세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

이 절차의 전반적인 목표는 두꺼운 뇌 절편 내에서 형광 뉴런을 보다 쉽게 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 에어로스 플러그 홀더에 뇌를 내장함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 뇌를 압축된 책의 두꺼운 조각으로 절단하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 글리세롤 구배에서 뇌 조각을 광학적으로 제거하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 형광 이미징을 위해 제거된 뇌 절편을 슬라이드에 장착하는 것입니다. 궁극적으로, epi 형광 또는 컨포칼 현미경을 통해 두꺼운 뇌 절편 내의 뉴런에서 고해상도 형광 단백질 리포터 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

얇은 부분, 연속 형광 현미경 또는 다중 광자 이미징과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 훨씬 더 빠르고 노동 집약적이며 비싸거나 정교한 현미경 기술이 필요하지 않다는 것입니다. 먼저 심장 관류에 의한 NC 2 고정을 받고 섭씨 4도에서 1-2시간 동안 접미사된 쥐의 뇌 조직을 회수합니다. 다음으로, PBS에 2% 고강도 저겔 포인트 농업 용액을 만들고 전자레인지에서 용해될 때까지 가열합니다.

용융된 아그로스를 시험관으로 옮기고 섭씨 40도의 열 블록을 놓아 온도를 평형화하는 동안 아그로스 평형체는 고정된 뇌 조직을 표본 주사기의 플런저에 붙입니다. Sano Aate를 사용하여 장착된 조직을 포화 자당 PBS 용액에 접착제를 담그고 뇌 표면을 코팅한 다음 플런저를 플런저 하우징으로 끌어내립니다. 따뜻한 아로를 플런저에 피펫으로 넣어 기포가 유입되지 않도록 하면서 뇌 조직을 완전히 덮습니다.

마지막으로 약 1분 동안 차가운 냉각 블록으로 표본 주사기를 고정합니다. aros를 설정하려면 내장된 뇌 조직이 들어 있는 표본 주사기를 압축 집에 조립합니다. 블레이드의 가장자리를 시편 주사기의 배출구와 밀접하게 정렬한 다음 버퍼 탱크에 PBS를 채웁니다.

마이크로미터를 회전합니다. 일단 두께를 앞으로 잘라 표본 주사기에서 내장된 뇌 조직을 밀어냅니다. 첫 번째 슬라이스를 생성하려면 제어 장치의 시작 버튼을 누릅니다.

삽입된 조직을 전진시키고 시작 버튼을 누르는 과정을 반복하여 원하는 수의 슬라이스를 생성합니다. 전사 피펫으로 슬라이스를 모아 PBS 피펫으로 채워진 유리 흡입 바이알에 옮기고, 수집된 슬라이스에서 대부분의 PBS를 제거하고 PBS 용액에 10% 글리세롤로 교체합니다. 섭씨 4도의 온도에서 탁자 위에 올려 놓은 셰이커에 올려 조각이 가라앉을 때까지 바이알을 부드럽게 흔듭니다.

25, 50 및 75%글리세롤 용액으로 디캔팅 및 리필 과정을 반복하여 점차적인 세척을 계속합니다. 75% 글리세롤 용액을 피펫으로 제거하고 90% 글리세롤로 교체합니다. 거품이 생기지 않도록 주의하고 섭씨 4도에서 부드러운 흔들림으로 평형을 이룹니다.

이제 슬라이스가 최대로 제거되었으므로 더 이상 가라앉지 않고 대신 중성 부력을 표시합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 양면 접착제를 25 x 75mm 현미경 슬라이드의 가시 영역에 맞게 2-3mm 테두리가 있는 열린 직사각형으로 자릅니다. 슬라이드의 테두리 안에 뇌 조각을 정렬합니다.

접착 테이프 위에 커버 유리를 부드럽게 내립니다. 기포가 유입되지 않도록 주의하고 밀봉을 만들기 위해 압력을 가하고 과도한 글리세롤을 흡입한 다음 투명 매니큐어를 바르고 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 씰이 건조되면 슬라이드를 섭씨 4도의 슬라이드 상자에 보관하거나 이미지화할 수 있습니다.

즉시 epi 형광 현미경을 사용하여 사용하십시오. 향상된 GFP를 발현하는 바이러스 벡터의 발현 패턴은 쥐 뇌 조직의 200마이크로미터 두께의 관상 절편에서 볼 수 있습니다. 여기서, epi 형광 이미지의 강조 표시된 영역은 컨포칼 현미경을 사용하여 고해상도로 표시되어 개별 5개의 피질 뉴런을 드러냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 빠르고 고해상도 형광 이미징을 위해 고정된 뇌 절편에서 두꺼운 뇌 절편을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.