체 용액에서 Pipet. , 5 분 배 씻으십시오. PBT와 다음, 4X, 30 분. PBT와 함께. </li><li> PBT + NGS와 블록, 30 분. </li><li> PBT + NGS의 희석 찬란 - 복합 이차 항체 (염소의 사육)와 부화. 4 밤새 품어 ° C, 또는 몇 시간, RT, 부드러운 락을. </li><li> 차 항체 용액에서 Pipet. , 5 분 배 씻으십시오. 다음, 4X, 30 분. PBT와 함께. </li><li> 마지막 PBT에서 Pipet은 씻어과 핵 counterstain를 포함하는 적절한 수성 장착 매체로 바꿉니다. </li></ol> 4. 슬라이드 및 공촛점 현미경에 장착 섹션 coverslip으로 두꺼운 부분을 깔아 뭉 갠다고 방지하기 위해, 각각의 섹션을 장착하면, 공백은 현미경 슬라이드와 coverslip 사이에 삽입해야합니다. 아래 두꺼운 vibratome 섹션을 장착 두 가지 다른 방법은 다음과 같습니다 <ol><li><ol type="a"><li> 스페이서는 조직 섹션 주변 광장에 진공 그리스의 림을 배치하여 만들 수 있습니다. 따라서 coverslip를 내려놓고 때 coverslip의 가장자리는 진공 그리스와 함께 날인 것입니다. 단단히 슬라이드에 그것을 준수하여 엄지와 coverslip의 가장자리 아래로 누르십시오. 진공 그리스는 coverslip의 가장자리 주위에 깔끔하게하고 균일하게 존재하는 경우, 슬라이드가 거꾸로 공촛점 현미경에서 사용하기 위해 충분한 날인 것입니다. </li><li> 또는 공백이 알려진 메쉬 크기의 아가로 오스 크로마 토그래피 수지 (예 : Affi - 젤 블루 젤, 바이오 래드 등)를 사용하여 만들 수 있습니다. coverslip가 배치됩니다 네 개의 모서리 각 현미경 슬라이드에 수지 Pipet 1 μl. 수지의 4 개의 점을 한 가운데에 Pipet 한 조직 섹션 및 장착 미디어. Coverslip. 거꾸로 공촛점 현미경을 사용하는 경우 nailpolish를 사용하여 현미경 슬라이드에 coverslip을 봉쇄. </li></ol></li><li> 공촛점 현미경을 사용하여 스테인드 vibratome 슬라이스의 광학 부분을 구합니다. Corti의 기관 내에 다양한 셀 유형을 수치, 정의 단계 크기 (1.5 및 3 μm의 사이)에서 Z - 스택을 얻습니다. 섹션 핵 염색 (3.8 단계)와 카운터 묻은해야합니다. 이미지 공촛점 이미지 모음 후에 컴퓨터 화면에 검사하실 수 있습니다. 세포 이미지가 Z - 스택을 통해 순차적으로 검사 있으므로 수동으로 핵의 모양과 실종 사건을 관찰 할 계산하실 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 기둥과 Deiters '세포에 존재하고, 핵 염색 (그림 3A - F)와 counterstained S100 단백질에 대한 스테인드 vibratome 섹션을 통해 대표 공촛점 Z - 스택. 각 패널은 패널, 3 μm의 - 단계에서 촬영한 공촛점 이미지 공촛점 이미지 vibratome 섹션 패널 F vibratome 섹션 내에서 가장 내부 얻은 공촛점 이미지의 표면에 가까운 얻을. Corti의 기관의 형태는 최소한 방해가 나타납니다. 특히, 기둥 세포의 세포질 확장이 깨진되지 않습니다. Z - 스택 (그림의 3A 층)를 통해 기둥 세포 핵의 모양과 실종 사건을 지적하여 모두 내부와 외부 기둥의 휴대폰 번호는 (. - F 번호, 그림 3A 참조) 계산하실 수 있습니다. 공촛점 이미지마다 각각의 셀 타입의 소수으로 인해,이 접근법은 Corti의 기관 내에서 가장 셀 유형을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 손대지 15 주 된, 어른 내부 귀는 귀의 캡슐으로 쌌다. (A) 오른쪽 귀의 캡슐 (괄호)는 두뇌의 제거 후, ​​머리 내부의 밴티지 포인트에서 조회, 두개골으로 쌌다. 앞쪽에는 오른쪽에 있습니다. (B) 손상, 15 주 된 내부 귀 두개골의 절개 후. 왼쪽 내이 (内耳)의 측면 표면은 표시되며 오른쪽 내이 (内耳)의 중간 표면은 볼 수 있습니다. 레이블은 앞쪽에 반 원형 운하 (ASC), 공동 (달팽이관), 그리고 아야 (난원 창)의 위치를​​ 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 필 - 어웨이 금형의 중심에 아가로 오스에 포함된 15 주 된 성인에서 (A) 전체 내이 (内耳). 섹션의 대상 비행기가 표시됩니다. 전에 삽입하기 15 주 된, 전체 내이 (内耳)의 (B) 클로즈업 이미지. 막의 미로 더 명확하게 본 수 있도록 주위의 뼈 부분은 거리를 해부했습니다. 측면 세미 원형 운하 (LSC), 앞쪽에 세미 원형 운하 (ASC), 그리고 달팽이관 (공동) (화이트 곡선) 추적하고 있습니다. 달팽이관 (화살촉)의 기초 설정 및 섹션 (점선)의 목적으로 비행기가 표시됩니다. (C) 대표 크로스달팽이관을 통해 S - 절을 참조하십시오. 달팽이 덕트 관통 단면에서 Corti (OC)의 기관이 박스는, 자국 vascularis (SV)는 괄호이며, Reissner의 막은 (RM) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. P21에서 야생 타입 마우스 Corti의 기관. 기둥 세포와 Deiters을 시각화하기 위해 Corti의 S100 항체 묻은 기관을 통해 3 μm의 스텝 크기를 '세포에서 (AF) 선형 공촛점 시리즈. 시리즈의 마지막에 처음부터 내부 및 외부 기둥 세포의 카운트 번호가 있습니다. 약어 : IHC (내부 머리 세포), aIHC (인접 내부 머리 세포), OHC (외부 머리카락 세포), PC (기둥 세포), DC (Deiters '셀).

<ol><li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+of+the+organ+of+Corti%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li>
<li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+innervation+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li>
<li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li>
<li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li>
<li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li>
<li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li>
<li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty2%2C+a+mouse+deafness+gene%2C+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li>
</ol>

동물 실험 위스콘신 IACUC의 메디컬 칼리지에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

immunohistochemistry와 공촛점 이미징 다음 vibratome sectioning의 절차는 최소한의 조직 손상 Corti의 기관의 시각화를위한 수 있습니다. 분명 vibratome 섹션에서 내부 지역에서 가져온 공촛점 이미지는 고정 아티팩트에 의해 제한됩니다 세포 형태 우수 보전을 보여줍니다. 이러한 기둥 세포의 세포질 확장 나누기로 가끔 세포 중단이 (표시되지 않음) 관찰 되었으나 vibratome 섹션의 두 컷 - 표면에 가까운 촬영 공촛점 이미지, 내부 지역의 이미지에서 자주 구별할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 간단하고, 주요 장비 아이템 - vibratome 기계 및 공촛점 현미경 - 일반적으로 대부분의 수사관으로 액세스할 수있는 공통 장비 아이템입니다. 또한,이 접근법은 Corti의 기관에서 특정 얼룩을 보여줍니다 모든 항체에 대해 사용할 수 있습니다. 사실,이 방법의 주요 한계는 항체의 특이성이며,이 프로토콜의 3 단계로 수정 주어진 항체가 특정 얼룩집니다 있도록해야 할 수도 있습니다. 요약, 난...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> Leica 블레이드 마이크로톰 진동 VT1000S </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 자이스 혈구 LSM510 레이저 스캐닝 공촛점 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 학생 더몬트 # 5 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure 낮은 녹는 포인​​트 아가로 오스 </td><td> Invitrogen </td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td> 필 - A - 웨이 포함 금형 </td><td> Polysciences </td><td> 18986 또는 18646A </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 568 염소 안티 - 토끼 IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A - 11036 </td><td> 1:1000 희석 </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> 벡터 실험실 </td><td> H - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO - PRO - 1 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td> 진공 그리스 </td><td> 어부 </td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td> Affi - 젤 블루 젤 </td><td> 바이오 래드 </td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibratome는 corti의 포유 동물 조직의 cytoarchitecture의 향상된 보존을위한 sectioning

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Corti의 포유류의 기관은 mechanosensory 머리 nonsensory 지원 세포의 높은 주문한 세포 모자이크입니다 (1,2에서 검토)이 세포 모자이크. 시각화는 종종 Corti의 기관 간 sectioned되어 있어야합니다. 특히, 그의 핵 세포와 관련하여 basally 있습니다 nonsensory 기둥과 Deiters &#39;세포는, Corti의 오르간을 교차 sectioning없이 시각 수 없습니다. 그러나, 기둥 및 Deiters &#39;세포의 미세 세포질 프로세스를 포함 Corti의 포유류의 기관의 섬세한 cytoarchitecture는, 표준 immunohistochemical 얼룩 기술과 호환되는 이러한 파라핀과 cryo - sectioning 같은 일상 histological 절차에 의해 보존하기가 어렵습니다. 난 여기 공촛점 현미경 다음 달팽이관 전체 마운트 이러한 vibratome 섹션 immunohistochemical 얼룩의 sectioning vibratome 구성된 단순하고 강력한 절차를 설명합니다. 이 절차는 마우스 사지 봉오리, zebrafish 굿, 간, 췌장, 그리고 마음 (선택한 예제 3-6 참조)를 포함하여 여러 기관의 immunhistochemical 분석 널리 사용되고 있습니다. 또한이 절차는 배아와 성인 생쥐 일곱 모두 Corti의 돌연변이 및 제어 장기 기둥 휴대폰 번호의 이미징 및 quantitificaton 모두 sucessful했다. 이 방법은 그러나, 현재 널리 Corti의 포유 동물 장기를 검사하는 데 사용되지 않습니다. Corti의 성인용 기관의 벌금 cytoarchitecture의 향상된 보존을 제공하고 다양한 세포 유형의 부량 수 있도록 모두이 절차에 대한 가능성을 설명합니다.

immunohistochemistry과 공촛점 현미경 다음 Corti의 기관을 sectioning vibratome의 간단한 절차 설명합니다. 이 절차는 Corti의 포유 동물 장기의 벌금 cytoarchitecture 개선 보존을 허용하고, 결과적으로 세포 유형의 정확한 양을 정함을 허용합니다.

Vibratome는 Corti의 포유 동물 조직의 Cytoarchitecture의 향상된 보존을위한 Sectioning

포유류의 코르티 기관(organ of Corti)은 기계적 감각을 담당하는 유모 세포와 비감각성 지지 세포가 고도로 정렬된 세포 모자이크 구조를 이루고 있습니다(1, 2에서 검토됨). ...의 시각화는

다음 실험의 전체적인 목적은 세포 구조를 최대한 보존하면서 코르티 기관(organ of corti)을 이미징하는 것입니다. 이는 해부 및 고정된 내이를 바이브라톰(vibratome)으로 절편화하여, 와우당 절단면의 수를 최소화하면서 두꺼운 절편을 얻음으로써 달성됩니다. 이렇게 얻은 바이브라톰 절편은 면역조직화학 염색을 거치며, 이를 통해 코르티 기관 내의 다양한 세포 유형과 세포 구조를 식별할 수 있습니다.다음으로, Z-축 위치를 정의하는 고해상도 이미지를 얻기 위해 절편을 마운트하고 공초점 현미경으로 촬영합니다. 각 두꺼운 Vibram 절편을 통해 얻은 결과는 절단 과정에 의한 손상을 최소화하면서 와우 기관(organ of corti) 내의 세포와 구조를 공초점 현미경으로 관찰할 수 있게 합니다. 파라핀 및 동결 절편법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 달팽이관의 물리적 손상을 최소화하여 와우 기관의 세포 구조를 더 잘 보존할 수 있다는 것입니다. 내이를 분리하기 위해, 먼저 면도날을 사용하여 안락사시킨 성체 마우스의 머리를 절단합니다.정중선을 따라 두개골을 열고 핀셋을 사용하여 조심스럽게 뇌를 제거하여 각 귀를 노출시킨 후, 양측 내이를 떼어냅니다. 내이를 신선한 4% paraformaldehyde가 들어있는 크라이오 튜브 바이알에 담그고, 4°C에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 다음 날, 1x phosphate buffered saline으로 고정액을 세 번 세척하고, 4°C에서 10% EDTA에 5일 동안 배양하여 성체 조직을 탈칼슘화합니다.내이를 1× PBS로 헹구고 처리 준비가 될 때까지 보관하십시오. agarose를 1× PBS에 넣고 agarose가 완전히 녹을 때까지 전자레인지로 가열하여 4% 저융점 agarose를 만듭니다. 녹은 agarose는 사용 전까지 55 °C 항온수조에 보관하십시오.포셉을 사용하여 PBS에서 내이를 꺼낸 후, 박리 가능한 임베딩 몰드 바닥에 배치하십시오. 남아 있는 액체는 피펫으로 제거하고, 몰드에 Mol Aros를 채워 내이를 완전히 덮어 코르티 기관의 횡단면을 생성하십시오. 내이의 외측 반고리관이 측면에서 보이도록 배치하십시오.달팽이관의 가장 후방 영역으로 형성된 선이 의도한 절단면과 45도 각도를 이루도록 내이를 배치합니다. 아가로스(agarose)가 응고되면 플라스틱 몰드를 벗겨냅니다. 면도날을 사용하여 과도한 아가로스를 다듬어 정육면체 형태로 만듭니다.조직이 충분히 지지될 수 있도록 주변에 적절한 양의 agar를 남겨둡니다. 섹셔닝 단계에서, 순간접착제를 사용하여 agar 큐브의 바닥면을 Vibram 절단 표면에 부착합니다. 40~100 µm 두께로 절편을 만들고, 0.1% Triton X 100이 포함된 1x PBS가 담긴 접시에 절편들을 수집합니다. 이때 핀셋을 사용하십시오.조직 절편에서 aros를 분리합니다. 입구가 넓은 피펫 팁을 사용하여 절편을 0.1% Triton X 100이 함유된 1배 PBS가 들어있는 접시로 옮기고, 조직 배양 플레이트에서 항체 염색을 진행합니다. 항체 염색이 완료되면 조직 절편을 현미경 슬라이드에 마운팅합니다.두꺼운 조직 절편이 눌리는 것을 방지하기 위해, 커버슬립과 슬라이드 사이에 공간을 만들 수 있도록 절편 주변에 진공 그리스를 정사각형 모양으로 도포합니다. 조직 절편을 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 커버슬립의 가장자리를 단단히 눌러 밀봉합니다.또는, 커버 슬립이 놓일 네 모서리에 메쉬 크기를 알고 있는 aros chromatography resin을 1 µL씩 도포한 후, 커버 슬립을 덮고 매니큐어로 가장자리를 밀봉합니다. confocal z-stack의 첫 번째 이미지인 organ of Corti 단면에서는 내유모세포, 인접 내유모세포, 외유모세포 및 Deiters 세포가 관찰됩니다. 핵 염색 시, S100 항체 염색을 통해 pillar 세포가 관찰되며 노란색으로 나타납니다. 3 µm 단계로 단면을 가로지르는 z-stack이 진행됨에 따라, 핵의 출현과 소실을 확인하여 pillar 세포의 수를 측정할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 진동 절편기를 이용해 내이를 절편하고, 해당 절편에서 면역조직화학 염색을 수행하며, 공초점 현미경으로 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 모든 항체에 범용적으로 적용 가능한 이 간단한 절차는 와우기관의 세포 조직 구조를 최대한 보존할 수 있게 해줍니다.

vibratome-sectioning-for-enhanced-preservation-cytoarchitecture

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 절차 또는 나선 limbus 및 나선 신경절의 뉴런없이 Corti의 murine 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 electroporation에 의해 Corti explant의 기관에서 외인성 리포터 유전자의 표현 방법을 보여줍니다.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

이 프로토콜은 주동이의 철새 스트림에서 출생 후의 두뇌와 neuroblast 마이 그 레이션의 고해상도 시간 저속 영상에 최적화된 organotypic 슬라이스 분석을 설명합니다.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

우리는 중간 entorhinal 피질 (멕)의 지느러미-복부 축을 유지 뇌 조각의 준비와 electrophysiological 레코딩을위한 절차를 설명합니다. 위치의 신경 인코딩 멕 내에서 지느러미-복부 조직을 따르기 때문에,이 절차는 탐색 및 메모리에 중요한 세포 메커니즘 조사를 용이하게합니다.

설치류 중간 Entorhinal 피질의 지느러미 - 복부 기관의 조사를 위해 Parasagittal 조각의 작성

이 비디오에서는 얇은 절편을 얻기 위해 전체 마우스 신장의 진동 절편을 보여줍니다. 이러한 절편화된 조직 절편은 추가 다운스트림 분석이 있을 때까지 저온에서 보관할 수 있습니다.

전체 쥐 신장의 진동 절편: 쥐 신장의 얇은 절편을 생성하는 기술

이 비디오는 쥐 성기 장기(VNO)의 분리 및 진동 절편을 위한 조직 준비에 대해 간략하게 설명합니다. 섹션은 특정 감각 뉴런 그룹의 생물물리학적, 생리학적 특성을 특성화하는 데 사용됩니다.

Vibratome Sectioning을 위한 Mouse Vomeronasal Organ의 준비

팔일 세 마우스의 신경 망막은 4 % 젤라틴 블록의 상단에있다. 에 vibratome에 의한 광 수용체 층 (200 μm의)의 분리 후, 광 수용체는 문화 기계 및 효소 분해 후 씨앗을 품고있다. 감광체 층은 분자량, 생화학 적 분석 또는 이식에 사용될 수있다.

에 vibratome 단면 마우스 망막 광 수용체의 문화를 준비하는 방법

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

이 문서는 포유류 외피가에서 평평된 접선 섹션을 가져오고 피 질 조직화 학적인 사용 모듈과 immunohistochemical 방법을 시각화 하는 상세한 방법론을 설명 합니다.

병합 된 포유류 외피가 대뇌 피 질의 모듈의 시각화

이 원고는 정상 마우스에서 리본 시냅스의 형태학적 특성 및 기능 상태를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 설명합니다. 본 모델은 또한 소음 유발 및 노화 관련 달팽이관 시냅토병 제한 모델에 적합합니다. 이전 마우스 연구의 상관 결과 또한 논의.

마우스 달팽이관의 특정 주파수 영역에서 리본 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

본 연구에서는, 우리는 코르티의 기관을 포함하는 달팽이관 상피와 전 생체 배양에 의해 손상된 조직을 향해 이동하는 세포를 관찰하는 공초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 방법을 제시한다.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

여기서, 배아의 고정, 면역 염색 및 절편화를 위해 최적화된 단계별 프로토콜이 제공되어 마우스 조직에서 사이토네임(cytonemes)이라고 불리는 특수한 신호전달 필로포디아(filopodia)를 검출한다.

사이토네메 분석을 위한 배아 마우스 조직의 고정

배우세요 Corti 기관의 세포 구조 보존을 위한 vibratome 절단법을. 면역조직화학 및 공초점 현미경을 활용하여 정확한 세포 정량화가 가능한 신경과학 연구 방법입니다.

Vibratome는 Corti의 포유 동물 조직의 Cytoarchitecture의 향상된 보존을위한 Sectioning

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