Vibratome는 Corti의 포유 동물 조직의 Cytoarchitecture의 향상된 보존을위한 Sectioning

다음 실험의 전체적인 목적은 세포 구조를 최대한 보존하면서 코르티 기관(organ of corti)을 이미징하는 것입니다. 이는 해부 및 고정된 내이를 바이브라톰(vibratome)으로 절편화하여, 와우당 절단면의 수를 최소화하면서 두꺼운 절편을 얻음으로써 달성됩니다. 이렇게 얻은 바이브라톰 절편은 면역조직화학 염색을 거치며, 이를 통해 코르티 기관 내의 다양한 세포 유형과 세포 구조를 식별할 수 있습니다.

다음으로, Z-축 위치를 정의하는 고해상도 이미지를 얻기 위해 절편을 마운트하고 공초점 현미경으로 촬영합니다. 각 두꺼운 Vibram 절편을 통해 얻은 결과는 절단 과정에 의한 손상을 최소화하면서 와우 기관(organ of corti) 내의 세포와 구조를 공초점 현미경으로 관찰할 수 있게 합니다. 파라핀 및 동결 절편법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 달팽이관의 물리적 손상을 최소화하여 와우 기관의 세포 구조를 더 잘 보존할 수 있다는 것입니다. 내이를 분리하기 위해, 먼저 면도날을 사용하여 안락사시킨 성체 마우스의 머리를 절단합니다.

정중선을 따라 두개골을 열고 핀셋을 사용하여 조심스럽게 뇌를 제거하여 각 귀를 노출시킨 후, 양측 내이를 떼어냅니다. 내이를 신선한 4% paraformaldehyde가 들어있는 크라이오 튜브 바이알에 담그고, 4°C에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 다음 날, 1x phosphate buffered saline으로 고정액을 세 번 세척하고, 4°C에서 10% EDTA에 5일 동안 배양하여 성체 조직을 탈칼슘화합니다.

내이를 1× PBS로 헹구고 처리 준비가 될 때까지 보관하십시오. agarose를 1× PBS에 넣고 agarose가 완전히 녹을 때까지 전자레인지로 가열하여 4% 저융점 agarose를 만듭니다. 녹은 agarose는 사용 전까지 55 °C 항온수조에 보관하십시오.

포셉을 사용하여 PBS에서 내이를 꺼낸 후, 박리 가능한 임베딩 몰드 바닥에 배치하십시오. 남아 있는 액체는 피펫으로 제거하고, 몰드에 Mol Aros를 채워 내이를 완전히 덮어 코르티 기관의 횡단면을 생성하십시오. 내이의 외측 반고리관이 측면에서 보이도록 배치하십시오.

달팽이관의 가장 후방 영역으로 형성된 선이 의도한 절단면과 45도 각도를 이루도록 내이를 배치합니다. 아가로스(agarose)가 응고되면 플라스틱 몰드를 벗겨냅니다. 면도날을 사용하여 과도한 아가로스를 다듬어 정육면체 형태로 만듭니다.

조직이 충분히 지지될 수 있도록 주변에 적절한 양의 agar를 남겨둡니다. 섹셔닝 단계에서, 순간접착제를 사용하여 agar 큐브의 바닥면을 Vibram 절단 표면에 부착합니다. 40~100 µm 두께로 절편을 만들고, 0.1% Triton X 100이 포함된 1x PBS가 담긴 접시에 절편들을 수집합니다. 이때 핀셋을 사용하십시오.

조직 절편에서 aros를 분리합니다. 입구가 넓은 피펫 팁을 사용하여 절편을 0.1% Triton X 100이 함유된 1배 PBS가 들어있는 접시로 옮기고, 조직 배양 플레이트에서 항체 염색을 진행합니다. 항체 염색이 완료되면 조직 절편을 현미경 슬라이드에 마운팅합니다.

두꺼운 조직 절편이 눌리는 것을 방지하기 위해, 커버슬립과 슬라이드 사이에 공간을 만들 수 있도록 절편 주변에 진공 그리스를 정사각형 모양으로 도포합니다. 조직 절편을 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 커버슬립의 가장자리를 단단히 눌러 밀봉합니다.

또는, 커버 슬립이 놓일 네 모서리에 메쉬 크기를 알고 있는 aros chromatography resin을 1 µL씩 도포한 후, 커버 슬립을 덮고 매니큐어로 가장자리를 밀봉합니다. confocal z-stack의 첫 번째 이미지인 organ of Corti 단면에서는 내유모세포, 인접 내유모세포, 외유모세포 및 Deiters 세포가 관찰됩니다. 핵 염색 시, S100 항체 염색을 통해 pillar 세포가 관찰되며 노란색으로 나타납니다. 3 µm 단계로 단면을 가로지르는 z-stack이 진행됨에 따라, 핵의 출현과 소실을 확인하여 pillar 세포의 수를 측정할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 진동 절편기를 이용해 내이를 절편하고, 해당 절편에서 면역조직화학 염색을 수행하며, 공초점 현미경으로 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 모든 항체에 범용적으로 적용 가능한 이 간단한 절차는 와우기관의 세포 조직 구조를 최대한 보존할 수 있게 해줍니다.