세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

본 절차의 전반적인 목표는 두꺼운 뇌 절편 내의 형광 뉴런을 더 쉽게 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 뇌를 aeros 플러그 홀더에 매립함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 압축 톰(compressed tome)에서 뇌를 두꺼운 절편으로 만드는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 글리세롤 구배(glycerol gradient)를 이용해 뇌 절편을 광학적으로 투명화하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 투명화된 뇌 절편을 형광 이미징을 위해 슬라이드에 마운팅하는 것입니다. 최종적으로, 에피 형광 현미경(epi fluorescent microscopy) 또는 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통해 두꺼운 뇌 절편 내 뉴런에서 고해상도의 형광 단백질 리포터 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

박편 제작, 연속 형광 현미경 검사 또는 다광자 이미징과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 훨씬 더 신속하고 노동력이 적게 들며, 고가의 정교한 현미경 기술이 필요하지 않다는 점입니다. 우선, 심장 관류를 통해 NC two 고정을 거치고 4 °C에서 1~2시간 동안 후고정된 마우스 뇌 조직을 준비합니다. 다음으로, PBS에 2% 고강도 저젤점 agarose 용액을 만들고 마이크로파 가열기에서 완전히 녹을 때까지 가열합니다.

녹은 agros를 시험관으로 옮기고 40 °C 가열 블록에 넣어 온도를 맞춥니다. agros의 온도가 안정되는 동안 고정된 뇌 조직을 검체 시린지(specimen syringe)의 플런저에 접착제로 고정합니다. Sano Aate 접착제를 사용하여 고정된 조직을 포화 설탕 PBS 용액에 담가 뇌 표면을 코팅한 다음, 플런저를 하우징 안으로 내립니다. 따뜻한 aros를 플런저에 피펫으로 분주하여 기포가 생기지 않도록 주의하며 뇌 조직을 완전히 덮어줍니다.

마지막으로, 시료 시린지를 콜드 칠링 블록으로 약 1분 동안 고정합니다. aros를 설정하려면, 뇌 조직이 임베딩된 시료 시린지를 압축 홈(compressed home)에 조립합니다. 칼날의 끝부분을 시료 시린지의 배출구에 가깝게 맞춘 다음, 완충액 탱크를 PBS로 채웁니다.

마이크로미터를 회전시키십시오. 내장된 뇌 조직이 시료 주사기 밖으로 밀려 나올 때까지 슬라이스 두께 방향으로 앞으로 돌립니다. 첫 번째 슬라이스를 생성하려면 제어 장치의 시작 버튼을 누르십시오.

매립된 조직을 전진시키고 시작 버튼을 누르는 과정을 반복하여 원하는 수의 절편을 생성합니다. 전송 피펫으로 절편을 수집하여 PBS가 채워진 유리 흡입 바이알로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 수집된 절편에서 PBS의 대부분을 제거하고, 이를 PBS 내 10% glycerol 용액으로 교체합니다. 절편이 가라앉을 때까지 4 °C의 탁상용 회전 쉐이커에서 바이알을 부드럽게 흔들어 줍니다.

25%, 50%, 그리고 75% 글리세롤 용액으로 데캔팅과 리필 과정을 반복하여 점진적인 투명화 작업을 계속합니다. 75% 글리세롤 용액을 피펫으로 제거하고 90% 글리세롤로 교체합니다. 기포가 유입되지 않도록 주의하며, 가볍게 흔들어 4°C에서 평형을 맞춥니다.

슬라이스들이 최대한 투명해졌으므로 더 이상 가라앉지 않고 중성 부력을 나타내게 됩니다. 핀셋을 사용하여 25 x 75 mm 현미경 슬라이드의 가시 영역에 맞도록 양면 접착제를 2~3 mm 테두리가 있는 열린 직사각형 모양으로 자릅니다. 슬라이드 위 테두리 내부에 뇌 슬라이스들을 배치합니다.

커버 글라스를 접착 테이프 위에 조심스럽게 내립니다. 기포가 들어가지 않도록 주의하고 압력을 가해 밀봉한 후, 과량의 glycerol을 흡입하여 제거하고 커버 슬립의 가장자리에 투명 매니큐어를 발라 밀봉합니다. 밀봉된 부분이 마르면, 슬라이드를 4°C의 슬라이드 보관함에 저장하거나 이미징할 수 있습니다.

즉시 에피 형광 현미경을 사용하여 관찰합니다. enhanced GFP를 발현하는 바이러스 벡터의 발현 패턴을 200 µm 두께의 마우스 뇌 조직 관상면 절편에서 확인할 수 있습니다. 여기서 에피 형광 이미지의 강조된 영역을 공초점 현미경을 통해 고해상도로 보여줌으로써 개별 5층 피질 뉴런을 나타냅니다.

이 영상을 시청하신 후에는, 신속하고 고해상도의 형광 이미징을 위해 고정된 두꺼운 뇌 절편을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.