Name: 난소와 Oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 Hydrogels (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 학습하세요 난소와 난관 상피세포를 알긴산 하이드로겔을 이용한 3차원 오르가노이드 배양법으로 유지하는 방법을. 이 기법은 난소암 초기 형성 과정을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 난소암 연구 기금에 의해 지원되었다 [부여 LT/UIC/01.2011] 임상 및 Translational 과학, UIC 암 센터, 보건 부여 C06RR15482 국립 연구소에 대한 UIC 센터. 동물 실험은 UIC의 동물 케어 및 사용위원회의 승인을 동물 관리 프로토콜에 따라 AAALAC에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다. 이 프로젝트에 대해 동물 시카고 일리노이 대학에서 생물 자원 연구소 (BRL)에 장벽 장소에 있습니다. BRL 적어도 두 번 매일 동물을 모니터링하고 동물 보호에 대한 조언을 제공하는 완전히 수의과 직원이 있습니다.

1. 난소 해부와 조직 분리 <ol><li> 나트륨 알지네이트요의 0.5 % (W / V) 솔루션을 준비, 프로토콜의 수정된 버전에서 준비 살균 PBS 37에 열을 ° C.를 사용하여 이전 5 설명 역전이나 락을로 믹스지만, 와동하지 않습니다. 25 G 바늘로 1 ML의 주사기에 알지네이트요를 그려 37에서 유지 ° C. </li><li> crosslinking 조직 캡슐에 알지네이트요 37에 따뜻한 ° C.에 대한 10mM CaCl 2 무균 용액 준비 </li><li> 문화 매체 (αMEM + 5 단위의 페니실린 및 5 μg / ML 스트렙토 마이신) 당 잘 각 실험 24 잘 접시의 1mL를 준비합니다. 문화 매체의 다양한 약물, 펩티드, 또는 바이러스를 포함합니다. 이전 기관의 캡슐에 transfection을 위해, 37 ° C.에서 4 시간 동안 Lipofectamine 2000 및 플라스미드 DNA와 조직을 품어 </li><li> 동물의 장기를 절개하다, 어떤 지방이나 잔여 조직을 제거 부드럽게 난소를 둘러싼 부르사 막 해내, 그리고 오르간을 bisecting × 4 조각으로 난소 또는 수란관 잘라. 동물은 자궁 경부 전위 다음 CO 2 질식에 의해 euthanized되었다. 수란관 들어, 부드럽게 연결 세포막을 분리 당기 및 절단하기 전에 집게를 사용하여 반대 방향으로 튜브의 끝부분을 확장하여 조직을 풀다. </li><li> 멸균 메쉬 섬유에 하나 알지네이트요의 비말을 (~ 1-3 μL) 장소. </li><li> 무균 집게를 사용하여 알지네이트요 비말 및 센터 포셉 또는 멸균 바늘을 사용하여 작은 물방울을 장기로의 조각을 이동합니다. </li><li> 무균 포셉와 메쉬 섬유 쥐고과 중력이 매달려 드롭에 알지네이트요을 강제 수 있도록 거꾸로 그것을 전환하여 장기 조각 (organoid)이있는 비말을 반전. </li><li> 드롭 솔루션으로 떨어지는 있도록 10mM CaCl 2 용액이 들어있는 10cm 페트리 접시의 가장자리에있는 집게를 누릅니다. </li><li> 2 분 동안 품어, 문화 매체에 추가 10mM CaCl 2 및 전송을 공개하기 위해 모공을 포함하는 멸균 스푼으로 제거합니다. 최대 네 개까지 알지네이트요의 젤로가 문화 매체를 포함하는 24 잘 접시의 단일 잘으로 전송할 수 있습니다. 정의된 기간 동안 문화. </li></ol> 2. 세포의 알긴산과 수집 저하 <ol><li> 알지네이트요 젤의 solubilization 들어, ° C 30 분 또는 때까지 젤이 완전히 해소됩니다 37 Leibovitz의 L - 15 미디어에 녹아있는 알지네이트요의 lyase (3.4 MG / ML)의 문화를 품다. </li><li> 알지네이트요의 lyase에서 조직을 제거합니다. </li><li> 오세 수집 1 시간 8 Leibovitz의 L - 15 미디어에서 collagenase 500 단위로 organoid을 품어. 1 분 일초 펄스 (1 초 와동과 일초 나머지) 다음 1 분 중간 전원 이초 펄스 (이초 와동과 이초 휴식)에 소용돌이. 장기 조각이 신선한 불임 microcentrifuge 관에 microcentrifuge 관 및 피펫 뜨는의 하단에 가을 보자. 펠렛의 난소 표면 상피에 3,000 rpm으로 3 분 원심 분리기. </li><li> 투발 상피를 수집, 5 단위 페니실린 및 5 μg / ML의 스트렙토 마이신과 4 % (V / V) FBS과 DMEM의 조직 문화 플라스틱에 길이 튜브를 잘라 놓으십시오. 3~5일 동안 세포는 같은 민족인 기질에서 "크롤링"것이며,​​ 조직 문화 plastic9에서 성장. </li></ol> 3. 파라핀 섹션에 대한 알지네이트요 캡슐 장기 문화의 고정 <ol><li> 선택한 시점에서 배지에서 비드 캡슐 알지네이트요를 수집합니다. </li><li> 2 분 동안 멸균 10mM CaCl 2 용액으로 문화를 놓아 젤 등귀하다하는 알지네이트요을 Recrosslink. </li><li> 젤 고체 유지하고 완벽하게 고정하는 동안 조직을 캡슐 수 있도록 50 MM의 자당, 10 MM CaCl 2 50 MM 나트륨 cacodylate를 포함하는 2 % paraformaldehyde에 알지네이트요 캡슐 오르간을 수정. </li><li> 조직 처리에 따라, 파라핀, 5 μm의 섹션을 생성 마이크로톰과 함께 부분에 전체 알지네이트요 - 캡슐 장기 문화 부분을 포함. </li><li> 알지네이트요는 해산을 기반으로 항원 검색을 열로 인해 immunohistochemistry를 수행하면 슬라이드에서 제거됩니다. 알지네이트요는 남아 hematoxylin 및 eosin의 얼룩 서 아래 eosin에 대한 얼룩 것입니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 난소와 수란관의 3 차원 장기 문화의 예제는 그림 1에 표시됩니다. 난소는 다른 크기의 조각으로 잘라, 그리고 오세은 세포 분열 따위에 의해 번식하고 메스로 절개의 상처를 입었다고 표면을 복구하기 위해 마이 그 레이션 할 수 있습니다. 이 과정에서, 기본 기질에 상대적으로 오세의 올바른 방향은 난소를 캡슐 오세와 함께 유지됩니다. 그림 2에 표시된 구역 또는 eighths을 침범한 난소에 비해, 반으로 난소의 오세 더 완전히 난소를 캡슐. 난소의 상처 수리표면은 전체 난소의 맥락에서 연구 수 있으며, 배란과 표면 수리가 난소 표면 변형을 유도하는 방법에 대해 설명해 주실 수 있습니다. 실험의 종점은 필요한 정보에 따라 달라집니다. 조직 구조, 세포 형태학 및 특정 세포 성장 속도를 쉽게 파라핀 섹션을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 7 일 동안 5 μg / ML 인슐린 이외의 난소 표면 상피와 여러 계층의 형성의 hyperproliferation을 유도하면서 예를 들어, 난소 표면 상피의 단일 계층은 7 일 (그림 3A)에 대한 혈청 무료 αMEM에 culturing 후 관찰 세포 (그림 3B). 이전 고정 10 μm의 24 시간의 최종 농도에서 문화 bromodeoxyuridine를 추가하여, 세포의 증식이 (삽입된 페이지 3A 및 3B) 측정할 수 있습니다. granulosa 세포의 큰 비율 분아 따위에 의해 번식하는 동안 혈청 무료 αMEM 유지 문화, 오세 약 3~5%은 24 시간 라벨 기간 (삽입된 페이지 3A) 동안 증식을 받고있다. 문화 미디어 인슐린 또한 총 오세의 약 30 % (삽입된 페이지 3B)으로 오세를 proliferating의 비율을 증가시킵니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)의 Immunofluorescence은 cDNA transfection (그림 3C) 다음과 같은 표준 현미경으로 알지네이트요 젤을 통해 시각 수 있습니다. 알지네이트요 오르간 문화가 난소 표면 상피 및 기본 머리카락 성장과 분석을 위해 제공하고 있지만, 그것은 성숙, 보조 모공이 문화 시스템 (그림 3D)에 생존하지 않을 것을인지해야합니다. 알지네이트요의 히드로겔 매트릭스 내에서 성숙 개별 모공의 문화가 다른 열 설명되었습니다. 단백질이나 RNA의 변경은 전체 기관 또는 효소 분해 (그림 4)를 사용하여 특정 세포 유형에서 분석할 수 있습니다. 일부 stromal 세포도 (그림 4D) 절연 있지만 collagenase와 교양 난소 organoids의 치료, 펠렛은 다음과 같은 치료를 얻은 세포의 오세의 농축을 허용하는 동시에 (그림 4C) 그대로 기본 기질을 떠납니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 입힐 수있는 총알 후 오세을 전파하기 위해 사용 그림 1. 마우스 난소 입체 문화 시스템. A) 현미경, 부르사 및 주변 지방 패드가 삭제되었습니다. B) 손상 oviductal 튜브와 난소 (O) (T) 및 지방 패드 (F). C) 부르사 지방 패드와 난소가 제거 (왼쪽)와 uncoiled 수란관 (오른쪽). D) 난소 또는 oviductal organoids는 알지네이트요 비말에 배치했다. E) 알긴산 쌌다 organoids은 CaCl 2 용액 crosslinking 젤 형태 알지네이트요로 감소했다. F) 알긴산은 난소 organoid를 캡슐. G) 알긴산은 oviductal의 organoid를 캡슐. H) 알긴산 캡슐 organoids 문화 매체에 incubated. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 표면적 cytokeratin 8 시까지 측정 난소 표면에 의해 생성. eighths, 분기, 그리고 반쪽, BSA 매체에서 교양 및 cytokeratin 8 일 (CK8) 항체를 사용 immunohistochemical 분석하여 측정을 침범한 후에 오세에 의해 난소 organoids의 캡슐. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 알긴산 문화 시스템은 성장 요인의 통과와 오세로 cDNA의 transfection을 허용하지만, 모공의 급속한 성장과 성숙을 지원하지 않습니다. A) 난소 organoid은 오세을 표시 CK8 표현에 대한 분석 기초 매체 7 일 교양. 삽입된 페이지, 시리얼 섹션 BrdU의 설립을 위해 얼룩. B) 문화 미디어에 인슐린의 추가는 오세의 증식을 유도. 삽입된 페이지, 시리얼 섹션 BrdU의 설립을 위해 얼룩. C) 난소 organoid는 GFP를 표현하기 위해 cDNA와 transfected. D) 알긴산 문화 시스템은 원시 모공 (빨간색 화살촉)의 성장을 지원하지만 성숙하지 보조 머리카락 (검은색 화살표). <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 오세은 분석을 다음과 문화 격리 수 있습니다. A) Organoid가 이주하는 매체 교양. B) 캡슐의 organoid는 organoid 그대로두고 알지네이트요의 lyase와 함께 처리됩니다. 난소는 마르크 오세에 CK8 물들일 것입니다. C) Organoid는 근본적인 기질과는 별도로 오세하는 collagenase로 처리됩니다. 남은 조직의 일부가 난소 표면의 제거를 강조 CK8 물들일했다. CK8 (적색)에 대한 스테인드로 D) 치료를 다음과 수집된 세포 오세에 대한 풍부합니다. 세포는 핵을 표시 DAPI로 counterstained 있습니다.

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알지네이트요의 hydrogels를 이용한 3 차원 오르간 문화 시스템의 개발은 생물의 다양한에서 여러 가지 조직 유형을 분석하는 다양한 방법을 나타냅니다. 그것이 세포가 11 성장할 수있는 발판을 제공과 같은 3D 문화의 사용은 조직 공학 및 재생 의학 분야로 확장될 수 있습니다. 현재, 저희 연구실은 인간의 난소와 나팔관 조직을 사용하여 초기 연구를 겪고 있지만, 인간이 아닌 인간 영장류 머리카락 문화 12,13 설명했습니다. 문화 organoids에 알지네이트요의 hydrogels의 사용은 이러한 통합 콜라겐, 섬유소, 또는 hyaluronic 산성 등 hydrogels 다른 유형의 여러 장점을 제공합니다. 젤 organoid 14 캡슐로 실내 온도와 중성 산도에서 알긴산의 젤은 조직에 약간의 장애가 제공합니다. 알긴산은 조직의 성장 5 화학적으로 불활성 지원을 제공, 휴대 단백질과 반응하지 않...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> Leibovitz L - 15 배지 </td><td> Gibco </td><td> 11,415 </td><td></td></tr><tr><td> αMEM 매체 </td><td> Gibco </td><td> 12000-022 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 알지네이트요 </td><td> Novamatrix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 cacodylate </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> C0250 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 프로필렌 메쉬 섬유 </td><td> 맥매스터 카 </td><td></td><td> 45 &quot;와이드 롤, 0.0041&quot;오프닝 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11,668 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> 알긴산의 lyase </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> A1603 </td><td></td></tr><tr><td> A1603 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> C9697 </td><td> 클로 스트 리듐 histolyticum에서 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 103700 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco </td><td> Gibco </td><td></td></tr><tr><td> ITS 솔루션 </td><td> 로체 </td><td> 11074547001 </td><td> 인슐린 / 트랜스페린 / 나트륨 selenite </td></tr><tr><td> Cytokeratin 8 항체 </td><td> 발달 연구 브리 도마 뱅크 </td><td> TROMA - 1 </td><td> 1:200에​​서 사용 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> 벡터 실험실 </td><td> H1200 </td><td></td></tr><tr><td> Bromodeoxyuridine </td><td> 시그마 </td><td> B50002 - 1G </td><td> 최종 농도 10 μm의 </td></tr></tbody></table>

난소와 oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 hydrogels

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

난소암은 여성 암 사망의 다섯 번째 주요 원인이며, 미국 1 63% 사망률이 있습니다. 난소 암에 대한 원산지 세포 유형은 문제가 여전히하거나, 난소 표면 상피 (오세) 또는 나팔관의 fimbriae 2,3의 말초 상피 수 있습니다. 체외의 기본 문화로 정상 세포 Culturing 과학자함으로써 definitively 원산지의 세포 유형을 결정, 뚜렷한 상피에서 난소암으로 이어질 수도 있습니다 특정 변경 내용을 모델로 사용됩니다. 이것은이 질병을 대상으로보다 정확한 생체, 조직 특정 유전자의 변화와 동물 모델, 그리고 더 나은 예방 전략의 개발을하실 수 있습니다. 알지네이트요의 hydrogels에서 정상 세포를 유지하는 것은 자신의 입체적인 맥락에서 세포의 체외 배양에 단기을 촉진하고 플라스미드 DNA, siRNA, 작은 분자의 도입을 수 있습니다. 하나의 동물에서 실험의 수를 증가 하나 장기 생성하실 수 있습니다 메스, 여러 문화를 사용하는 전략 상처에서 파생됩니다 조각 culturing 기관에 의해. 이것은 난소암의 형성과 관련된 오세의 확산에 선도적인 배란의 모델 측면을 인하. 이러한 플라스틱 표면에 잘 성장하지 않는 오세으로 셀 형식은이 방법을 사용하여 교양과 정상 세포의 프로세스 또는 암 형성 4에서 가장 오래된 행사로 조사를 용이하게하실 수 있습니다. 알긴산의 hydrogels는 조직 5 다양한 종류의 성장을 지원하기 위해 사용할 수 있습니다. 알긴산은 손상 조직 6,7하지 않는 부드러운 겔화 작업의 결과, β - D - mannuronic의 산성과 칼슘 이온과 가교 수있는 α - L - guluronic 수 소산의 단위를 반복 구성된 선형 다당류이다. 같은 Matrigel 같은 다른 세 차원 세포 배양 매트릭스와 마찬가지로 알지네이트요 티슈에 대한 기계적 지원을 제공하지만, 단백질은 알지네이트요 매트릭스와 반응하지 않습니다, 따라서 세포가 5 신호 시작하지 않는 합성 세포외 기질로 알지네이트요 기능. 알지네이트요의 히드로겔 표준 세포 배양 매체 수레와 체외에서 조직 성장의 아키텍처를 지원합니다. 방법을 준비, 분리, 최대 2 주가에 대한 문화의 유지 수 알지네이트요의 hydrogels로 난소 및 oviductal 오르간 작품의 포함을 위해 제공됩니다. 장기 문화 단백질과 RNA 샘플의 분석을 위해 세포의 효소 출시도 설명합니다. 마지막으로, 기본 세포 유형의 성장은 생쥐에서 유전자 불멸화없이 가능하며 한방과 유전자 변형 마우스를 사용하는 수사관을 수 있습니다.

그들의 입체적인 맥락에서 정상 세포의 문화 세포 변형 및 tumorigenesis에 필요한 초기 이벤트를 연구하는 다른 방법을 나타냅니다. 이 방법은 난소암 형성 초기에 이벤트를 연구 정상 난소와 oviductal 세포를 성장하는 데 사용됩니다.

난소와 Oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 Hydrogels

난소암은 여성 암 사망 원인 중 5위를 차지하며, 미국 내 사망률은 63%에 달합니다1. ...의 기원 세포 유형은

이 절차는 정상 난소 및 oviduct 상피 세포를 3차원 장기 배양으로 증식시키는 방법을 설명합니다. 먼저, 마우스에서 난소, UCT 지방 패드 및 자궁 일부를 적출합니다. 그다음 bursa를 제거하고 핀셋으로 oviduct 막을 분리한 후, 각 난소 또는 UCT를 오가노이드라고 불리는 2~4개의 조각으로 자릅니다.마지막으로 메쉬 섬유 조각 위의 알지네이트 액적 내에 오가노이드를 캡슐화합니다. 정의된 배지에서 배양된 OSC와 TEC는 고유의 3차원 구조 내에서 정상적인 세포 특성을 유지합니다. 조직 절편에 대한 면역조직화학 염색, RNA 분석 및 단백질 분석을 통해 난소암에서 OSC와 TEC의 영향에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.전통적인 2차원 불멸화 세포 배양과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 세포 경로를 변경할 수 있는 유전적 불멸화 과정 없이 하부의 세포외 기질 및 기질 세포와 접촉한 상태로 세포를 배양할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 암 형성의 초기 사건을 정의하고 장액성 난소암이 어떤 세포 유형에서 발생하는지를 결정하는 것과 같이, 난소암 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 난소암에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 난소 여포 배양 및 췌장 베타 세포 섬 배양과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 난소와 UCT에 손상을 주지 않고 bursa 및 uc 막을 제거하는 것이 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저, 멸균 PBS에 alginate를 0.5% 용액으로 조제한 후, 전도 혼합 또는 rocking 방식으로 섞으며 37 °C로 가열합니다. 그런 다음 25 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기에 alginate를 흡입하고 37 °C를 유지합니다.다음으로, 조직 캡슐화 시 알긴산을 가교시키기 위한 10 millimolar 염화칼슘 용액을 준비하여 37 degree Celsius로 데웁니다. 또한, 24 well plate의 웰당 1 milliliter의 배양액을 준비하며, 각 실험에 따라 배양액에 다양한 약물, 펩타이드 또는 바이러스를 포함시킵니다. 동물로부터 장기를 적출할 때, 지방이나 잔여 조직을 모두 제거합니다.난소를 둘러싸고 있는 burs 막을 조심스럽게 벗겨내고, 기관을 이등분하여 난소 또는 UCT를 네 조각으로 절단함으로써 수란관 조직을 조심스럽게 풉니다. 핀셋을 사용하여 연결된 막을 떼어내고 튜브의 양 끝을 서로 반대 방향으로 늘립니다.절단 전, 멸균된 메쉬 섬유 위에 약 2 µL의 알지네이트 방울 하나를 떨어뜨립니다. 멸균 핀셋을 사용하여 오가노이드 조각을 알지네이트 방울 안으로 옮기고, 방울의 중심을 잡아 오가노이드가 포함된 방울을 뒤집습니다. 메쉬 섬유를 뒤집어 중력에 의해 알지네이트가 10 mM 염화칼슘 용액이 담긴 10 cm 페트리 접시 가장자리에 매달린 방울 형태로 떨어지게 합니다.포셉을 가볍게 두드려 방울이 용액 속으로 떨어지게 합니다. 2분 동안 배양합니다. 구멍이 있는 멸균 스푼으로 꺼내어 과잉의 10 mM 염화칼슘을 제거하고, 정해진 시간 동안 배양 배지로 옮겨 배양합니다.알긴산 겔을 가용화하려면, Ovitz L15 배지에 3.4 mg/mL 농도로 용해된 Alginate lyase 내에서 배양물을 37 °C로 30분 동안 또는 겔이 완전히 용해될 때까지 배양하십시오.그다음 알긴산 라이아제(alginate lyase)에서 조직을 제거합니다. 이제 OSE를 수집하기 위해, Ovitz ISS L 15 배지가 포함된 500 units의 콜라게나제(collagenase)와 함께 오가노이드를 1시간 동안 배양합니다. 중간 세기로 2초 간격의 펄스 보텍싱(vortex)을 1분간 수행한 후, 1초간 추가로 수행합니다.1분 동안 펄스 작동시킵니다. 기관 조각들이 마이크로 원심분리 튜브 바닥에 가라앉도록 둔 후, 상층액을 새 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 피펫으로 옮겨 3000 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 난소 표면 상피를 펠렛화합니다. 마지막으로, 난관 상피를 수집하기 위해 튜브를 세로로 자른 후 조직 배양용 플라스틱 위에 올려두고 3~5일간 배양합니다.세포는 튜불 스트로마(tubular stroma) 밖으로 나와 조직 배양 플라스틱 위에서 성장할 것입니다. 정해진 시간점에 배양액에서 알긴산 캡슐화 비드를 수집하십시오. 배양물을 10 millimolar 염화칼슘 용액(sterile calcium chloride solution)에 2분 동안 떨어뜨려 알긴산을 가교함으로써 겔을 단단하게 만드십시오.이제 알긴산으로 캡슐화된 장기를 고정하며, 고정 과정 동안 겔이 고체 상태를 유지하고 조직을 완전히 캡슐화하고 있는지 확인하십시오. OSC와 같이 플라스틱 표면에서 잘 자라지 않는 세포 유형을 배양할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 정상적인 세포 과정 또는 암 형성의 초기 단계에 대한 연구를 촉진하십시오.현미경 하에서 법제낭과 주변 지방 패드를 제거한 후, 이를 처리하여 알긴산 캡슐화 오가노이드를 배양액에서 배양하였습니다. OSC는 메스로 절개하여 손상된 표면을 시간과 거리의 함수에 따라 회복시켰습니다.cytokeratin eight 항체를 이용한 면역조직화학 분석 결과, 난소를 반으로 절단했을 때 4등분 또는 8등분으로 절단한 경우보다 난소를 더 완전하게 캡슐화하는 것으로 나타났습니다. 조직 구조, 세포 형태 및 특정 세포 성장률은 파라핀 절편을 통해 쉽게 모니터링할 수 있습니다. 예를 들어, 무혈청 MEM에서 7일 동안 배양한 후 난소 표면 상피의 단일 층이 관찰됩니다.5 µg/mL의 인슐린을 7일 동안 첨가하면 난소 표면 상피의 과증식과 다층 세포 형성이 유도됩니다. 여기서는 cDNA 형질전환 후 표준 현미경을 통해 알긴산 겔 내부의 녹색 형광 단백질 면역형광을 시각화하였습니다. 알긴산 기관 배양은 난소 표면 상피와 일차 난포의 성장 및 분석을 가능하게 하지만, 성숙한 이차 난포는 이 배양 시스템에서 생존하지 못한다는 점에 유의해야 합니다.단백질 또는 RNA의 변화는 효소 분해를 이용하여 전체 기관 또는 특정 세포 유형으로부터 분석할 수 있습니다. 배양된 난소 오가노이드를 collagenase로 처리하면 하부의 기질은 온전하게 유지되는 동시에, 처리 후 얻은 세포 펠릿에서 난소 표면 상피를 농축할 수 있습니다. 이 기술은 적절하게 수행될 경우 1~2시간 이내에 완료될 수 있습니다.이 절차를 수행하는 동안 항상 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 세포 형태와 조직 구조가 초기 변형 사건에 어떻게 기여하는지와 같은 추가 질문을 해결하기 위해 면역조직화학, 웨스턴 블로팅 및 전사 어레이와 같은 추가 방법을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 난소 및 난관 3차원 알지네이트 배양을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

3D 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크에 난소 대과의 캡슐에 대한 새로운 방법을 설명합니다. 이 시스템은 성숙 oocytes을 만들어 미숙 모공의 개발을 지원하기 위해 proteolytic 저하로 구조적 지원을 결합한 제품입니다. 이 방법은 확장을 제한하지 않고 세포 세포 접촉을 유지하기 위해 문화 셀 집계에 적용될 수 있습니다.

Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

이 동영상은 3D 배양을 확립하기 위해 돼지 적운-난모세포 복합체(COC)를 피브린-알긴산 비드에 캡슐화하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 체외 성숙 시스템은 정상적인 세포 간 통신을 유지하여 난모세포 성숙을 보장하고 생존력을 유지합니다.

돼지 COC의 3D 배양: 피브린-알긴산 고분자 하이드로겔 비드에서 적운 난모세포 복합체를 캡슐화하는 절차

이 프로토콜은 신생아 마우스와 사춘기 쥐에서 개별 난소에서 난소를 사용하여, 마우스 난소 조직의 주요 문화 / 공동 문화를 설명합니다. 배양 기술은 난소에 외인성 제제의 효과의 조사를 가능하게하여 생리 고도로 개발을 지원하고, 난포 사이의 상호 작용.

문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

여기 우리는 그대로 마우스 난소에서 수동 선명도 난소 맥 관 구조 및 follicular 모세 혈관의 시각화를 위한 3D 재구성 방법의 적응을 제시.

수동 선명도 삭제 마우스 난소의 혈관 구조의 3 차원 재구성

여기에 제시 된 3D 문화 조건에서 돼지 난모세포의 캡슐화를위한 두 가지 프로토콜이 있습니다. 첫 번째, 적수-oocyte 복합체 (COC) 피브린-알자네이트 구슬에 캡슐화 된다. 두 번째, 그들은 불소 에틸렌 프로필렌 분말 입자로 동봉되어 (미생물 반응기). 두 시스템 모두 최적의 조건을 통해 3D 조직을 유지관리합니다.

포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기

이 프로토콜은 유전자 발현 및 조직학적 분석을 위한 마우스 자궁내막 상피 오가노이드를 확립하는 방법론을 설명합니다.

마우스 자궁에서 3D 자궁 내막 오가노이드 확립

이 프로토콜은 일차 인간 난소 표면 상피(hOSE) 세포에서 3차원(3D) 조직 오가노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에는 갓 채취한 난소에서 hOSE 분리, hOSE의 세포 확장, 동결 보존-해동 절차 및 오가노이드 유도가 포함됩니다. 면역형광(Immunofluorescence), 정량 분석(quantitative analysis) 및 스크리닝 플랫폼으로서의 유용성 입증(showcasing utility as a screening platform)이 포함되어 있습니다.

조직 재생을 연구하기 위한 플랫폼으로서의 인간 난소 표면 상피 오가노이드

이 프로토콜은 티라민 결합 히알루로난 하이드로겔을 사용하여 마우스 난소에서 전방의 여포를 캡슐화하고 배양하는 새로운 3차원(3-D) 배양 모델을 설명합니다. 또한 유리화(vitrification)에 의한 난소 여포 동결 보존에 대한 두 가지 접근 방식에 대해서도 자세히 설명합니다.

3차원 난포 배양을 위한 새로운 히알루로난 하이드로겔의 응용 및 마우스 난포 동결 보존을 위한 방법론

우리는 시험관 내 배우자 형성을 보완하는 새로운 스캐폴드가 없는 아가로스 곰팡이에서 난소 난포를 배양하는 방법을 설명합니다.

스캐폴드 프리 마우스 난소 난포 배양을 위한 맞춤형 아가로스 몰드의 생산 및 사용

우리는 기질이 풍부한 난소 분획에서 마우스 난소 체세포를 분리하고, 스캐폴드 없는 접근법을 사용하여 마우스 난소 체세포 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

난소 미세환경 탐구: 마우스 난소 체세포의 분리, 2D 배양 및 오가노이드 배양 방법

학습하세요 난소와 난관 상피세포를 알긴산 하이드로겔을 이용한 3차원 오르가노이드 배양법으로 유지하는 방법을. 이 기법은 난소암 초기 형성 과정을 연구하는 데 활용됩니다.

난소와 Oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 Hydrogels

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